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三色法流式细胞术检测 CD4+、CD25 +调节性 T细胞 Foxp3的方法 王琦 1 张行 1 邵雁 2 陈大方 1 陈萍 1 曹江 1 目的 为探讨甲状腺患者外周血中 Foxp3+CD4 T细胞的表达及在甲状腺恶性肿瘤患者外周 血手术前后的临床意义。方法 建立流式细胞术检测 CD4+、CD25 +调节性 T细胞 Foxp3的方 法。 结果 外周血中 Foxp3+CD4 T细胞平均比例,体检健康组为 3.76291.9996%,甲 状腺恶性肿瘤术前组为 9.14926.4704%,术后组为 7.44356.3587%。结论 甲状腺恶性 肿瘤患者 Foxp3+CD4 T细胞平均比例明显高于体检健康者(P0.05) 。 而甲状腺恶性肿 瘤患者术后 Foxp3+CD4 T 细胞平均比例则低于术前。 关键词: 流式细胞术、甲状腺癌 、Foxp3 CD4+、CD25 +调节性 T细胞是天然产生的调节性 T细胞的重要亚群之一,在稳定的自身 免疫环境中发挥重要的作用 1。Foxp3 特异性地表达在 CD4+、CD25 +Treg 细胞上,并在该 细胞的发育和功能维持中起很重要的作用,进而提示 Foxp3可能是 CD4+、CD25 +Treg 细胞 的一个特征性标志 2。近几年的研究发现调节性 T细胞有可能以某种机制抑制着机体对肿 瘤的免疫应答,从而导致肿瘤的发生 3,目前调节性 T细胞与肿瘤免疫机制及治疗的研究 逐渐成为热点。 甲状腺癌是最为常见的内分泌恶性肿瘤之一,占头颈部肿瘤的首位,本研究为探讨 Foxp3+CD4 T细胞在甲状腺恶性肿瘤患者外周血手术前后外周血中的表达,我们建立三 色法流式细胞术检测 CD4+、CD25 +调节性 T细胞 Foxp3的方法,并讨论其临床意义。 1 材料与方法 1.1临床资料与分组: 收集甲状腺癌患者(2007 年 11月2008 年 2月期间本院住院患者) 外周血共 41例,术前 24例,其中的 17例患者术后 7天取外周血,行流式细胞术检测 CD4+、CD25 +调节性 T细胞 Foxp3检测,所有患者手术标本均经组织病理学诊断。健康对照 组 21例,为本院体检中心体检健康者。 1.2 主要试剂和仪器:淋巴细胞分离(国药集团化学试机有限公司),CD4-FITC、CD25-PE 购自 Caltag公司,Foxp3-PE-Cy5、IgG2a- PE-Cy5、 Foxp3破膜试剂盒等均购自 eBioscience公司,正常大鼠血清购自杭州联科有限公司。低温高速离心机(HERAEUS D- 37520 德国) ,流式细胞仪 EPICS XL型 (Beckman Coulter 美国) 。 1.2 方法: 1.2.1 外周血单个核细胞(PBMC)分离 取患者外周静脉血 4ml 以 EDTA 抗凝,充分混匀。取 10ml 离心管,将 4ml 全血缓慢 加在 4ml 淋巴细胞分离液上部,2000 转/分钟室温离心 20 分钟。轻轻吸取中间白色的淋巴 细胞层至另一管,2000 转/分钟室温离心 5 分钟,去上清。加 2ml PBS 混匀,2000 转/分室 温离心 5 分钟,去上清。计数细胞后调整细胞浓度至 1X106ml-1。 1.2.2 流式样本制备 取 200l 上述单细胞悬液,在对照管和实验管中分别加入 100l,且在两管中均加入 CD4-Pcy5、CD25-FITC 各 5l,4避光孵育 30 分钟。加 1ml Flow cytometry Staining buffer,混匀。2000 转/分钟室温离心 5 分钟,去上清。对照管和实验管中各加入 2ml 破膜 剂。4避光孵育 45-60分钟。2000 转/分钟,离心 5 分钟,去上清。对照管和实验管中各 加入 2ml Permeabilization Buffer,2000 转/分钟,室温离心 5 分钟,去上清。重复 Permeabilization Buffer 洗细胞步骤一次。对照管和实验管各加入 100 l Permeabilization Buffer,充分混匀,再加正常大鼠血清 2l,4避光孵育 15分钟。无需 Permeabilization Buffer 清洗细胞,直接在对照管中加入 IgG1-PE 2.5l,实验管中加入 Foxp3-PE 20l。4 避光孵育至少 30分钟。对照管和实验管中各加入 2ml Permeabilization Buffer,2000 转/ 分 钟,室温离心 5 分钟。去上清,重复 Permeabilization Buffer 清洗步骤一次。加 400ul Permeabilization Buffer 上机检测。 