师范学院毕业论文(设计).doc

漳州师范学院毕业论文 (设计)多吡啶铜配合物在电化学传感器中的应用multi-copper complex Application in Electrochemical Sensor朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典可翻译 50 多种语言 miracoloso Je parle un petit peu franais. hoje est ensolarado escargots Es ist sehr interessant! Buongiorno Principessa! Ich bin vierzig Jahre alt dti Je ne sais pas ! nazdar! ! hello rouge Cmo ests? . La voiture mijn vriend haydi gidelim Wie bitte? Wie heien Sie? Vr s snill Wie gehts? Pardon ? s t Hjelp! 姓名 吴星星 学号 070601103 系别 化学与环境科学系 专业 化学 教 育 年级 07级 指导老师 倪建聪 2011年5月摘要 转基因植物(GMP)是基因工程技术的快速发展的产物，在其造福人类的同时，也带来了安全性问题和潜在的环境危害。因此加强对转基因植物产品准确和快速检测以达到安全性评估显得尤为重要，DNA 电化学传感器为这种检测提供了可能。DNA 电化学传感技术具有简单、可靠、价廉、灵敏和选择性好等优点。金属配合物作为杂交指示剂具有合成简单、种类繁多、光电信号灵敏和可控功能修饰等优点，已在电化学生物传感器研究中被广泛使用。在本文中，我们采用电化学法详细研究了这些配合物与单链DNA(ssDNA)和双链DNA（dsDNA）的识别作用。通过电化学生物传感器，将转基因植物产品的基因探针固定在电极表面，并选用对ssDNA 和 dsDNA具有识别功能的金属配合物作为杂交指示剂对目标序列进行了检测。ABSTRACTGenetically modified plants (GMP) are the product of the rapid developing genetic engineering. While bringing benefit for mankind, it also brings security issues and potential environmental hazards. Therefore, in order to achieve safety assessment ，strengthening accurate and rapid detection of transgenic plant products is , and DNA electrochemical sensor provides the testing possibility. DNA electrochemical sensor technology is of simple, reliable, cheap, well sensitivity and selectivity. As hybridization indicators, metal complexes have simply synthesizing, variety, sensitivity photoelectric signal, and controlled features modification, etc. and has been widely used in biosensor research.In this paper, we studied the recognition effect between these complexes and single-stranded DNA (ssDNA) and double-stranded DNA (dsDNA) in detail by electrochemical method. Through the biosensor , gene probe of the transgenic plant products was fixed on the electrode surface, and the metal complexes recognizing ssDNA and dsDNA were used as hybridization indicators for detecting the target sequences关键词 过渡金属配合物 DNA 探针 电化学传感器 玻碳电极 杂交指示剂目 录中文摘要英文摘要1 前言2 实验部分2.1试剂和仪器2.