《核苷酸代谢》PPT课件.ppt

第十一章第十一章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢核酸的酶促降解和核苷酸代谢 本章讨论核酸酶的类别和特点，对核苷酸本章讨论核酸酶的类别和特点，对核苷酸 的生物合成和分解代谢作一般介绍。的生物合成和分解代谢作一般介绍。 第一节第一节 核酸的酶促降解核酸的酶促降解 第三节第三节 核苷酸的合成代谢核苷酸的合成代谢 第二节第二节 核苷酸的分解代谢核苷酸的分解代谢 第一节第一节 核酸的酶促降解核酸的酶促降解 核苷酸酶 核苷磷酸解酶 核酸 核苷酸 核苷 碱基+核糖1P 磷酸 核酸酶核酸酶 核苷水解酶 碱基+核糖 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶( (DNaseDNase ) ) 核糖核酸酶核糖核酸酶( (RNaseRNase ) ) 非特异性核酸酶非特异性核酸酶 核核 酸酸 酶酶 1 1、核酸酶的分类、核酸酶的分类 （1 1）根据对底物的根据对底物的 专一性分为专一性分为 （2 2）根据）根据切割位点切割位点分为分为 核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶 2 2、核酸酶的特异性核酸酶的特异性 3 3、限制性内切酶限制性内切酶 外切核酸酶对核酸的水解位点 5 p p p p OH B p p p p 3 BBBBBBB 牛脾磷酸二酯酶 （ 5端外切5得3） 蛇毒磷酸二酯酶 （ 3端外切3得5） 内切核酸酶对RNA的水解位点示意图 5 p p p pOH PyPuPyPy 1 p p p GACU p p p GA 3 RNAase IRNAase IRNAase T1 RNAase T1 Pu ：嘌呤 Py：嘧啶 限制性内切酶限制性内切酶 类型类型 命名和意义命名和意义 限制片段的长度限制片段的长度 限制图限制图 原核生物中存在着一类能识别外源原核生物中存在着一类能识别外源DNADNA双螺旋中双螺旋中4-84-8个碱基个碱基 对所组成的特异的具有二重旋转对称性的对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列回文序列，并在此序，并在此序 列的某位点水解列的某位点水解DNADNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类 酶称为限制性内切酶（酶称为限制性内切酶（ristrictionristriction endonucleaseendonuclease）。 常用的DNA限制性内切酶的专一性 酶辨认的序列和切口说明 A G C T T C G A G G A T C C C C T A G G A G A T C T T C T A G A G A A T T C C T T A A G A A G C T T T T C G A A G T C G A C C A G C T G C C C G G G G G G C C C Bam H I Alu I Bgl I Eco R I Hind Sal I Sma I 四核苷酸，平端切口 六核苷酸，平端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 六核苷酸，粘端切口 限制性内切酶类型限制性内切酶类型 I I型：分子量大于型：分子量大于1010 5 5 ，多亚基，需，多亚基，需SS线苷蛋氨酸、线苷蛋氨酸、ATPATP 和和MgMg2+ 2+ ， ，识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限识别位点与切割位点相差甚远，产物为异质，是限 制与修饰相排斥的多功能酶制与修饰相排斥的多功能酶. . 型：分子量小于型：分子量小于1010 5 5 ，需，需MgMg2+ 2+ ， ，切割位点位于识别切割位点位于识别 位位 点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物点上，产物为专一性片段，不具修饰酶功能。