1.3 统计学分析:采用 SPSS11.5 软件进行统计学分析,组间差异以 LSD 法进行两两比较, P0.05 为有显著性差异。 2.结果 2.1 甲状腺恶性肿瘤手术前、后外周血中 CD4+CD25 + T细胞的平均比例:流式细胞术检测 体检健康者外周血中 CD4+CD25 + T细胞的平均比例为 22.40487.5827%,甲状腺恶性肿 瘤 术前外周血中 CD4+CD25 + T细胞的平均比例为 19.77257.9942%,术后组为 21.5765 9.1018%。无显著性差异(P0.05) 。 2.2甲状腺恶性肿瘤组术前 Foxp3+CD4 T细胞的平均比例(9.14926.4704%), 明显高 于体检健康者(3.76291.9996%) ,二者相比有显著性差异(P0.05) 。 2.3 甲状腺恶性肿瘤组进行肿瘤切除术后,外周血中的 Foxp3+CD4 T细胞的平均比例 (7.44356.3587%) ,而体检健康者为(3.76291.9996%) ,二者相比有显著性差异 (P0.05) 。 2.4 甲状腺恶性肿瘤术后组外周血中的 Foxp3+CD4 T细胞的平均比例 (7.44356.3587%)低于术前组(9.14926.4704%) ,无显著性差异(P0.05) 3. 讨论: 肿瘤的发生是肿瘤细胞逃避免疫监测的结果,在肿瘤宿主体内许多可以被自体 T 细胞 识别的肿瘤相关抗原目前已经被证明是自身的正常组分。通过外周耐受抑制自身反应性 T 细胞活性的机制,也同样影响着对肿瘤相关的自身抗原的应答,从而参与肿瘤在宿主体内 发生和发展,而具有免疫调节潜力的 CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞就是限制自身免疫反应的重 要因素之一 3、4 。甲状腺肿瘤是较常见的内分泌腺肿瘤,临床最初多表现为无痛性甲状腺 结节,在总人群中的发病率为 4%7%,其中大多数为良性,但约有 5%为恶性 5。 甲状腺 癌发生、发展及预后是多种基因相互或独立作用的结果,了解各种类型甲状腺癌及其不同 病程阶段的基因和编码蛋白表达变化,对于分析病变相关分子生物学具有重要的意义 6。 本研究收集甲状腺恶性肿瘤患组 24例,甲状腺切除术后组 17例,体检健康组 21例, 用三色法流式细胞术检测外周血中 CD4+CD25 + T细胞、Foxp3 +CD4 T细胞的平均比例。 结果表明,甲状腺恶性肿瘤术前组、术后组和体检健康组三组间 CD4+CD25 + T细胞的平均 比例经统计学处理无显著性差异。而甲状腺恶性肿瘤组无论术前、术后 Foxp3+CD4 T细 胞的平均比例均高于体检健康者(P0.05) 。目前国内外有报道肿瘤患者外周血和肿瘤组 织中 CD4+CD25 + 调节性 T细胞升高,并且在肿瘤组织切除后外周血中 CD4+CD25 + 调节性 T细胞的水平有所下降。本实验中甲状腺恶性肿瘤术后组外周血中的 Foxp3+CD4 T细胞的 平均比例(7.44356.3587%)低于术前组(9.14926.4704%) ,呈下降趋势,与国内外相 关报道一致。为临床提供了观察患者手术疗效的一个有效指标。 流式细胞仪在分析细胞群体时具有速度快、多参数、细胞数量大等优点,此方法检测 外周血在临床上应用非常广泛,本实验建立三色法检测外周血中 CD4+、CD25 +调节性 T细胞 Foxp3的方法,可及时了解患者外周血中调节性 T细胞表达水平的变化,为临床观察手术、 药物及基因治疗等疗效提供一定的依据,也可作为对患者预后的判断和随访治疗的参考。 参考文献: 1. 吕凌。介导 CD4+、CD25 +调节性 T 细胞发育与功能的一个关键基因-Foxp3J 。国际 免疫学杂志,2006,29(2):65-68。 2. Fontenot JD, Gavin EW,Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+、CD25 + regulatory T cellsJ . Nat Immunol, 2003, 4(4):330-336. 3. 崔永生,李欣,于春雷等.肺癌和乳腺癌患者外周血中 CD4+ CD25+ T 细胞及 Foxp3 mRNA 的变化特点及临床意义J. 吉林大学学报(医学版) ,2006,32(5):843-846。 4. Sakaguchi S. Regulatory T cells : key controllers of immunologic self-toleranceJ. Cell, 2000, 101: 455-458. 5. 许晨,赵文川.甲状腺分子标记物研究进展J. 现代肿瘤医学, 2006,

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