鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法-毕业论.doc

武汉轻工大学学士学位论文武汉轻工大学毕业论文 论 文 题 目：鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法 Development of a HPLC for determination of florfenicol in chicken plasma 姓 名： 吕阳 学 号： 110703112 院 （系） 动物科学与营养工程学院 专 业 动物生物技术 指导教师 刘宇 2015年6月1日目 录摘 要1Abstract2第一章 绪 论31氟苯尼考的研究进展31.1氟苯尼考的药品信息31.2氟苯尼考的临床应用41.3氟苯尼考的检测方法52研究目的与意义63研究内容6第二章 试验研究71 材料与方法71.1试验材料71.2试验动物71.3试验方法72 结果与计算82.1波长选取82.1工作曲线102.2回收率与精密度102.4 HPLC检测图谱113讨论13第三章 结论与建议141 结论142创新点143有待进一步研究的问题14参考文献15致 谢1619摘 要 本文建立了鸡血浆中氟苯尼考含量的高效液相色谱检测方法，方法的线性范围为1.0200 g/ml，线性方程为y = 520000x + 170000（r =0.9994），回收率达到86.3%98.5%，方法的定量限最低为0.1 g/ml，日内与日间相对标准偏差均小于5%。本法的色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（4.6150 mm,5m），柱温为30，流动相使用乙腈：水=27:73（V:V），进样量10 L，流速1.0 ml/min，紫外检测波长为230nm。经验证，本方法具有简便快捷、定量准确，线性关系良好，回收率较高等优点，能够为氟苯尼考的药物代谢动力学研究提供定量依据和检测基础。关键词： 氟苯尼考，高效液相色谱，鸡AbstractThis paper established the chicken florfenicol in plasma of high performance liquid chromatography (HPLC) method, the linear relationship between the absorbance and concentration of tilmicosin was in the range of 1.0 to 200g/ml with a minimum detection limit of 0.1g/ml (r = 0.9997), the linear equation: y = 12674x + 16319, the recoveries ranged from 86.3% to 98.5%, the values of intra-day relative standard divination and inter-day relative standard divination were less than 5%.Waters 04590 Type Symmetry-C18 column (4.6 150 mm, 5m) was used in the analysis,a mixture of acetonitrile-water,at a flow rate of 1.0 ml/min was used as mobile phase, passing through the column at 30 . Ultraviolet detection was performed at the wavelength of 230nm. Key words: High Performance Liquid Chromatography,Florfenicol, Chicken 绪 论1 氟苯尼考的研究进展1.1 氟苯尼考的药品信息 氟苯尼考（florfenicol）1又称作为氟甲砜霉素，因为其拥有广泛的抗菌谱，在体内极易吸收，分布较为广泛，治疗剂量下未发现毒副作用，防治效果显著，对于敏感菌所引发的动物细菌性疾病具有极佳的治疗效果，广泛应用于养殖业中，是兽用药物中目前正在广泛推广使用的一种新型的氯霉素类的广谱抗菌药。