现在分子生物 学研究所用的限制性内切酶均为此类。学研究所用的限制性内切酶均为此类。 II型：识别位点为型：识别位点为57bp57bp的非对称序列的非对称序列 ，切割位点在切割位点在 顺序之外离识别顺序之外离识别 序列序列510bp510bp，切割双链，个别也切割单链。切割双链，个别也切割单链。 是限制与修饰相多功能酶是限制与修饰相多功能酶. . 限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 Eco R IEco R I 序号序号属名属名种名种名株名株名 例：例：Eco R IEco R I，这是从大肠杆菌（这是从大肠杆菌（EcoliEcoli）R R菌珠中分离出的一种限制性内切酶菌珠中分离出的一种限制性内切酶 Hind 例：流感Haemophilus influengae d （属名） （种名） （株系） I 特异性甲基化酶 IIGTPyPuAC III AAGCTT 限制性内切酶的意义限制性内切酶的意义 限制性内切酶是分析染色体结构、制作限制性内切酶是分析染色体结构、制作 DNADNA限制图谱、进行限制图谱、进行DNADNA序列测定和基因分序列测定和基因分 离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具 ，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNADNA 分子。分子。 限制图的定义和构建 限制图（亦称物理图谱）是DNA的限制性内切酶酶解 片断沿DNA分子的物理位置的排列顺序以及各片断的相对 长度和绝对长度。由于限制性内切酶能在独特顺序切割双 链DNA产生大的DNA片段，它们提供了一种以碱基对为单位 距离给DNA分子作图的方法，在确定DNA分子一级结构的过 程中，限制图的构建是一项必不可少的工作。 限制图制作方法示例：末端标记单酶切法 限制性内切酶解法 SV-40基因组限制性酶谱 SV-40病毒基因组限制性物理图谱 末端标记法绘制物理图谱 将待测DNA分子的一端用放射性同位素标记，部分酶解； 电泳分离，只有带同位素的片段出现在放射自显影图上；. 分析：放射自显影图上谱线的数目相当于完全酶解片段的数目； 相邻谱线碱基对数目之差就是两个相邻点之间这段DNA片段的大小。 例：某组蛋白基因片段共5900bp，末端标记后用HpaII部 分酶解得到五个片段，分子量分别为：5900bp；4210bp； 3260bp；2950bp；1020bp。画出该DNA分子的物理图谱。 19301020 1020bp 2950bp 3260bp 5900bp 4210bp 3101690950 + Mark 限制性内切酶解法 部分酶解法 将待测DNA用限制性内切酶完全水解，电泳后得完全酶解图谱. 再将待测DNA进行部分酶解(限制酶量、降低温度、缩短反应时 间),电泳后获得部分酶解图谱. 对完全酶解和部分酶解片段长度进行比较分析，根据片段重叠原 理组建物理图谱. 例：有一 174经Hind II酶解所得片段，分子大小 为1030bp，其用Alu I完全水解得四个片段：A 750bp，B 150bp，C 80bp，D 50bp；用Alu I部分水解得三个片段： 800bp，230bp，130bp。请推断A、B、C、D的排列顺序。 CABD 1508050750 230 130 800 + Alu I 酶解图谱 B A C D Mark 完全部分 第二节第二节 核苷酸的降解核苷酸的降解 二、二、嘧啶的降解嘧啶的降解 一、一、嘌呤的降解嘌呤的降解 核苷酸酶 核苷磷酸化酶 核苷酸 核苷 碱基+（脱氧）戊糖1P 磷酸 嘌呤的分解 及“痛风症” 产生和治疗 尿囊酸尿素 CO2+NH3 腺嘌呤脱氨酶 黄嘌呤氧化酶 尿酸氧化酶 黄嘌呤氧化酶 鸟嘌呤脱氨酶 腺嘌呤 次黄嘌呤 黄嘌呤鸟嘌呤 尿囊素尿酸 N C H H HO N C H 次黄嘌呤类似物 别嘌呤醇 黄嘌呤类似物 别黄嘌呤 尿酸过多导致痛风（gout） 结构与次黄嘌呤很相似的别嘌呤醇（allopurinol）对 黄嘌呤氧化酶有很强的抑制作用，可用来治疗痛风。 