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与dsDNA 相互作用的电化学研究2.2.1 玻碳电极的预处理2.2.2 吸附法制备DNA修饰玻碳电极2.2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 dsDNA 和 ssDNA 在电极表面的相互作用2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作为杂交指示剂检测CaMV35S的研究2.3.1 S1 探针在玻碳电极上的固定及与S2 的杂交2.3.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集及电化学检测3 结果与讨论3.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 ssDNA 和 dsDNA 在电极表面的相互作用3.1.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 ssDNA 和 dsDNA 的不同结合属性研究3.1.2扫描速率影响3.1.3 富集时间影响3.1.4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 从DNA修饰电极上的解离动力学研究3.2 GCE修饰电极电化学表征3.3 基因靶序列的定量检测3.4 传感器的选择性4 小结参考文献附录致谢1 前言电化学DNA生物传感器是上世纪九十年代发展起来的一种全新的基因检测技术，属于功能性生物传感器的一种1。其通常由一个支持ssDNA片段(探针)电极和检测用的电化学活性杂交指示剂构成，检测原理如图1所示。由于ssDNA与其互补靶序列杂交具有高度的特异选择性，使得这种 ssDNA 修饰电极呈现极强的分子识别功能。在适当的温度、酸碱度和离子强度条件下，电极表面的DNA探针链与靶序列发生杂交反应，形成 dsDNA ，从而导致电极表面结构的变化。因为杂交后形成的 dsDNA 在电极表面上的电化学信号较差，因此选择一种能够区分 dsDNA 和 ssDNA 结构差异的电活性指示剂能够大大提高检测杂交过程的灵敏度。图1 电化学DNA杂交传感器的工作原理1 Figure 1 The principle of an electrochemical DNA hybridization biosensor1与目前常用的基因检测方法，如光谱法2-3，聚合酶链式反应(PCR)法4-7和放射性同位素标记法8-9等相比，电化学检测在快速、灵敏、简便、无毒、低成本和活体检测应用等方面具有无可比拟的优势10-13。电化学杂交指示剂是DNA杂交电化学传感器的重要组成元件，能为杂交过程提供可测的电化学信号。因配合物具有许多光学、电学优良特性，目前作为一类对 ssDNA 和 dsDNA 具有识别能力的小分子也越来越受到重视，另外因为金属配合物种类多且可根据需要对配合物的配体和中心离子进行简单、可控的修饰和变换都位配合物在优秀杂交指示剂上的应用具有广阔的前景。 1994年，首例转基因植物产品-耐贮存番茄进入市场，1996 年后转基因植物的产业化迅速发展，势不可挡。至 2005 年在全球 21 个国家转基因植物推广应用总面积达到9000 万公顷， 1996 年至 2005 年十年间全球转基因作物种植面积增长近 53 倍，累计种植面积已达 4.746 亿公顷(合 71.19 亿亩)，相当于我国耕地面积的 3.75倍。所谓转基因植物，就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到需要改良的生物体的基因组中，使之产生新的性状，如抗虫、抗病、抗旱、抗寒、高产、优质等，从而达到改造生物的目的。转基因技术实质上是传统育种方法的延伸，其本质与传统常规杂交育种相同。传统的常规育种一次转移的是成千上万个不同植物品种甚至不同植物种类的基因；而基因工程只是转移一个或数个基因，且更为准确、更具预见性和高效率。 2 实验部分2.1 试剂和仪器 天然双链鲱鱼精子 DNA(dsDNA) 购自北京精科试剂公司，使用前未做进一步处理。天然DNA储备液的配制及浓度确定为1 g/ L。所有电化学和光谱实验均在0.02 mol/L pH 5.0 BR 缓冲溶液中进行。乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海延长生化科技有限公司。二次蒸馏水用于所用溶液的配制。 电化学方法在 CHI 650D 电化学工作站(上海辰华)上进行，采用三电极系统：工作电极为玻碳电极(=3 mm)，参比电极为 Ag/AgCl 电极，辅助电极为铂丝电极。2.2 Cu(Phen)(PC)(H2O)与dsDNA相互作用的电化学研究2.2.1 玻碳电极的预处理 实验前，将玻碳电极依次采用1.0 m、0.3 m和0.05 m的 -Al2O3 抛光粉打磨成镜面，然后用丙酮、无水乙醇和二次蒸馏水依次超声处理。2.2.2 吸附法制备DNA修饰玻碳电极 滴加10 L 0.1 g/L dsDNA 于处理后的裸玻碳电极表面，在室温下过夜风干，然后用二次蒸馏水淋洗去除未吸附的 dsDNA，就得到 dsDNA 修饰电极(dsDNA/GCE)。