现如今，氟苯尼考已经在水生动物、禽类、猪、反刍动物以及其他畜禽的细菌性疾病2的预防和治疗中广泛使用，目前我国已经通过了该药的审批。1.1.1 性状与结构 纯净的氟苯尼考的性状为结晶性粉末，白色或类白色，无臭。在通常情况下，在有机溶剂中溶解度较高，溶解在水中的剂型大多为混悬液。氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度极高，溶解于甲醇，溶剂为冰醋酸时略微溶解，水或氯仿时中的溶解度极低3。浓度为0.5%的氟苯尼考水溶液的酸碱度大约在4.56.5范围内4。市场上出售的氟苯尼考商品名称（国际通用）多数称之为Florocol和Nuflo5。氟苯尼考的化学式为C12H14Cl2FNO4S ，其相对分子质量为358.22，化学结构式6如图1：图1 氟苯尼考结构式1.1.2 药效学 氟苯尼考是属于氯霉素类的广谱抗菌药，与氯霉素（CHL）和甲砜霉素（THI）具有相同的作用机理和抗菌谱，它可以与细菌有效地特异性结合，能够通过降低相关酶的活性从而使肽链延伸受到抑制作用，进而干扰甚至丧失了细菌合成蛋白质的功能7。然而，结构的修饰与改造令氟苯尼考与CHL和THI相比，显著增强了安全性和有效性。在结构上，氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷链上第3个碳原子位置上的羟基，从而对菌体蛋白的乙酰化反应产生阻碍和抑制作用，进而使氟苯尼考不受相关酶的影响，避免了药物的灭活。因而，氟苯尼考不容易出现由质粒介导的耐药性，并且对于大量含有耐CHL基因的病原体，氟苯尼考依旧敏感。氟苯尼考对于大多数细菌都具有杀灭或抑制作用，同时对于厌氧的革兰氏阳性菌和阴性螺旋体，以及立克次氏体，阿米巴原虫等都具有较为显著的抗菌作用5。1.1.3 药动学氟苯尼考在机体内见效快，持续时间长。根据研究者的试验得出，肌肉注射氟苯尼考1小时以后，血液中的药物浓度可以达到治疗浓度，13 小时后便可以达到高峰期的血药浓度。只需一次给药，有效的血药浓度便可以维持4872小时以上，并且不会出现骨髓抑制和再生障碍性贫血的危害。氟苯尼考在体内分布广泛，能够透过血脑屏障来抑制和治愈动物细菌性脑膜炎，相比于其他的抗菌药，氟苯尼考可具有极强的治疗效果。在机体内，部分器官的氟苯尼考药物浓度较高，血药浓度可以达到治疗效果，主要经过肝脏、肾脏代谢，少量的药物可以随粪便由体内排出。根据动物的种类和给药方式的不同，氟苯尼考的药物代谢动力学会有略微差异。1.1.4 耐药性 由于临床上氟苯尼考的使用方法不当，如今已经开始出现氟苯尼考的耐药菌株，应该即刻引起人们的广泛关注。1996 年，Kim 等研究人员第一次发现并且命名了一种能够耐氟苯尼考的基因pp-Flo，根据DNA的序列分析显示得出，pp-Flo基因有47.4%的几率与非酶介导的导氟苯尼考耐药基因为同源基因。在此之后，研究者又陆续地克隆出了多种不同的氟苯尼考的耐药基因，主要是从沙门氏菌、大肠杆菌以及葡萄球菌属中得到，包括Flo、Flor、FexA 和Cfr等基因。总体来讲，根据目前的研究结果，主要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr 和pp-Flo9这五种可以耐氟苯尼考的基因。1.2 氟苯尼考的临床应用氟苯尼考如今已经广泛投入使用在各种水生动物（包括鱼、虾、蟹、鲍、贝等在内）的养殖业中。氟苯尼考可以显著地预防和治疗各种急性、慢性的细菌性疾病，例如黄尾鱼的假核性巴氏杆菌病及链球菌病、大西洋鲑鱼疖病9、黄尾鱼巴氏杆菌感染、鳗迟钝性爱德华氏菌感染、以及鲑杀鲑弧菌性感染10等。 在猪的养殖业中，在预防和治疗猪喘气病、胸膜肺炎与沙门氏菌病，包括大肠杆菌性下痢、萎缩性鼻炎以及猪丹毒、猪肺疫和无乳综合症等在内的疾病中，氟苯尼考具有显著的防治效果。对于猪胸膜肺炎放线杆菌，氟苯尼考的最小抑菌浓度（MIC）的范围在0.201.56 g/mL之间，它对于猪胸膜肺炎放线杆菌的最佳抑菌浓度是0.39 g/mL。相比较于阿莫西林（AMX）以及恩诺沙星这两种药物，氟苯尼考对猪链球菌病的治愈率11明显的高于二者。氟苯尼考同样广泛地用于预防和治疗牛的细菌性疾病2 ,且防治效果是其他同类药物所不能及。氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系统疾病12 、牛肠炎13 、牛无名热14。