课件：心房纤颤患者血栓前状态及心房电重构的实验研究在职博士研究生孙燕淑.ppt

,心房纤颤患者血栓前状态及 心房电重构的实验研究,在职博士研究生：孙燕淑 导师：汪丽蕙教授 祁芸芸教授 北京大学第一医院,前 言,前 言,心房纤颤是常见的心律失常 房颤并发的以缺血性脑卒中为主的血栓栓塞严重危害人类健康和生命 血栓前状态（PTS）作为一种重要的临床现象近年来受到国内外学者的广泛关注 及时识别PTS，确定房颤患者中的高危人群，将有助于预防和减少栓塞事件的发生,本研究提出房颤患者的PTS，并通过检测房颤患血浆中PTS分子标志物的水平，探讨房颤患者PTS的形成机制，寻找评估房颤患者栓塞危险性的新手段，以指导抗凝治疗。,前 言,心房纤颤具有自身延续性，慢性房颤的发生与维持似乎与房颤本身有关。据此，Allessie等提出了房颤引发房颤的观点。 在房颤的持续过程中，房颤本身可导致心房电生理学特性的变化，即心房电重构（AER）。 研究表明，在AER中心房肌细胞内钙超负荷起了重要作用 肌浆网钙泵在调控细胞内Ca2+浓度方面起决定作用,前 言,本研究采用RT-PCR方法，通过在分子生物学水平测定心房肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase的mRNA表达，探讨房颤患者AER的机制，以加深对房颤本质的认识，从而使房颤预防和治疗的新的方法成为可能。,前 言,第一部分,房颤患者血浆中PTS分子标志物的测定,材料与方法,一、研究对象及分组情况,1. 房颤组：共29例，男17例，女12例。年龄3978（62.410.5）岁，为我院住院或急诊留观的非瓣膜病Af患者。Af由多次ECG诊断。根据Af性质又分为： 1.1 持续房颤组：18例。年龄3979（64.111.0）岁，Af发作持续时间均3个月。 1.2 阵发房颤组：11例。年龄4274（59.69.5）岁，均在Af发作期，且发作时间均48小时。 2. 对照组：共26例，男16例，女10例。年龄4585（60.911.8）岁，均为窦性心律者。,（1）,房颤组与对照组的所有入选对象均除外心绞痛、心肌梗塞，心电图及Holter均未见缺血性改变。无明显高脂血症、无糖尿病、脑梗塞、心功能不全及肿瘤。房颤组有11人服抗凝药，为巴米尔0.1Qd或抵克利得0.25Qd，对照组均未服用抗凝药。,一、研究对象及分组情况,（2）,二、主要设备及制剂 （1）,1.主要仪器、设备 流式细胞仪 美国Becton-Dickinson公司 酶标仪 美国 光度计 美国 恒温水浴箱 上海医疗器械厂 水平混合器 江西医疗器械厂 50200l八通道加样器 100200l，10、25、50、100、500l加样器,2.试剂 CD61抗体 美国Becton-Dickinson公司 PAC-1抗体 美国Becton-Dickinson公司 鼠IgM 美国Becton-Dickinson公司 FITC荧光染料 美国Becton-Dickinson公司 1%多聚甲醛 血栓调节蛋白ELISA法试剂盒 美国ADI公司 牛血清白蛋白（BSA） 美国Sigma公司 0.5M H2SO4 酶标TAT微孔板 美国 D-二聚体ELISA法测定试剂盒 美国,二、主要设备及制剂,（2）,三、实验方法,血浆血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)水平的测定 全血法流式细胞术,标本制备：粗针头取空腹静脉血2.7ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。对照管及测定管各加血5l， 然后各加CD6110l。测定管中加PAC-1 10l，对照管加鼠IgM10l，混匀。避光20分钟。1%多聚甲醛1ml固定。 测定：用流式细胞仪检测样本。检测结果用特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率，即GPIIb/IIIa阳性血小板的百分数表示。,血浆血栓调节蛋白（TM）水平的测定 ELISA法 血浆凝血酶-抗凝血酶III复合物（TAT）的测定ELISA法 血浆二聚体D（D-dimer）的测定ELISA法,三、实验方法,TM标准曲线,Y=0.55+0.64lnX,TAT标准曲线,Y=0.18+0.02X,D-dimer标准曲线,Y=0.175+0.002X,统计学处理,应用SPSS For Windows 8.0软件，数据以均数标准差表示，各组数据分别进行独立样本t检验，方差分析，单变量相关分析，回归分析等统计学方法。