《甘薯快繁脱毒研究》PPT课件.ppt

甘薯的快繁脱毒研究 v甘薯的生物学特性及经济价值 v甘薯病毒病的研究简史 v甘薯的脱毒方法 v甘薯茎尖培养脱毒 v常见问题及解决方法 v结语 甘薯的生物学特性及经济价值 v甘薯的生物学特性 甘薯(Ipomoea batatczs L.Lam )，又名甜薯、番 薯、红薯、白薯、山芋、地瓜、红茗等。属旋花科 ，一年生或多年生草本块根植物。甘薯喜高温、短 日照，易栽易种，适应性强，抗逆性强，省水耐贫 瘩，病虫害少，同时具有稳产、高产的特点，在我 国农村栽培地区很多。 甘薯是介于蔬菜和粮食之间的食品，不仅 味道好，而且营养也很丰富。甘薯块根生长 于地下，鲜甘薯中含60-80%水分、10-30%淀 粉、5%左右的糖分及少量蛋白质、油脂、纤 维素、半纤维素、果胶、灰分等。若以2. 5kg 鲜甘薯折成0. 5kg粮食计算，其应有成分除脂 肪外，蛋白质、碳水化合物的含量都比大米 、面粉高，特别是粮食类食品中比较缺乏的 赖氨酸在甘薯中含量较高，此外甘薯中含有 丰富的维生素A、B1、B2、 C、E。 甘薯是一种保健美容食品。甘薯是一种生 理的碱性食品，吃入人体后育邑中和肉、米 、面所产生的酸性物质，调节人体的酸碱平 衡。 自从20世纪80年代以来，甘薯的抗癌保健 成分和功能被国内外科学家逐渐揭示。最近 食品专家开发出一种紫色的甘薯新品种，含 有大量能够保护眼睛健康和提高视力的色素 花青素苷。美国费城大学生物学家从甘薯中 提取一种叫DHBA物质，这是一种类固醇， 具有防止癌和延长寿命作用。 随着科学技术的发展，甘薯的综合开发 利用工作将进一步深入，充分显示了“甘薯全 身都是宝”作用，甘薯已逐步发展成为用途广 泛，高产高效的经济作物。 甘薯病毒病的研究简史 植物病毒为害是农业生产上损失最大的病害之一 ，有“植物癌症”之称。1919年恩幸（Ensign）首次报 道了甘薯病毒的发现，70年代，世界各产区相继报道 了甘薯病毒病造成甘薯产量降低，品质下降。目前已 报道的侵染甘薯的病毒和类病毒有10余种，主要是:甘 薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯潜隐病毒(SPLV)、甘 薯脉花叶病(SPVMV)、甘薯轻斑驳病毒(SP-MMV)、 甘薯黄矮病毒(SPyDV)、甘薯无病症病毒(SPSV)、甘 薯凹脉病毒(SPSVV)、甘薯病毒病中的白粉虱传播因 子(SPVD)、甘薯类花椰菜花叶病毒(SPCLV)、烟草花 叶病毒(TMV)、烟草条纹病毒(TSV)、黄瓜花叶病毒 (CMV)及尚未定名的C- 2和C- 4，1。 v甘薯的经济价值 甘薯是我国的四大粮食作物之一，是一种重要 的粮食、饲料和工业原料作物，具有产量高、营养 丰富、稳产性好等优点。中国的甘薯种植面积达660 万hm2，总产量达1亿t，面积和产量占世界的80%， 居世界首位。 甘薯作为主食除可直接食用鲜薯和薯干外，也 可以与大米、玉米、面等掺在一起，做成煎饼、馒 头、面条等食品。作为副食主要是经过简单加工可 以制成各种食品及食品添加剂。甘薯制成果脯，软 甜可口、物美价廉。甘薯渣可制成酱色、醋等产品 。甘薯罐头在有些国家也很畅销，甘薯还可以制成 薯干、菜肴、味精等。甘薯简单加工、投资小、技 术很容易掌握，很适合农村个体及乡镇企业经营。 其中，甘薯羽状斑驳病毒是最主要的一 种甘薯病毒，几乎分布于世界各甘薯产区， 它经蚜虫以非持久方式传播，是目前研究得 最彻底的甘薯病毒。侵染我国甘薯的主要病 毒除SPFMV外，还有SPLV和SPCLV，此外 还发现甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)和C-2两种病 毒，但未发现SPMMV。 SPFMV属马铃薯Y属(Potyvirus)病毒，对 甘薯危害最重，分布最广，几乎在所有甘薯 品种上都可发现。目前已鉴定出该病毒的多 个株系，如SPFMV-0(普通株系)、SPFMV- RC(褐裂株系)、SPFMV-IC(内木栓株系)等。 SPFMV病毒粒体失活温度为60-65，稀 释终点为10-3-10-4，体外存活期12h。 SPLV侵染的许多甘薯品种不产生明显的叶 部症状，仅产生轻度的斑驳，可经汁液摩擦接 种传播，能侵染旋花科的多种、黎科3种、茄 科9种植物。