蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研 究 摘要：运用多重实时 PCR 对多 地的养殖和野生蛙类携带虹彩病毒的本 底展开调查，并进行病毒分型。结果表 明，检测的样品平均阳性率为 8.90%， 养殖蛙的平均阳性率为 4.57%，野生蛙 的平均阳性率为 16.82%。从蛙种类来 看，养殖牛蛙和黑斑蛙带毒率较低，而 养殖的棘胸蛙和野外捕捉的斑腿树蛙带 毒率较高。不同蛙携带的蛙病毒的分子 序列比较结果显示，不同来源的蛙病毒 高度保守，缺乏明显的宿主与地域特异 性，表明人工繁育场暴发虹彩病毒可能 对其他野生蛙类资源产生了负面影响， 建议在野生动物人工驯养繁殖体系中引 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 入病害监测和疫病防控措施。 中国论文网 /8/view-12946610.htm 关键词：蛙；虹彩病毒；多重实 时 PCR；流行病学 中图分类号：Q959.5+3 文献标 识码：A 文章编号： 0439- 8114（2017）09-1702-04 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2017.09.025 Study on Molecular Epidemiology of Iridoviruses in Rana SHAO Jun-hui1，ZHANG Li- feng2， WANG Shu-yun2，LI Cong1，LUO Yang-zhi1，CHEN Xiao- xuan1，YUAN Jun-fa1 （1. College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China；2. Inspection and Quarantine Technical Center of Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Beijing 100026， China） -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 Abstract： The multiplex real- time PCR assay was used to investigate the prevalence of iridoviruses in farmed or wild frog. Results indicated that the average positive rate was 8.90%，in which the average positive rate in farmed and wild frog was 4.57% and 16.82%，respectively. The most significant prevalence of iridoviruses was found among the farmed Quasipaa spinosa and Polypedates megacephalus，while the species of Rana catesbeiana and Rana nigromaculata rarely. Sequences alignement of major capsid protein suggested that there were no obvious host and geographic specificity among these detected Rana iridoviruses，it indicated that the outburst of iridoviruses in farm produced negative effects on wild frogs， disease monitoring，disease prevention and control measures were proposed to introduce into the artificial -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 domestication propagation system of wild animal. Key words： Rana； iridoviruses； multiplex real-time PCR； epidemiology 近 50 年恚 全球范围内多种 两栖动物种群显著衰退，一些种类已经 灭绝，部分物种濒危，原因包括气候变 化、栖息地减少、环境污染以及疾病传 播等1 ，2 。其中蛙壶菌 （Batrachochytrium dendrobatidis）和虹 彩病毒（Iridoviruses ）是引起两栖类种 群数量下降的主要病原因素3-5。中国 部分蛙种的资源量也因环境变化以及人 为捕捉等因素急剧减少。