单独使用氟苯尼考时，可以明显地抑制溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌三种引发牛呼吸道疾病的主要病原体，能够显著地治疗牛的呼吸道感染疾病15。值得一提的是，各成长阶段的肉牛都能够使用氟苯尼考的注射剂。目前，氟苯尼考在禽类养殖业的细菌性疾病防治中占有着举足轻重的地位。根据研究者的试验证明，按照15的比例，药物浓度50 g/mL来配伍甲氧苄啶（ TMP ）和氟苯尼考两种药物，即每毫升的药液中含有氟苯尼考42 微克，甲氧苄啶8 微克，可以极佳的治愈鸡的大肠杆菌病16。每12 小时以2040 g/kg的剂量肌肉注射给药或者口服给药氟苯尼考一次，连续使用三天，能够很好的治疗鸡的多杀性巴氏杆菌病，且效果较为明显17。使用氟苯尼考可显著地预防和治疗鸭的传染性浆膜炎，试验表明，将氟苯尼考用于同一种群中出现临床症状的病鸭，传染性浆膜炎的治愈率平均可以达到96.8%；将氟苯尼考用于同一种群中尚未出现临床症状的鸭种（假定健康鸭），其传染性浆膜炎的平均预防有效率达到了97.1%18。如果使用氟苯尼考与多西环素（DOX）的复方制剂，效果相当于甚至高于单独配方的氟苯尼考可溶性粉19。该复方制剂能够有非常效地抑制鸡的大肠杆菌感染且缓解病鸡的临床症状，并可以显著降低鸡由大肠杆菌感染引起的发病和死亡的几率，且在一定程度上，该制剂可以减少成活鸡的体重下降。1.3 氟苯尼考的检测方法目前，用于检测动物性食品中氟苯尼考含量的方法主要使用气象或液相色谱与色谱质谱联用法，其中高效液相色谱法与液相色谱-质谱联用法最为广泛。当然，根据条件、目的、用途的不同，目前也常用其他的氟苯尼考检测方法，其中主要有电位法、分光光度法、酶联免疫吸附法（ELISA）、胶束电动毛细管色谱法等。1.3.1 气象色谱（GC）与液相色谱法（LC）使用GC与LC法进行氟苯尼考的含量测定时，提取样品中氟苯尼考的药物残留的主要提取液通常使用乙酸乙酯与甲醇、以及乙腈和丙酮等有机溶剂，其中，乙酸乙酯的提取效率最高19。常用的固相萃取柱有C18柱20、HLB柱19、MCX柱21或Florisil柱22等。在使气象色谱法分析之前，需要进行样品前处理反应-硅烷化和酰化，以此来生成热稳定性强并且容易挥发的衍生物，通常需要使用氢火焰离子检测器（FID）或者电子捕获检测器（ECD）23来检测衍生化反应完成之后的样品，。使用液相色谱法检测时，色谱柱通常使用的是C18柱，检测器通常使用二极管阵列检测器（PDA）19、紫外检测器（UVD）20或者荧光检测器（FLD）21。相比于其他的分析方法，高效液相色谱法操作简便，定量准确，结果稳定且消耗时间短，但同时该方法具有灵敏度不高，并且无法提供待测物的结构信息的缺点。1.3.2 气象色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）气象色谱-质谱联用法与气象色谱法一样，需要进行衍生化过程，但需要避免水分的出现，水的存在会降低衍生化的效率，生成的产物不稳定。因此，使得GC-MS法的前处理过程极为复杂。与之相比，液相色谱-串联质谱联用法具有灵敏度高、选择性好、定量准确以及简便快捷、抗干扰的优点，是氟苯尼考含量较为理想的检测方法。使用液相色谱-串联质谱联用法分析不同基质的样品时,有时会出现对基质的抑制作用。故而，使用LC-MS/MS检测时，定量方法的需要使用内标法，也可以采用以基质来匹配标准曲线的法方法来, 通过此方法可以提高LC-MS/MS分析方法的准确度和精密度24。然而，液相色谱-串联质谱联用法的仪器并不普遍，且成本较高，无法得到普及。1.3.3 其他方法a.电位法电位法要将样本在乙醇中溶解，再加入氢氧化钠溶液进行加热回流，经稀释以后，加入稀硝酸，然后使用银-玻璃电极进行滴定。电位法是电化学分析领域的主要研究方向之一，该方法定量稳定而准确，但由于其消耗时间过长，操作较为繁琐，不适合快速的分析检测。b.分光光度法 由于氟苯尼考在紫外光区具有吸收的特性，可以通过浓度与在特定波长处氟苯尼考的光吸收度的之间的关系，来计算和分析动物性食品中残留的氟苯尼考的含量。使用分光光度法检测分析操作简便，消耗时间短，但由于干扰因素比较多，造成分光光度法的准确度较低，并且专属性较差。c.酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种优秀可靠的分析检测方法，该方法的理论基础是应用了抗原与抗体具有可逆性的特异性结合反应，效果明显。