该病毒的稀释限点为10-2-10-3 ，失 活温度为60-65 ，于25下体外存活期不超 过24h。 SPLV在被感染植物细胞中产生特异性的内 含体，可随种薯、种苗营养体繁殖传播，但蚜 虫、白粉虱和种子均不传毒。 甘薯病毒病症状图： 甘薯的脱毒方法 v热处理法 热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性 的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度， 得到一小部分不含病毒的植物分生组织，进行无毒 个体培育到植株。Bake(1972)研究表明在热水处理 中，由于植物组织经过淋洗，在水中浸泡常常会窒 息死亡，并且这种处理也会打破或延长植物的体眠 期。所以现在更常用的方法是将病毒感染的植物用 35-38处理2-4周或更长时间进行脱毒。 热处理脱毒法已应用多年，被世界多个国家利 用，该项技术要求的设备比较简单，脱毒操作技术 也比较容易，主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全 。 v茎尖培养脱毒法 早在20世纪40年代研究者们就发现在感染病毒 的植物体中，根尖和茎尖分生组织中并没有病毒， 因为分生细胞的细胞壁没有形成胞间连丝，病毒颗 粒无法从周围的组织进入到分生细胞的内部。 病毒的粒子及其微小，直径小于0.lum，只有在 电子显微镜下才可识别，病毒一旦感染植物，就可 以通过植物的维管束和细胞壁上的胞间连丝扩散到 所有的组织和器官。但是植物的茎尖分生组织是由 分生细胞构成，分生区域内无维管束，细胞壁的胞 间连丝也不发达，病毒很难进入，所以生长点往往 不含病毒或含有极少量的病毒，因而采取茎尖分生 组织培养技术就能实现无病毒或去病毒植株的快速 繁殖。 茎尖培养时切取过大则不能保证完全除去病毒 ，茎尖愈小携带的病毒越少。考虑到脱毒效果及提 高成活率，一般是取带1-2个叶缘基的顶端分生组织 进行培养。研究表明，脱除病毒的效果与茎尖大小 成反比，但是茎尖太小不易成活，所以茎尖大小必 须适度。 茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在 较短的时间内得到许多原种繁殖材料，但这种方法 存在的缺点是植物的存活率低。现在经常是将热处 理与茎尖培养相结合来使用，热处理与茎尖培养相 结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使 植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利 于切取较大的茎尖(在lmm左右)，从而提高培养或嫁 接的成活率。 甘薯脱毒鉴定 甘薯病毒的检测有多种方法，如目测法、指示 植物法、血清学检测法、电镜观察法及分子生物学 方法。 目测法是根据甘薯叶和薯块上出现的典型症状 进行判断，可初步剔除病株，但对一些潜隐性病毒 无法检测。 指示植物法即根据指示植物巴西牵牛(Ipomoea setosa)是否新生出明脉、斑点、变色等症状，此法 简单、成本低，但不能区分病毒种类。 血清法为酶联免疫吸附法(ELISA)或在此基础上 改进的电结合酶联免疫吸附法(Dot-ELISA )等，是 目前使用最广泛和较为可行的方法，其是根据硝酸 纤维膜是否形成有色斑点来判断。 电镜法即根据病毒的大小和形态特征，利用电 子显微镜分辨率高的特点，对病毒颗粒进行直接观 察，由于电镜的使用复杂使该法的推广受到较大制 约。 分子生物法是将cDNA探针和双链RNA技术应用 在甘薯病毒检测上，由于样品处理复杂，探针分离 困难，同位素标记存在安全问题等原因，使其应用 范围受到影响。 甘薯茎尖培养脱毒 v脱毒甘薯品种的选择 在脱毒甘薯的品种选择上，甘薯的品种繁多， 不同的甘薯品种一般都具有一定的区域适应性，在 选择脱毒甘薯品种需充分考虑该地区的气候条件、 土壤时条件及栽培条件，因此选择适宜的优良品种 ，充分发挥脱毒甘薯的品种优势是获得高产的关键 技术措施，所以主要是选择我省的主栽品种、新品 种、特殊加工用品种进行脱毒，如金山57、岩薯5号 、龙岩7-3，其它品种等获得的脱毒苗。 