细胞融合实验报告.doc

山东大学实验报告 2015年 3 月 5 日姓名 班级 13级生命基地班 学号 同组者： 科目 细胞生物学实验 实验题目 动物细胞融合 【实验题目】 动物细胞融合【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法。2.学习化学融合的基本操作过程。3.观察动物细胞融合过程中细胞的行为与变化。【实验材料与用品】 1、材料 鸡血红细胞 2、试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsevers细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。 3、器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸、滴管等。【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括：病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。2、化学诱导融合 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。3、电激诱导融合 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。【实验步骤】 在本次实验中采用的是化学诱导融合的方法，利用PEG使鸡血红细胞发生融合。具体实验步骤如下：1、 取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4保存）【老师已做好，可直接使用】2、 取（1）中悬液1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理：在1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下离心5min，去掉上清液，再加入0.85%的NaCl溶液至5ml；1000-1200r/min下离心7min 【因时间关系此次实验只离心一次】3、将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml）加入GKN至1-2ml，使之成为10%的细胞悬液；4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个；5、分别取（4）1ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，编号分别为号溶液。在常温下2-3min后，显微镜下观察。【实验结果】 1、 实验中可观察到两个和多个细胞发生质膜融合现象,可看到不同融合状态的细胞： 两细胞的细胞膜相互接触、粘连； 接触部分的细胞膜崩解，两细胞的细胞质相同，形成一个细胞质的通道，呈现哑铃状； 通道扩大，两个细胞连成一体，呈现一个长椭圆形细胞； 细胞融合完成形成含有双核或者多核的细胞，呈圆形。 比较典型的细胞融合时的形态如下图： 初 步 接 触 融 合 图1 图2 图3细胞进一步融合 图4 图5 图6融合完成 图 7 图 82、 在三种不同浓度的细胞悬液中，所观察到的细胞发生质膜融合的比率不同，如下图所示： 图1： 1号溶液中细胞融合整体图像 图2： 2号溶液中细胞融合整体图像 图3： 3号溶液细胞融合整体图像【讨论与结论】1、 实验结果经过PEG的介导融合，鸡血红细胞中有少部分细胞发生了融合，且多处于融合刚开始的阶段。大部分细胞仍处于离散状态，另外，视野中还发现有细胞聚集成团的现象。另外，本次实验进行了细胞悬液三个不同浓度的融合实验，1ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+0.5ml50%PEG，0.5ml+1.0ml50%PEG，前两组的细胞融合率明显没有第三组的细胞融合率高，因此可以得出结论：在一定范围内，PEG的浓度越高，细胞融合率越高。另外，由于本次实验中的细胞悬液浓度偏低，因此无法直观的对前两组进行融合率的比较，但从理论上分析，在PEG浓度一定时应该是细胞浓度高的融合率高（细胞间的接触几率增大）。2、 结果分析本次细胞融合实验采用的是鸡血红细胞，鸟类红细胞存在细胞核，且细胞体积较大，易于实验观察。本次实验由于时间关系只进行了一次离心，而正常实验过程是要进行三次离心，目的是充分清洗细胞表面，使细胞接触面积达到最大，有利于细胞间的融合。每次离心前都要将样品小心混匀，否则有可能出现聚集成团的细胞。若视野中出现聚集成团的细胞，还有一种可能：制备的鸡血红细胞悬液浓度过高。视野中经常会看到两个或多个细胞接触在一起，此时不一定就是融合的细胞，需要转动细准焦螺旋对接触部分进行观察，通过观察接触部位细胞膜的有无判断其为融合细胞还是重叠在一起的细胞。本次实验采用的是PEG介导，融合效果受到以下几个因素的影响：PEG分子的分子量和浓度、PEG作用时间、融合温度、PH值。在一定范围内适当调节这些条件，可以将融合率提高。但在进行科研时还应考虑到，PEG分子对细胞存活的影响（PEG具有一定的毒性，且分子量越大毒性越大），因此取分子量800-1000较适合。1号试管中的细胞悬液出现类似血丝的悬浊物，可能是加入PEG之后没有及时混合均匀，细胞大量聚集。因此在加入PEG后先反应30s左右后小心混匀，否则会导致细胞融合不充分。且在加入时尽量避免震动。附：细胞融合的应用 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，可用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品。在培育动物新品种时，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科。 动物细胞融合技术对于研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。1、生产单克隆抗体 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。2、 用于基因定位和绘制人类基因图谱 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。3、 动物育种 体细胞核移植技术是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体。但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术做了良好的铺垫。4、细胞疗法 将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，而且也避免宿主对外来物的免疫排斥。5、植物细胞融合 植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，在生产研究应用方面，通过诱导不同种属间甚至不同科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂交植株。 植物细胞融合可以将细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀动物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质