近几年来，国内市场已经发行了试剂盒应用于氟苯尼考的含量测定，这些试剂盒的灵敏度较高，检测浓度最低可以达到0.5ppb。酶联免疫吸附法具有着灵敏度高、特异性强、并且操作简便、耗时较短，定量与结果准确而稳定等特点和优点，可以适用于氟苯尼考含量的大批量的、快速的检测。但值得一提的是，该方法需要进行抗原与抗体的阳性确定。d.胶束电动毛细管色谱法 胶束电动毛细管色谱法是通过在缓冲溶液中加入各种表面活性剂，从而形成带电荷的胶束。胶束电动毛细管色谱法把色谱技术与电泳技术有机结合起来，吸取了两种方法的优点。该方法既克服了毛细管区带电泳法（CZE）难以分离中性离子的不足，又能弥补高效液相色谱法（HPLC）无法同时测定复杂成分中的中极性粒子和非极性粒子的缺陷，能够在较短时间内完成复杂组分的分离测定。2 研究目的与意义 根据目前的研究，关于氟苯尼考含量的检测方法，检测的对象大多为水产动物、猪、牛等，鸡血浆中氟苯尼考含量的检测方法国内未见报道，国外报道大多数采用的是气象色谱-质谱联用法（GC-MS）和液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS），但是这两种方法对色谱仪器的要求与条件较为严格，检测的成本较高，不利于推广。为此，本文通过改进国外方法，建立鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测方法，可以为开展对氟苯尼考在鸡体内的药物代谢动力学研究提供定量方法，可以为使用氟苯尼考治疗鸡的细菌性疾病提供科学理论依据。3 研究内容 建立鸡血浆的样品前处理方法和鸡血浆中氟苯尼考的HPLC测定方法。试验研究1 材料与方法1.1 试验材料仪器： Waters 1525高效液相色谱分析仪（配Waters 2475荧光检测器，2497检测器，717 自动进样器）（美国Waters公司）； PHS-3C型精密pH计； 电子分析天平； 氮气吹干仪(上海济成分析仪器有限公司)； 冷冻离心机Biofuge Stratos； TGL-16C型高速离心机（德国Heraus公司）； 抽滤瓶（滤膜0.45m）； 滤器（0.225m）； Jcx-50G超声波清洗机（山东济宁超声电子仪器厂）；药品： 氟苯尼考标准品, 99.76 % （Schering-Ploug h公司） 乙腈，色谱纯 ； 乙酸乙酯，色谱纯 ； 氢氧化钠，分析纯 ； 磷酸，分析纯；（北京鹏彩精细化工有限公司）；1.2 试验动物肉鸡，购自三益家禽育种有限公司分两组进行实验，每组三只重量：均重2kg1.3 试验方法1.3.1 色谱条件及流动相本方法的色谱柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（ 4.6150 mm，5m），柱温保持30，使用230nm作为检测波长，使用乙腈与水混合作为流动相，乙腈：水=27：73（V:V），流速为1.0 mL/min，进样量设定为10 L。使用0.225 m滤膜过滤。 1.3.2 给药与样本采集 以5mg/kg的剂量在鸡的腋下肌肉注射给药，给药后分别在0,2,4,6,12h于翼下静脉采血2-3ml，置于经由1%的肝素钠润洗的离心管中，以2000r/min的转速离心10min之后，吸取上层血浆液置于塑料管中，在20下冷冻保存待用。1.3.3 样本处理 量取1 ml血浆于15 ml离心管； 加1 ml 0.1mol/L pH7.0的磷酸缓冲液, 旋涡混匀； 加4 ml乙酸乙酯,6000r/min离心15min，吸取上层置于10 ml离心管； 重复上一步，提取并合并； 50 水浴氮气蒸发吹干； 加入流动相1ml, 旋涡混匀； 吸入1.5 ml的 Eppendorf 管, 13000r/min离心20 min； 吸取上层清液于2ml棕色进样瓶，进样10l 进行检测。1.3.4 检测波长 氟苯尼考原料和制剂的紫外检测波长已见采用223、224、225、226 、230、254和 262nm等几种。鉴于短波长易受各种因素干扰，230nm可满足对本品的含量测定要求。本方法选用230nm作为检测波长，在这一波长下，辅料对氟苯尼考测定的干扰程度最小。不同波长的色谱图见图2、图3、图4、图5、图6和图71.3.5 工作液的配置及工作曲线的绘制 取空白组的鸡血浆5份，分别加不同体积的氟苯尼考储备液于血浆中，使血样浓度依次为1，2.5，25，50，100，200 g/mL，按1.3.3进行血样处理，绘制工作曲线。