取0.05为统计学差异有显著性。,结 果,入选对象共55人，其中房颤组29人，对照阻26人。房颤组又分为：持续房颤组18人，阵发房颤组11人。,入选者的一般情况,*房颤组vs对照组P0.05,入选者的一般情况,房颤组GPIIb/IIIa测得值明显高于对照组，差 别具有高度统计学意义(P0.01),房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化,表2. 房颤组与对照组GPIIb/IIIa比较,*房颤组与对照组相比P0.01,房颤组与对照组血浆GPIIb/IIIa比较,持续房颤组的GPIIb/IIIa水平明显高于阵发房颤组，差别有高度显著性(P0.01)，,房颤患者血浆GPIIb/IIIa的变化,表3. 持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较,*持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01,持续房颤组与阵发房颤组GPIIb/IIIa比较,各组之间GPIIb/IIIa比较,房颤时间与GPIIb/IIIa水平的相关性,房颤患者血浆TM水平的变化,表4. 房颤组与对照组血浆TM水平比较,*房颤组与对照组相比P0.01,与对照组相比，房颤组的血浆TM水平显著升高，两者差别有统计学意义(P0.01),房颤组与对照组血浆TM水平比较,房颤患者血浆TM水平的变化,表5. 持续房颤组与阵发房颤组血浆TM比较,*持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01,持续房颤组的TM水平高于阵发房颤组，差异有显著性(P0.01),持续房颤组与阵发房颤组TM比较,房颤患者血浆TM水平的变化,表6. 阵发房颤组与对照组血浆TM水平比较,*持续房颤组与阵发房颤组相比P0.01,阵发房颤组的TM水平较对照组高，差别有统计学意义(P0.05),各组之间血浆TM水平比较,表7. 房颤组与对照组血浆TAT水平比较,*房颤组与对照组比P0.05,房颤患者的血浆TAT水平比对照组有所升高，二者差别有显著性(P0.05),房颤患者血浆TAT水平的变化,房颤组与对照组血浆TAT水平比较,表8. 持续房颤与阵发房颤组血浆TAT比较,*持续房颤与阵发房颤组比P0.05,持续房颤组与阵发房颤组比较，其TAT值无显著差异(P0.05),房颤患者血浆TAT水平的变化,表9. 阵发房颤组与对照组TAT水平比较,*阵发房颤组与对照组比P0.05,阵发房颤组与对照组相比，血浆TAT水平高于对照组，但差异无显著性(P0.05),房颤患者血浆TAT水平的变化,各组之间血浆TAT水平比较,# &,*,# P0.05 & P0.05,表10. 房颤组与对照组血浆D-dimer水平比较,*房颤组与对照组相比P0.05,房颤组与对照组相比，血浆D-dimer水平升高，但二者差异无统计学意义(P=0.06),房颤患者血浆D-dimer的变化,房颤组与对照组血浆D-dimer比较,*,* P0.05,表11. 持续房颤组与对照组血浆D-dimer水平比较,*持续房颤组与对照组相比P0.05,持续房颤组血浆D-dimer水平比对照组明显升高，差别具有显著性（P0.05）,房颤患者血浆D-dimer的变化,持续房颤组与对照组血浆D-dimer比较,表12. 各组血浆D-dimer水平比较,*阵发房颤组与对照组相比P0.05 #持续房颤组与阵发房颤组相比P0.05,持续房颤组的D-dimer水平较阵发房颤组高，但差别无显著性(P0.05)；阵发房颤组的血浆D-dimer水平较对照组高，但差别亦无显著性(P0.05),房颤患者血浆D-dimer的变化,各组之间血浆D-dimer水平比较,房颤患者心房心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase mRNA的基因表达,第二部分,材料和方法,入选者均为我院及安贞医院心外科行换瓣术和冠脉搭桥术的病人，共28例。标本于术中取材于心房或心耳组织。根据有无房颤分为： 1. 房颤组：15人，其中男9人，女6人。年龄3567(48.138.07)岁，均为持续房颤患者，且房颤持续时间均3个月。 2. 对照组：13人，其中男8人，女5人。年龄3467(51.0811.89)岁，均为窦性心律者，且既往无心律失常病史。 两组之间年龄、性别无显著差异（P0.05）。