如虎纹蛙 （Hoplobatrachus ruguosus） 、林蛙 （Rana dybowskii） 、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）等种类因肉味鲜美、营养丰富 遭到过度捕捉，导致这些蛙类野生资源 量急剧减少6，7 。近年来，为保护自 然资源及满足市场需求，人们开展了多 个蛙种的驯养及人工增养殖8-10。但 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 人工增养殖的模式对野生蛙类资源以及 当地自然生态环境的影响缺乏系统的评 估，尤其是人工增养殖中虹彩病毒病的 暴发对野生资源的影响缺乏深入研究。 虹彩病毒无囊膜，对环境适应力 较强，可在土壤和水体中存活长达几个 月而保持感染性11 。为适应蛙的特殊 生活习性，养殖场多位于较偏僻的山林 地区，与周边环境存在许多交互作用。 当蛙养殖场暴发虹彩病毒病后，养殖用 水的不规范处理、蛙的逃逸以及带毒蛙 的商业流动等对当地野生蛙类资源的影 响亟需评估。先前，湖北省宜昌市某养 殖场发生棘胸蛙的暴发性死亡，经鉴定 为蛙病毒的感染所致12 ，但其病毒来 源以及蛙携带病毒的本底等基础问题尚 未知。为此，本研究利用建立的蛙病毒 多重检测方法13 ，对不同来源的养殖 和野生蛙类携带虹彩病毒进行初步调查， 并进行病毒分型研究，以期为优化人工 增养殖的蛙类资源保护模式提供参考。 1 材料与方法 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 1.1 样品采集 样品详细采样情况见表 1。采集 的蛙经麻醉后取脾或肾用于后续的检测。 1.2 样品 DNA 提取与筛查 组织 DNA 的提取采用康为世纪 通用型柱式基因组提取试剂盒，取不超 过 0.1 g 组织，按试剂盒说明书进行， 组织 DNA 以 50 L 的三蒸馏水洗脱， - 20 保存。 以优化的三重荧光 PCR 方法筛 查13。优化的三重荧光 PCR 反应体系 （25 L）如下： 5 L DNA 模板， 10recreation buffer 2.5 L，25 mmol/L MgCl2 3 L，10 mmol/L dNTP 0.5 L， 通用正向引物（20 mol/L）1 L，通用 反向引物（20 mol/L） 1 L，探针 1（20 mol/L）0.5 L，探针 2（20 mol/L）0.5 L，探针 3（20 mol/L） 0.5 L，Taq DNA 聚合酶（ 5 U/L）0.5 L，用去离子水补足至总体积 25 L。 采用 Roche Light Cycler 480荧光 PCR -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 检测仪：第一阶段：95 3 min；第二 阶段：95 15 s，54 15 s， 60 30 s，40 个循环；60 延伸时收集荧光。 扩增结果以在相应的检测通道呈典型的 “S”型扩增曲线及 Ct 值判定。 1.3 基因扩增与克隆 以蛙病毒保守引物 RGVP1/P2（5-GACTTGGC CACTTATGAC-3/5- GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3） U 增“1.2”中准备的部分样品 DNA，扩增 循环条件为 95 30 s，50 45 s，72 30 s，35 个循环，预期扩增片段为 531 bp，预期目的条带经胶回收后直接 测序验证。 以 NCBI 登陆的蛙病毒主要结构 蛋白（major capsid protein，MCP）序 列设计引物 MCPF1/R1（5- ATGTCTTCTGTAACCGGTTCAG- 3/5-TTACAAGA -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 TTGGGAATCCCATCG-3 ） ，用 于扩增蛙病毒的 MCP 全长，扩增循环 条件为 95 30 s，50 45 s，72 90 s，30 个循环，预期扩增片段为 1 392 bp。扩增产物经胶回收后连接至 T-easy 载体，每个基因选择 3 个阳性克隆子测 序。 1.4 序列分析 以 DNAstar 进行常规的序列拼接 与编辑，序列比对以 Clustal 2.0 软件进 行，聚类分析以 MEGA 6.0 进行，以邻 接法构建进化树，选择成对缺失模式， 以 bootstrip 值进行验证，进化树以 Treeview 进行编辑。 