1.3.6 数据测定a.检测限与定量限：取空白的鸡血浆五分，按“1.3.3 血浆样品前处理方法”处理样品，再按1.3.1 的条件进行高效液相色谱测定，测得基线噪音值，之后求其平均值。b.准确度与精密度：取空白的血浆三分，分别加不同体积的氟苯尼考储备液于血浆中，使血样浓度分别为50，100，200 g/mL，按照“1.3.3样本处理”的方法进行样品的前处理过程，计算回收率。各浓度的标准液需在同一天内重复测定5次，日间连续测定3天，计算色谱峰面积的日内、日间相对标准偏差（RSD）2 结果与计算2.1 波长选取不同波长的色谱图如下图2 氟苯尼考色谱图（223nm）图3 氟苯尼考色谱图（224nm）图4 氟苯尼考色谱图（225nm）图5 氟苯尼考色谱图（226nm）图6 氟苯尼考色谱图（230nm）图7 氟苯尼考色谱图（254nm）图8 氟苯尼考色谱图（262nm） 经考察，本法选用230nm作为色谱检测波长，在这一波长下，辅料对氟苯尼考测定的干扰程度最小。2.2 工作曲线用1.3.4方法进样检测，并用建立坐标系，进行线性回归，横坐标为待测物氟苯尼考的浓度，纵坐标为待测物氟苯尼考的峰面积。计算得出，直线的回归方程为y = 520000x + 170000，相关系数r = 0.9994。此方法的定量限为0.1 g/mL。根据这一结果可以得出，在1200 g/mL的范围内氟苯尼考的浓度与峰面积的线性关系良好。氟苯尼考的工作曲线见图9。图9 氟苯尼考工作液峰面积与浓度的关系2.3 回收率与精密度按照处方的物料配比，精确称取氟苯尼考对照品，加入处方比例的辅料，并混合均匀。取混合测试样，配80,100,120 g/mL 3种浓度水平的溶液，按供试品测定方法测定氟苯尼考浓度，重复测定3次，与氟苯尼考标准品溶液比较，按外标法计算方法回收率，结果表明：氟苯尼考在鸡的血浆中的回收率为86.3%98.5 %。结果见表1。 表1 血浆中氟苯尼考的回收率（n = 5）添加浓度（g/mL）平均实测浓度（g/mL）平均回收率（%）8085.786.310095.398.5120104.987.5按1.3.6“精密度测定”项进行样品分析，测得了日内与日间的相对标准偏差（RSD）。结果见表2。表2 血浆中氟苯尼考的日内、日间RSD2.4 HPLC检测图谱通过对流动相的组分与比例，以及柱温、检测波长等方面来进行色谱条件的优化，确定了测定样的色谱条件。氟苯尼考0,2,4,6,12h采集的样本溶液的检测图谱见图3-7。根据结果显示，氟苯尼考在约为5.6-6 min的时间内保留，药物色谱峰的峰形良好，没有明显的干扰峰出现。图10 0h血样的检测图谱图11 2h血样的检测图谱图12 4h血样的检测图谱图13 6h血样的检测图谱图14 12h血样的检测图谱3 讨论本试验采用离心、过滤、氮吹的方法进行鸡血浆的样品前处理，操作简单快捷，且回收率较高。采用高效液相色谱法来测定鸡血浆中氟苯尼考的含量，根据测定结果表明，方法的准确度高、精密度好。 本方法简便快捷，重现性良好、灵敏度较高、样品的回收率高，样品测定过程使用的时间较短。鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱检测法的最低检测限为0.1 g/mL，非常适合用于氟苯尼考在鸡体内的药物代谢动力学研究。结论与建议1 实验结论本试验建立了用高效液相色谱法测定氟苯尼考的方法，使用高效液相色谱仪，仪器较为普及，血样处理的操作简便易行，干扰因素较少，回收率较高，具有良好的实用性。本方法的线性范围为1.0200 g/mL（r = 0.9997），线性方程：y = 12674x+ 16319，最低定量限0.1 g/mL，方法的回收率为86.3 98.5%，日内、日间相对标准偏差均小于5%，可以为氟苯尼考在鸡体内的药物代谢动力学研究提供检测基础。2 创新点本试验建立了适用于鸡血浆中氟苯尼考的高效液相色谱法测定方法，方法简便且操作性强，为其在兽医临床上的药代动力学及其他应用研究打下坚实的基础。3有待进一步研究的问题根据建立的鸡血浆中的氟苯尼考的检测方法，进行实际样品中氟苯尼考的检测以及在鸡体内的药物代谢动力学研究。参考文献1 FDA. 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