,病人来源及分组,高速恒温离心机RC5C 德国Dupont 公司 低温离心机J6-B 美国Beckman 公司 UV-2100紫外分光光度计 日本岛津公司 PE2400 PCR仪 美国 激光图像分析仪 瑞典Pharmacia 公司 电泳仪 北京科普仪器厂 10l、20l、200l及1000l加样器,主要设备,异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate） GiBCO公司 十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl） 美国Sigma公司 -巯基乙醇 美国Sigma公司 重蒸酚 岳泰公司 逆转录酶（M-MLV） 美国Promega公司 dNTPs 美国Promega公司 随机引物 美国Promega公司 焦碳酸二乙酯（DEPC） 美国Sigma公司 Taq聚合酶 华美公司 Taq(Buffer E ) 华美公司 其余均为国产分析纯,试剂、药品,实验方法,RT-PCR,实验步骤,反应过程： RNA 2g 随机引物 2l 70反应5分钟后立即将管取出并置于冰浴中，加入以下试剂： 5转录酶缓冲液 5l dNTP(10mM) 1.25l M-MLV(200u/l) 1l 加DEPC水至总体积25l 混匀后于37逆转录反应1小时。 75反应10分钟使酶灭活。,一步法提取总RNA RNA逆转录,PCR（1）,引物序列 肌浆网Ca2+-ATPase： 正义链 5 TTGCATTGCAGTCTGGATCA 反义链 5 TCCAAAGCAGAGTCATTACA 合成片段长度为477bp -actin（对照）： 正义连 5 ATCTGGCACCACACCTTC 反义链 5 GCCAGGTCCAGACGCA 合成片段长度288bp,PCR（2）,反应体系（50l） 10聚合酶缓冲液 5l dNTP(10mM) 1l 引物（-actin、Ca2+-ATPase）上游 12.5pmol 下游 12.5pmol DNA 1l Taq酶(3u/l) 0.5l 加水至总体积50l,PCR（3）,反应条件及循环参数 945min9430s5730s7245s727min 30cycles PCR产物行电泳及染色后采用激光图像分析仪测定条带积分光密度（IOD）,统计学分析,采用SPSS For Windows 8.0统计学软件，数据均以均数标准差表示，各组数据按样本性质分别进行t检验，方差分析等，取P0.05为有统计学差异。,结 果,房颤组房颤时间均大于3个月，对照组均为窦性心律者，且既往无心律失常史。,*房颤组与对照组比较P0.05,两组一般情况比较,*与对照组相比P0.05,两组心房肌浆网Ca2+-ATPase mRNA表达量的比较,房颤组与对照组肌浆网Ca2+ -ATP酶 mRNA表达量比较,*两组相比P0.05 (P=0.13),不同取材部位的标本Ca2+_ATPase mRNA表达量的比较,*两组相比P0.05 (P=0.86),不同性别的标本Ca2+-ATPase mRNA表达量的比较,房颤组与对照组肌浆网Ca2+ -ATP酶 mRNA表达量比较,讨 论,讨 论（1）,房颤患者血浆GPIIb/IIIa水平的变化 房颤患者血浆TM水平的变化 房颤患者血浆TAT及D-dimer水平的变化 检测房颤患者血浆中PTS分子标志物的意义,讨 论（2）,细胞内Ca2+超负荷与心房电重构（AER） 房颤患者肌浆网Ca2+ -ATP酶 mRNA水平变化与细胞内Ca2+超负荷的关系 房颤的离子通道重构及其分子机制 细胞内Ca2+超负荷对房颤离子通道重构的影响,结 论,结 论（1）,房颤可引起内皮细胞功能的损伤和血小板激活，血小板激活程度与房颤的持续时间呈正相关 房颤可激活全身凝血系统，并引起继发纤溶亢进 房颤患者处于血栓前状态（PTS） 检测房颤患者血浆中PTS分子标志物水平可成为评估房颤患者栓塞危险性的手段之一。这对指导抗凝治疗，减少栓塞事件的发生有重要意义,结 论（2）,持续房颤患者心房心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase的mRNA表达下调，导致肌浆网钙泵对Ca2+的摄取减少。这加重了房颤患者细胞内Ca2+超负荷 细胞内Ca2+超负荷及与其相关的膜离子通道重构是心房电重构（AER）的主要机制,致 谢,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,后面内容直接删除就行 资料可以