中国药科大学生化设计性实验报告参考——生化101-05--菠萝蛋白酶.ppt

菠萝蛋白酶的提取与活力测定菠萝蛋白酶的提取与活力测定 班级：生化101 菠萝蛋白酶的概述 菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦 称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶 、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶 固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植 物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子 量为 33000 ，等电点为 9.55 。品质最佳 的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用 超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得 的。产品已被广泛应用于食品、医药等行 业。 1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面 团中，可使面筋降解，生面团被软化后易于 加工。并能提高饼干与面包的口感与品质。 2、干酪：用于干酪素的凝结。 3、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋 白质的大分子蛋白质水解为易吸收的小分子 氨基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的 精加工。 一、菠萝蛋白酶在食品加工业的 应用 二、菠萝蛋白酶在医药、保健品 业的应用 1、抑制肿瘤细胞的生长 2、对心血管疾病的防治 3、用于烧伤脱痂 4、消炎作用 菠萝蛋白酶的作用条件 最佳温度： 531 失活温度： 65 最佳PH值： 5.08.0 失活PH值： 小于3.0和大与9.5 推荐用量: 0.050.1%对蛋白质计 温度范围： 5060 作用PH值: 6.09.0 三、实验材料和试剂 1、实验材料 新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素C 单宁 0.1%EDTA 溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L 氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧 化钾调PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含 15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配 现用） 四、实验器材和仪器 1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（1cm 石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37）； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管； 实验原理 蛋白质与单宁作用可以发生沉淀反应,形 成单宁菠萝蛋白酶复合物，所以可以 用单宁提取菠萝酶。 五、实验操作方法法和步骤骤 （一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将下脚料切碎 加柠檬酸钠，榨汁 菠萝汁 纱布过滤 澄清液 2000r/min，7min离心 上清液 沉淀物酶复合物 酶复合物沉淀 （蛋白糊酶） 加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心 加100ml0.1%EDTA溶液 ，200ml1.5%氯化钠液 4200r/min,5min离心 加适量1.5%氯化 钠溶液， 4000r/min,7min 离心 冻存备用 超滤浓缩 在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度 为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时果汁的总酸 度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀 率达到72%。菠萝蛋白酶提取时,pH值为6. 5 8.5左右,温度为6 0,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可 作为最佳提取条件。 菠萝蛋白酶活力的测定 主值空白值 底物溶液（35） 酶溶液（35） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 混合，在35精确保温10min，加 蛋白质凝固剂 酶溶液 5.0ml 5.0ml 2.5ml 振摇，在水浴中继续静置30min，然后过滤；用 分光光度计（275nm）以空白值为参比测定吸光 度 计算酶的比活性 酶的比活性 （F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew0.11610） E275275nm处得吸光度 Ew每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg 0.116275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨 酸/10ml）的吸光度 10反应时间，min 实验中的注意事项 1.菠萝蛋白酶易受热失活，注意控制温度 2.某些化学药品和金属离子易引起菠萝蛋白酶失活 ，生产过程忌碱、忌强酸作用，勿与铁、铜等重 金属接触。 3.菠萝蛋白酶是一种胶体，生产过程中易产生气泡 造成损失，所以生产过程应注意操作。 4.所加酪蛋白溶液的量对实验结果有影响。需要多 次实验确定所加的量，避免反应不完全或蛋白剩 余，影响实验结果。 建议与改进 超滤法生产工艺和操作比较复杂，且设 备一次性投资大。浓缩滤液若再用单宁 沉淀法提取，可大大节约其他辅助原料 的用量，总生产成本减少且产品质量好 ，纯度高，酶活力高，酶活总回收率高 ，经济效益明显较好。 超滤法是指液体或气体混合物在外 界压力驱动下通过一种在其上布满 许多细微小孔（孔径在104