采用相同方法，将 dsDNA 替换为 ssDNA ，即可制备得到 ssDNA 修饰电极 (ssDNA/GCE) 。2.2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 dsDNA 和 ssDNA 在电极表面的相互作用配合物与 dsDNA 和 ssDNA 在电极表面的相互作用通过将 dsDNA/GCE或 ssDNA/GCE 放入含 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的0.02 mol/L pH 5 BR 缓冲溶液中开路富集10 min富集达到平衡，然后进行循环伏安测定。配合物在 dsDNA/GCE 和ssDNA/GCE 上的解离实验通过将饱和富集了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的修饰电极用二次蒸馏水淋洗后迅速放入0.02 mol/L pH 5 BR 缓冲溶液中隔一定时间进行电化学测定得到。2.3Cu(Phen)(PC)(H2O) 作为杂交指示剂检测CaMV35S的研究2.3.1 S1 探针在玻碳电极上的固定及与S2 的杂交将预处理后的玻碳电极放入0.02 mol/L BR 缓冲溶液中在+1.7 V 极化180 s，取出用二次蒸馏水淋洗，得到氧化修饰电极 GCE 。将处理后的电极放在 20l EDC+NHS 混合液中浸泡 20 min 取出，取10 L 10-7 g/L 的S1 探针滴涂于上述处理后的电极表面，自然晾干后再用 PBS 缓冲溶液洗涤30 s，即得到探针修饰电极S1/GCE。2.3.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集及电化学检测 取10 L含1.010-13 mol/L互补序列S2 的杂交液于上述探针修饰电极S1/GCE上在42 C下反应0.5 h 后用二次水淋洗30 s ，放入含810-5 mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) 的 BR 缓冲溶液中富集10 min后取出淋洗，然后在0.02 mol/L pH 5 的 BR 缓冲溶液中进行电化学测定。3 结果与讨论3.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 ssDNA 和 dsDNA 在电极表面的相互作用3.1.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 与 ssDNA 和 dsDNA 的不同结合属性研究 我们将 ssDNA 和 dsDNA 通过吸附法固定在电极表面，然后研究了 ssDNA 和 dsDNA 与 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在电极表面的相互作用机理和结合参数。图2为 4.5910-4 mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) 分别在裸 GCE ，ssDNA/GCE 和 dsDNA/GCE 上得到的循环伏安图。在各个电极上得到的电化学数据列于了表1。由图2中的曲线 a 和 b 及表1 上的数据可以看出，dsDNA/GCE 上得到的氧化还原峰电流较 GCE 上都有了明显的增大，表明修饰电极上的 dsDNA 对电活性的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 产生了富集作用。另外， 配合物在 dsDNA/GCE 上的式电位 E0 较裸电极上也出现了明显的正向移动，表明配合物与 dsDNA 在电极表面同样存在着嵌插作用14。而配合物在 dsDNA/GCE 上的峰电位差与其在裸电极上相比有了明显的增大，表明配合物在修饰电极表面电化学过程的不可逆性增强，这可能是因为配合物嵌插进入 dsDNA 双螺旋结构中的碱基对以后，配合物的电活性中心被 dsDNA 包围所引起的。abIp/10-6Ac E/V图2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在裸电极(a),ssDNA/GCE(b) 和 dsDNA/GCE(c)上的循环伏安图Figure 2 CVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at the bare GCE (a), ssDNA/GCE (b) and dsDNA/GCE(c)810-5mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) + 0.02 mol/L pH 5 BR;Accumulation time, 5 min; Scan rate, 0.10 V/s.配合物在 ssDNA/GCE 上得到的电化学响应显示峰电流较裸电极相比有所增大，而与 dsDNA/GCE 相比则要小得多，表明了 ssDNA 和 dsDNA 在电极表面对 Cu(Phen)(PC)(H2O) 具有不同的亲和富集能力。