嘧 啶 的 分 解 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶 二氢尿嘧啶 二氢胸腺嘧啶 脲基丙酸 脲基异丁酸 -氨基异丁酸 丙氨酸 第三节 核苷酸的合成代谢 一、核糖核苷酸的生物合成 二、脱氧核糖核苷酸的生物合成 三、各种核苷酸的相互转变 核糖核苷酸的生物合成核糖核苷酸的生物合成 1、嘌呤核苷酸的生物合成 (1) 从头合成途径 (2) 补救合成途径(自学) 2、嘧啶核苷酸的生物合成 (1) 从头合成途径 (2) 补救合成途径(自学) 嘌呤环上各原子的来源 来自谷氨酰胺的酰胺氮 来自“甲酸盐” 来自天冬氨酸 来自甘氨酸 来自CO2 来自“甲酸盐” Many steps require an activated ribose sugar IMP的 生物合成 5-磷酸核糖焦磷酸 5-磷酸 核糖胺 甘氨酸 甘氨酰胺核苷酸 甲酰甘氨酰胺核苷酸 甲酰甘氨咪核苷酸 5-氨基咪唑核苷酸5-氨基咪唑-4-羧核苷酸 5-氨基咪唑-4-琥珀基 -甲酰胺核苷酸 5-氨基咪唑-4- 氨甲酰核苷酸 5-甲酰氨基咪唑-4 -氨甲酰核苷酸 次黄嘌呤核苷酸 （IMP） 甲酰THFA IMP转变为GMP和AMP Gln是合成嘌呤核的氮原子供体，与Gln结构 相似的一些化合物如氮丝氨酸（azaserine） 和6重氮5氧代正亮氨酸（6diazo5 oxonorleucine,DON）是Gln的拮抗物，阻止 生物体利用Gln合成嘌呤核苷酸（即阻止反 应5），从而阻止核苷酸的合成。 FH4是一碳单位的载体，叶酸的拮抗物如氨基喋 呤（amino protein）、氨甲蝶呤（amethop terin ）抑制反应4,10，阻止嘌呤核苷酸的合成，研究 这些化合物对治疗癌肿可提供有益的帮助。 嘌呤核苷酸合成补救途径（自学） 磷酸核糖转移酶 嘌呤+PRPPA(G)MP+PPi 嘌呤+1P核糖 嘌呤核苷 A(G)MP ATP ADP (adenine phosohoribosyl transferase) (hypoxanthineguanine phosohoribosyl transferase) 节约能量和一些氨基酸的消耗。 有些组织（如脑、骨髓）不能从头合成嘌呤核 苷酸，只能进行嘌呤核苷酸的补救合成。 HGPRT完全缺失的患儿，表现为自毁容貌综 合症。 嘌呤核苷酸补救合成的生理意义 LeschNyhan Syndrome Absence of HGPRTase Xlinked (Gene on X) Occurs primarily in males Characterized by: Increased uric acid Spasticity Neurological defects Aggressive behavior Selfmutilation 嘧啶核苷酸从头合成途径 c、UMP转变为CTP CTP CTP合成酶 ATP GlnH2O UMPUDPUTP a、嘧啶环上原子的来源 b、UMP的从头合成 嘧啶环上各原子的来源 天冬氨酸 CO2 NH3 N N C C CC 6 5 4 3 2 1 H2NCOP 氨甲酰磷酸 显著不同处：先合成嘧啶环,然后再和PRPP作用 形成核苷酸。 相同处：都有从头合成途径和补救途径。 UMP CMP TMP 与嘌呤核苷酸合成的 嘧啶核苷酸的生物合成 第一阶段：合成氨甲酰磷酸 第二阶段: 嘧啶核的形成，包括反应2，3，4 第三阶段：形成尿苷酸, 包括反应5，6 1尿苷酸（UMP）的合成 （1）从头合成途径（De novo synthesis） The The pyrimidinepyrimidine biosynthetic pathway biosynthetic pathway 尿嘧啶核苷酸合成途径 天冬氨酸 氨甲酰天冬氨酸 二氢乳清酸 乳清酸 乳清苷酸 尿嘧啶核苷酸 氨甲酰磷酸 尿苷磷酸化酶 Ura R1PPi U（尿苷） 尿苷激酶 UMP ATP ADP 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 Ura PRPPPPi （2）补救途径（salvage pathway） UMP CMP + NH3 2. 