【毕业学位论文】（Word原稿）生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析

学校编码： 10384 分类号 密级 学号： 硕 士 学 位 论 文 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 of 导教师姓名： 专 业 名 称：生物化学与分子生物学 论文提交日期： 论文答辩时间： 学位授予日期： 答辩委员会主席 ： 评 阅 人： 2007 年 9 月 门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中 以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人（签名）： 年 月 日 录 摘 要 . 1 . 2 第一章 前言 . 4 类与生命科学研究进展 . 4 糖的分离纯化和结构分析概述 . 5 糖的分离纯化 . 5 糖的结构分析 . 6 糖的结构和活性的关系 . 8 级结构与活性的关系 . 8 子量与活性的关系 . 9 级结构与活性的关系 . 10 糖的结构修饰 . 11 青霉属真菌多糖的研究现状 . 13 拟青霉多糖（ . 13 尼拟青霉多糖 . 13 脚拟青酶多糖（ . 13 紫拟青霉多糖 . 14 紫拟青霉 . 14 题依据和本研究的主要研究内容 . 16 题依据 . 16 要研究内容 . 16 第二章 淡紫拟青霉菌株的分类鉴定及其培养特性 . 17 言 . 17 料与方法 . 17 试菌株来源 . 17 试菌株的鉴定 . 17 试菌株培养特性研究 . 19 果与分析 . 19 淡紫拟青霉 株的鉴定 . 19 紫拟青霉 株的培养特性 . 22 论 . 29 紫拟青霉的鉴定 . 29 紫拟青霉的培养特性 . 29 第三章 淡紫拟青霉多糖的提取与分离纯化 . 31 言 . 31 料与方法 . 32 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取 . 32 紫拟青霉胞内外 多糖粗提物的性质鉴定 . 32 紫拟青霉胞内外粗 多糖的分离与纯化 . 33 果与分析 . 34 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取 . 34 紫拟青霉胞内外多糖粗提物的性质鉴定 . 35 紫拟青霉胞内外粗多糖的分离与纯化 . 35 论 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的提取与性质鉴定 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的分离 . 39 紫拟青霉胞内外粗多糖的纯化 . 40 第四章 淡紫拟青霉多糖的结构分析 . 41 言 . 41 料与方法 . 42 品分子量的测定 . 42 品单糖组成分析 . 42 碘酸氧化及甲酸测定 . 42 解 . 42 外光谱分析 . 43 果红结合实验 . 43 果与分析 . 43 品分子量的测定 . 43 品单糖组成分析 . 44 V 碘酸氧化及甲酸测定 . 45 解 . 45 外光谱分析 . 45 果红结合实验分析 . 46 论 . 47 第五章 淡紫拟青霉多糖对镰刀菌的抑菌活性 . 49 言 . 49 料 与方法 . 49 试菌株来源 . 49 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响 . 49 紫拟青 霉粗多糖对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响 . 49 紫拟青霉多糖 品对尖孢镰刀菌的抑制作用 . 50 果与分析 . 50 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌生长的影响 . 50 紫拟青霉粗多糖对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响 . 50 紫拟青霉多糖 品对尖孢镰刀菌的抑制作用 . 52 论 . 52 第六章 结论和展望 . 54 论 . 54 望 . 55 参考文献 . 56 曾经和正在参加的科研课题 . 63 论文研究期间发表的文章 . 64 论文研究期间撰写的相关实验报告 . 65 个人简历 . 66 致 谢 . 67 .of .of . of . of .of . . . .of .of . . . . .he of . of . .of of . 17 . of . of . of . of . of . of . of .of . . 31 . of . of . of . of . of . of . of . of . of . 41 . 41 . . . . . . 43 . 43 . . . . . . . 47 of to . 49 . of . of to . of to . . of to . of to . . 52 . 54 . 55 . 56 . 63 of . 64 of 65 .防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 1 摘 要 筛选到一株对枯萎病病原菌 性物质初步筛选结果表明其胞外粗多糖具有抑菌活性。 本论文对该菌株的胞内、外多糖进行了提取、纯化研究，并对纯化所得的两个单组分多糖 行了结构分析以及抑菌活性测定。 