v脱毒前处理 选择的薯块大小基本一致，在实验室中用恒温 水浴锅用变温方法对薯块进行钝化病毒处理：用 恒温水浴锅将水加热到57，把薯块置于温水中浸 泡3min，然后将温度降至511温水中浸泡30min ；将水加热到60，把薯块置于温水中浸泡 10min ,然后降低温度到551，薯块在温水中继续 浸泡23min。在浸泡过程中不断翻动薯块，使其受 热均匀。 温水钝化病毒处理后，再用50%多菌灵800倍药 液浸泡消毒薯块15min。处理好的薯块一部分置于 塑料盆中，盖上10cm厚消毒好的细河沙，在较洁净 的室内催芽，另一部分植于塑料大棚内发芽。 在30左右下催芽，当幼苗长至30cm(3-4周)就 可以剪苗做茎尖培养。 v茎尖剥离与培养 剪取生长旺盛的茎尖3-5cm，在室内切去 叶片，然后消毒。消毒时将材料先用75 %乙 醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后用 HgCl2(0.1%)浸泡8 min，无菌水冲洗4遍。接 种时，在解剖镜下剥取0.2-0.3mm大小的生长 点(带1片叶原基)，接种在配制好的培养基中 。 剥离茎尖10天 剥离茎尖20天 剥离茎尖30天 剥离茎尖50天 v培养基的选择 综合国内外有关甘薯茎尖分生组织离体培 养的研究结果，MS (Murashige和Skoog， 1962)是最适宜的培养基。MS有机物中甘氨酸 、烟酸、VB1、VB6和肌醇五种物质对甘薯茎 尖生长都是必需的，它们对甘薯幼苗的作用 彼此是互补的，彼此不可代替。 v诱导分化培养 一定浓度的植物激素如IAA、NAA、6- BA、GA3等是甘薯茎尖分生组织培养必不可 少的因素，培养基中不同激素的浓度和配比 直接制约甘薯茎尖的生长和分化，结果表明 ，IAA:6-BA 为 1:5-20 诱导效果最好，最佳诱 导分化培养基为:MS + 6-BA 1 mg/L + IAA 0.1 -0.2 mg/L + GA3 0.1 mg/L,不同品种的最适培 养基基本一致。 v增殖培养 待茎尖脱毒培养20天后，转接到MS+3.0 蔗糖+0.1活性炭的培养基上培养。30天 后脱毒苗去掉叶片，每2个茎节为1个新的外 植体(顶芽带1节可见茎节也为1个新的外植体) 转入MS+3.0蔗糖+0.1活性炭的培养基上 增殖，以后每30天继代增殖一次。 v脱毒苗繁育 脱毒甘薯茎尖苗的大量繁殖，可采用实验室试 管苗快繁和温网棚繁殖方式来实现。实验室内繁殖 是在无菌条件下，将脱毒苗一叶一节切段，扦插于 不添加任何植物生氏调节剂1/2MS培养基中，培养 过程中保持充足的光照和适宜的温度条件，才能提 高薯苗的质量和繁殖速度。温网棚繁殖需在幼苗5-7 叶时打开瓶口，室温下加光照炼苗5-7d。移栽前准 备适合的基质并消毒，生产上多采用蛙石、珍珠岩 、沙土或疏松的土壤等作为基质。 实验室内快繁具有繁殖速度快、避免病 毒再次侵染、不受季节、气候及空间的限制 、可工厂化生产的优点；温网棚快繁成活率 高，但成本较高。 壮苗培养（苗圃育苗 ） v意义 由茎尖诱导并经过扩繁所得 到的试管苗比较瘦弱,通过 原球茎多代扩繁的试管生根 苗因为种苗瘦弱移栽成活率 较低,因此经过多代扩繁后 所培养的培养苗必需经过壮 苗以提高组培苗的质量。 v方法 要求棚内高温、高湿、 高肥。方法是在防虫温 室或网室内，整地施肥 做成1-1.5 m宽的苗床， 行株距15 cm*10 cm,将 预先炼苗7d的脱毒试管 苗整棵或2节1苗栽于苗 床 。 甘薯脱毒试管苗室内切断快繁 甘薯脱毒试管苗室内营养体移栽 甘薯脱毒苗田间苗圃 脱毒后的甘薯块根 常见问题及解决方法 v问题：生长发育过程中极易感染病毒, 并随着繁殖代数的增 加而逐代加重, 一般脱毒甘薯增产特性保持2-3年后会因病毒 再侵染而丧失 。 v措施： v（1）提高茎尖的脱毒率，关键是控制剥取的茎尖的大小。 v（2）采用5*5cm的行间种植规模; v（3）采用更有效的防虫害方法，特别防虫网在40目以上； v（4）最好使用之前未种植过甘薯的土地，并勤喷洒高效、 廉价的抗虫害药剂等。同时加强甘薯脱毒种苗的生产与推广 应用工作。 结语 事实证明脱毒甘薯试管苗具有个体小、便于贮运的优势 ，及其适合用于种质资源保存和交换。但是由于脱毒苗进入 大规模种植后，很容易受病毒的再侵染而引起再退化，