2 结果与分析 2.1 样品筛查结果 先前建立的三重荧光定量 PCR 可检测不同种类的蛙病毒，其中探针 1 可检测包含蛙病毒 3 型（Frog virus 3，FV3） 、饰纹汀蛙虹彩病毒（Bohel iridovirus，BIV） 、流行性造血器官坏死 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 症病毒（Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus，EHNV） 、欧洲t 鱼病 毒（European catfish iridovirus，ECV） 、 欧鲶病毒（European sheetfish iridovirus，ESV） 、中华鳖虹彩病毒 （Soft-shelled Turtle iridovirus，STIV） 、 大鲵虹彩病毒（Andrias davidiamus iridovirus，ADIV ） 、沼泽绿牛蛙虹彩病 毒（Rana grylio virus，RGV） 、虎纹蛙 病毒（Tiger frog virus，TFV）等的蛙病 毒，探针 2 可检测大口黑鲈虹彩病毒 （Largemouth bass ranavirus，LMBV） 、 裂唇鱼病毒（Doctor fish virus，DFV ） 和孔雀鱼病毒（Guppyfish iridovirus，GV6） ，探针 3 可检测新加 坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）13 。样品筛查结果 （表 2）显示，探针 1 检测的阳性率为 8.90%，从养殖的 219 份蛙样品中检出 10 份阳性，平均 Ct 值为 26.45，最小 Ct 值为 20.03。从野外捕捉的 107 份蛙 样品中检出 19 份阳性，平均 Ct 值为 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 28.18，最小 Ct 值为 22.97。从蛙种类来 看，牛蛙和黑斑蛙带毒率较低，而野外 捕捉的斑腿树蛙带毒率较高。探针 2 和 3 均未检出阳性。 2.2 不同来源蛙携带病毒的比较 因探针 1 可检测多种蛙病毒，为 确定检测到的蛙病毒属于哪一种，进一 步以蛙病毒 MCP 保守引物进行扩增， 扩增片段为 531 bp，并进行测序。Blast 比对结果（图 1）显示，获得的 MCP 部分序列高度保守，同 Rana grylio virus 9807 高度保守，仅养殖来源的棘胸蛙 （QSV46）同其他序列相差一个碱基， 并导致一个氨基酸的差异。 为比较上述不同来源的蛙病毒的 差异，设计引物扩增养殖的棘胸蛙来源 （QSV46）与斑腿树蛙（PMV69 ）携带 病毒的 MCP 全长。如图 1 所示， QSV46 和 PMV69 的核苷酸序列仅相差 4 个碱基，并导致 4 个氨基酸的差异。 同蛙病毒属的代表种 FV3 编码的 MCP 比较，QSV46 同 FV3 相差 5 个氨基酸， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 PMV69 同 FV3 仅相差 2 个氨基酸。值 得指出的是，PMV69 的序列同本实验 室先前从某养殖场获得的 QSV01 MCP 全长序列完全一致12 ，但两者种类不 同、来源不一致、采样地点的距离超过 400 km。同中国其他来源的蛙病毒比较 显示，不同蛙类携带的 FV3 或 FV3 样 病毒，如 RGV、TFV 同源性都非常高。 从 GenBank 获得虹彩病毒科各代 表种的 MCP 全长序列，与本研究中获 得的 MCP 全长进行比对，并构建进化 树（图 2） ，由图 2 可见， QSV01、QSV46 以及 PMV69 同 FV3 和 STIV 聚为一支，均为蛙病毒属的成 员。 以 ClustalX2 比对虹彩病毒科各 代表种编码的 MCP 氨基酸序列，以 MEGA6 构建进化树。参考序列如下： STIV（EU627010） 、RGV（JQ654586） 、 FV3（AY548484） 、TFV （ AF389451） 、 ATV（ AY150217） 、 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 GSIV（AET51835.1） 、 ISKNV（AF371960 ） 、 RBIV（AY532606） 、 OSGIV（AY894343） 、LCDV- C（AY380826） 、LCDV-1（L63545） 、 IIV6（NP149737.1） 、IIV3（DQ643392） ； QSV01、QSV46 和 PMV69 为本研究涉 及；GSIV-HN 为华中农业大学水生动 物病毒实验室于 2012 年从河南发病大 鲵分离获得。 10 王 兵. 辽宁 省中国林蛙驯养繁殖现状、问题与对策 建议J.辽宁林业科技，2012（3）：52- 54. 11 NAZIR J，SPENGLER M， MARSCHANG R E. Environmental persistence of amphibian and reptilian ranavirusesJ.Dis Aquat Organ， 2012，98（3）：177-184. 12 李莉娟，罗杨志，顾泽茂， 等.蛙病毒 3 介导棘胸蛙的暴发性死亡 A.中国水产学会，中国科学院水生生 物研究所，海南大学.2013 年中国水产 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 学会鱼病专业委员会学术研讨会论文集 C.海口， 2016. 13 李江宇，王树云，王 姝， 等.蛙病毒三重荧光 PCR 检测方法的建 立J. 高技术通讯，2015，25（7）： 746-752. 14 GREEN D E，CONVERSE K A，SCHR