配合物在 ssDNA/GCE 上式电位的负移表明二者的主要结合模式为静电作用。通过上述实验结果，我们发现，配合物与 ssDNA 和 dsDNA 具有不同的结合模式，配合物可以作为一种有效的电化学 DNA 金属嵌插剂用于 ssDNA 和 dsDNA 的识别。表1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在不同电极上的电化学数据Table 1 Electrochemical data of Cu(Phen)(PC)(H2O) at different electrodesElectrodes Epc/mV Epa/mV Ep/mV Ipc/uA Ipa/uAGCE -72 9 63 1.47 -1.47ssDNA/GCE 80 -0.04 79.96 1.36 -1.40dsDNA/GCE 21 102 81 1.69 -1.20 3.1.2扫描速率影响溶液实验方法已经验证无论 DNA 是否存在于 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中，配合物在裸玻碳电极表面的电化学行为均受扩散过程控制。我们在相同的条件下考察了扫速 v 对配合物在 ssDNA 和 dsDNA 修饰电极上峰电流的影响。结果如图3所示，在 dsDNA/GCE上，氧化还原峰电流 Ipa与扫速 v 呈良好的线性关系，而与扫速平方根v1/2 呈弯曲关系，这表明 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在修饰电极表面的电化学行为已转换成了受吸附控制过程15，即电极表面的 dsDNA 对 Cu(Phen)(PC)(H2O) 产生了富集作用。abIpa/10-7Av/(V/s) or v1/2/(V/s)1/2图3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在8.010-5 g/L dsDNA/GCE 上氧化峰电流 Ipa 与扫速v或扫速平方根 v1/2 的关系曲线Figure 3 Relationships of oxidative peak currents I pa of Cu(Phen)(PC)(H2O) at the dsDNA/GCE and the scan rate v or square root of scan rate v 1/2 a. dsDNA/GCE, I pa v ; b. dsDNA/GCE, I pa v 1/2 Other conditions are the same as Figure 53.1.3 富集时间影响通过连续多次扫描和间隔一定时间扫描进一步考察了 dsDNA/GCE 和ssDNA/GCE 对配合物 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集作用。图4为裸 GCE，ssDNA/GCE 和 dsDNA/GCE 浸入 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中进行连续多扫的循环伏安图。在 GCE 上能得到稳定的循环伏安曲线(图4 A )，表明该电极对配合物没有吸附效应，与配合物之间只有简单的电子转移过程，电极表面的状态不随扫描次数的增加而变化。而对于ssDNA/GCE 和 dsDNA/GCE，随着扫描次数的增加，配合物的氧化还原峰电流均有增大的趋势(图4 B 和 C )，均表明两种电极对配合物具有富集作用，只是在 ssDNA/GCE 上，几次扫描之后就可达到稳定，而在 dsDNA/GCE 上达到稳定伏安曲线需要更多的扫描次数，且也有更大的电流增大幅度。 当将 dsDNA/GCE 和 ssDNA/GCE 浸入配合物溶液中富集一定时间进行伏安扫描时，在开始阶段，均随着富集时间的增加，氧化电流出现显著增大，而当ssDNA/GCE 富集1 min 后，得到最大峰电流，然后趋于稳定；对于 dsDNA/GCE达到饱和富集电流则需要7 min。上述两个富集实验均表明电极上的 ssDNA 和 dsDNA 对配合物均产生了富集作用，而 ssDNA 则较 dsDNA 能在更短的时间内与 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作用完全，这验证了 dsDNA 和 ssDNA 与配合物之间的不同作用模式：配合物与 dsDNA 主要通过疏水性的嵌插作用结合，而与 ssDNA 则通过静电模式结合，作用主要发生在 dsDNA 的外部，易于作用完全。同时，配合物能通过 dsDNA 内部碱基对的电子传递属性在电子表面发生电子转移，因此能获得更为灵敏的电化学信号16。