胞苷酸（CMP）的合成 嘧啶核苷酸补救合成途径（自学） 尿嘧啶+PRPP 尿嘧啶+1P核糖 尿嘧啶核苷+ATP UMP+PPi 尿嘧啶核苷+Pi UMP+ADP 补救途径 Cyt + PRPP CMP + PPi 胞苷激酶 CMP C ATPADP (胞苷) 嘧啶核苷酸生物合成的调控 脱氧核苷酸的合成脱氧核苷酸的合成 2、脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成 1、脱氧核苷酸的合成 硫氧还蛋白参与的核糖核苷酸的还原反应 核糖核苷酸还原酶 NADP+NADPH+H+ 硫氧还蛋白 还原酶 FAD ATP 、Mg2+ 硫氧还蛋白 （还原型） SH SH 硫氧还蛋白 （氧化型） S S O PPCH2 N OHOH 核糖核苷二磷酸 O PPCH2 N OHH + H2O 脱氧核糖核苷二磷酸 核糖核苷酸的还原反应 FAD 核糖核苷酸还原酶 ATP 、Mg2+ 硫氧还蛋白 SH SH 硫氧还蛋白 S S 硫氧还蛋 白还原酶 核糖核苷二磷酸 + H2O 脱氧核糖核苷二磷酸 FADH2 谷氧还蛋白 S S 谷氧还蛋白 SH SH NADP+ NADPH+H+ 谷氧还蛋 白还原酶 O PPCH2 N OH OH O PPCH2 N OH H GSSG2GSH 谷胱甘肽 还原酶 硫氧还蛋白参与的核 糖核苷酸的还原反应 核糖核苷酸还原酶示意图 底物特异性 调节位点 酶活性 调节位点 催化部位 B1亚基 B2亚基 UMPdTMP 要解决二个问题: （1）糖基的脱氧 （2）碱基的甲基化，先脱氧后甲基化，高等动物中 在DP水平上脱氧，在MP水平上甲基化 UMP UDP dUDP dUMP dTMP (O)+ CH3 脱氧胸苷酸（dTMP）的合成 脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成 胸腺嘧啶核苷酸合成酶 NADPH+H+SerNADP+Gly N5、N10CH2 FH4 FH2 二氢叶酸 还原酶 Ser羟甲基 转移酶 ON HN O dRP CH3 ON HN O dRP 核苷酸合成前体类似物与抗癌、抗菌药物 根据酶的抑制原理，在癌症的化学治疗或抗菌治疗中，往 往选用一些底物类似物（抗代谢物）抑制胸苷酸合成酶或二氢 叶酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如： 1、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、三甲氧苄氨嘧啶为叶酸类似物， 是二氢叶酸还原酶抑制剂，可抑制癌细胞和细菌生长； 2、5氟脲嘧啶、 5 氟脱氧脲嘧啶在体内可转化为5氟脱氧 脲嘧啶核苷酸为脱氧胸腺嘧啶核苷酸类似物，是脱氧胸腺嘧啶 核苷酸合成酶的自杀性抑制剂（suicide inhibitor） ，可作为抗 癌药物。 5氟脱氧脲嘧啶核苷酸作为胸苷酸合成酶 自杀性底物的机理 F O N HN O dRP S酶 F O N HN O dRP H S酶 F O N HN O dRP H CH2-FH4 胸苷酸合成酶、5-氟脱氧脲嘧啶核苷酸和亚甲基 四氢叶酸三元复合物的形成 叶酸和 四氢叶酸（FH4） 叶 酸 四 氢 叶 酸H H 10 5 N N5 5 ，N N10 10CH CH 2 2 FHFH 4 4 N N5 5 CHOFHCHOFH 4 4 CHCH 2 2 CHOCHO 一碳基团的 来源与转变 SS腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸 N N5 5 CHCH 2 2 FHFH 4 4 N N5 5 N N 10