1、 通过形态学和 列分析，鉴定出分离保存的菌株为淡紫拟青霉。对其培养特性进行了研究。 2、 淡紫拟青霉发酵液的胞内、胞外物质经过醇析法加乙醇 3 倍即可得到多糖粗提物。经过测试反应验证，该粗提物为多糖，并具有凝胶多糖的理化特性。进一步的分离实验中，发现经 脱蛋白 35 次后，可以使淡紫拟青霉粗多糖中的蛋白质含量低于 脱蛋白后的胞内、外粗多糖经凝胶柱层析纯化后各自得到一个组成分 外光谱检测两者已不含蛋白质、核酸等非多糖类物质。纯化后的淡紫拟青霉多糖同样具有凝胶多糖的特性。 3、在对淡紫拟青霉 胞内、外多糖 分子结构分析中，证明两者均是以 13 葡萄糖苷键连接的单糖组分单一的无分支结构的多聚葡萄糖；R 凝胶层析求得 品的平均分子量分别为 果红结合实验结果表明 品在稀碱溶液中（浓度分支度（有无分支度、分支度大小） 单糖组成（均多糖或杂多糖、杂多糖中单糖种类多少）。 主链结构与活性的关系 -（ 1大多数文献报道的活性多糖都是 构型的多聚糖则大多没有生物活性或活性很弱，但是也有部分具有较强生物活性的 H. 3和 T. 4等人报道了一种 -（ 1外汪艳等人 25从稻糠中提取纯化得到了一种具有 -（ 1 -（ 1苷键结构，且具有较显著抑制肿瘤生长作用的米糠多糖（ 。 在单糖的连接位置，具有 13 连接方式的多糖大多具有生物活性，部分 16连接方式的多糖也具有生物活性，而 12 连接、 14 连接等方式的多糖则很少具有活性。 构型不同的葡聚糖其作用不同，一般认为 -（ 13 ） -（ 14 ） -（ 13 ） 性，如茯苓多糖和昆布多糖都有这种结构，但却无抗肿瘤活性。以下是几种目前正在临床试验和应用的具有生物活性的食药用真菌多糖及其基本结构 26。 表 分食药用真菌多糖 的 结构 源 多糖 结构 菇多糖（ L） -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 芝多糖（ -（ 13 ）； -（ 14 ）； -（ 16 ） 蛋白复合物 褶菌多糖（ -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 树花多糖 -（ 13 ）； -（ 16 ）蛋白复合物 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 9 分支度与活性的关系 多糖分支度与活性的关系并不是一种线性关系，分支度适中的多糖往往具有较高的活性，而分支度过高或过低的多糖其活性都有限。活性很强的裂褶菌多糖和香菇多糖仅在 有分支，分支度为 自担子菌类 分支度为 肉瘤 抑制率是裂褶菌多糖的 94%。另一 些活性多糖的分支度分布为 化较大。 7以及 伊藤和枝 28对几十种葡聚糖的分支度与其抗肿瘤活性进行了比较，认为分支度（ -（ 13 ） 有更高的活性。具有更高分支度的 （ 聚糖抗肿瘤活性是有限的。具有分支度的薄盖灵芝（ 聚糖（ 仅具有微弱的活性29。表 3 是一些有生物活性的食药用真菌多 糖和它们的分支度 30。 表 3 部分食药用真菌多糖 的 分支度 of 源 多糖 分支度 苓多糖 苓多糖 菇多糖（ L） 树花多糖 褶菌多糖（ 木耳 分子量与活性的关系 多糖的活性在很大程度上取决于其分子量大小。一般来说分子量在100200间的多糖片段有较高的生物活性，而相同来源的分子量在 51 0分子量大于 100裂褶多糖具有较强的抗肿瘤活性，而其低分子量（ 80）下形成的凝胶不可逆。 表 淡紫拟青霉 胞外及胞内多糖粗提物的物理性质 of 品 溶解性 外观 成胶性 蒸馏水 1N N 、酮、醚、 内多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 深褐色粉末 较强 胞外多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 褐色粉末 较强 表 淡紫拟青霉 胞外及胞内多糖粗提物的 化学性质 of 品 蒽酮试剂 剂 剂 酚 碘液 胞内多糖粗提物 蓝绿色 紫红色 玫瑰红 蓝色 橘红色 不变色 胞外多糖粗提物 蓝绿色 紫红色 玫瑰红 蓝色 橘红色 不变色 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的分离与纯化 淡紫拟青霉胞内外粗多糖的分离 脱蛋白次数对多糖含糖量、含蛋白量及得率的影响见表 着脱蛋白次数的增多，所得到的胞内、外多糖半纯品中的含糖量增加，含氮量减少。脱蛋白 3 次后，得到的半纯化淡紫拟青霉 胞内、外多糖半纯品中含糖量的增加幅度和含氮量的减少幅度都趋于平缓，此时胞内、 蛋白含量分别为 而多糖的得率着随着脱蛋白次数的增加持续减少。因此，淡紫拟青霉粗多糖的脱蛋白次数应以 3 次为宜。 生防菌淡紫拟青霉多糖的分离、纯化及结构分析 36 表 脱蛋白次数对淡紫拟青霉多糖分离的影响 of of on 蛋白次数 含糖量（ %） 含氮量（ %） 得率（ %） 胞内多糖 胞外多糖 胞内多糖 胞外多糖 胞内多糖 胞外多糖 1 胶柱层析 淡紫拟青霉胞内外粗多糖经过 层析，分部收集液用酚 到的洗脱曲线见图 图可见，胞内外粗多糖均含有多个不同分子量的组分，但以其中一个分子量较大的组分占绝对的优势地位，分别记为 洗脱峰也较为尖锐对称。因此我们选择对进行这两个组分进行下一步的研究。 00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 21 . 41 . 61 . 80 20 40 60 80 100洗脱体积 ( m