I/10-6AAE/VBI/10-6A E/VCI/10-6ASweep times E/V图4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在 GCE(A), ssDNA/GCE(B) 和 dsDNA/GCE(C) 上的多扫循环伏安图Figure 4 Muti-sweep CVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at GCE (A), ssDNA/GCE (B) anddsDNA/GCE (C)Arrow in (C) shows the increasing process of peak currents accompanied with the increase of sweep times. Other conditions are the same as Figure 5.3.1.4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 从DNA修饰电极上的解离动力学研究k我们将 dsDNA/GCE 在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中充分富集后放入 BR 空白液中进行微分脉冲伏安扫描，考察了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在修饰电极上的解离动力学过程。图5为 dsDNA/GCE 经过不同解离时间 t 得到的 DPV 曲线。由图可知，随着时间的增加，配合物的还原峰电流越来越小，表明修饰电极表面的配合物的吸附量越来越小。将峰电流的对数 ln Ipc 对解离时间 t 作图，发现 ln Ipc 与 t 在两种电极上呈良好的线性关系，表明配合物在 dsDNA/GCE 解离符合如下模式的一级动力学过程17：解离过程 Cu(Phen)(PC)(H2O)-DNA/GCE DNA/GCE + Cu(Phen)(PC)(H2O)解离过程 即有方程： ln Ip =-kt +a 其中k 为解离速率，a 为一常数。 根据图5中插图的直线关系， 得到 Cu(Phen)(PC)(H2O) 从 dsDNA/GCE 上的解离速率为0.9222 s-1，并通过公式 t1/2 = ln 2/k 计算得一级动力学解离半衰期t1/2= 0.775s。I/10-6A E/V图5 饱和富集了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的 dsDNA/GCE 在 0.02mol/L pH 5 BR 空白液中的微分脉冲伏安曲线.插图:还原峰电流对数 ln Ipc 与解离时间 t 的关系曲线Figure 5 Time-dependent of DPVs obtained in 0.02 mol/L pH 5 BR solutions at dsDNA/GCE Inset: plots of ln Ipc and t. Arrows show the dissociation process accompanied with the increase of dissociation time.3.2 GCE修饰电极电化学表征 图6为裸 GCE GCEox ; 和S1/GCEox 三支不同电极在 5 mmol/L K3Fe(CN)6 溶液中的循环伏安图。在裸 GCE上几乎测不到阻抗，所以得到一对明显的氧化还原峰， E0=0.25 V，对应于(图6 a )；在GCEox上，由于阻抗增大，电对的峰电流较GCE 上有所减小，对应于(图6 b )；在S1/GCEox上，由于修饰上S1，似的阻抗更大，电对的峰电流也相对的减小，对应于(图6 c )。Ip/10-5A E/V图6 K3Fe(CN)6在裸 GCE (a), GCEox (b) 和 S1/GCEox (c) 上的循环伏安图 Figure 6 CVs of K3Fe(CN)6 at bare GCE (a), GCEox (b) and S1/GCEox (c) 5.0 mmol/L K3Fe(CN)6 + 50.0 mmol/L KCl.图7 K3Fe(CN)6 在裸 GCE (a) , GCEox (b) 和 S1/GCEox (c) 上的阻抗图 Figure 7 EISs of K3Fe(CN)6 at bare GCE (a), GCEox (b) and S1/GCEox (c) 5.0 mmol/L K3Fe(CN)6 + 50.0 mmol/L KCl.3.3 基因靶序列的定量检测 将 S1/GCEox 浸入不同浓度互补链(S2)溶液中在 42 C水浴中杂交 1 h 后取出洗，然后放入 Cu(Phen)(PC)(H2O) 中富集饱和后进行 DPV 测定，考察峰电流 Ip 与互补链浓度的关系结果如图8 A 所示。随着互补链浓度的增大，在杂交电极上获得的峰电流越来越多，表明修饰电极表面上的双螺旋DNA量越来越大。将峰电流 Ipa 与浓度对数 logCT 作图，在 5.010-131.010-8 mol/L 范围内，Ipa 与 logCDNA 呈良好的线性关系(图8 B)， Ipa/(A)= 0.46 log(CT/mol/L) + 6.24， =0.998。这表明在本实验中，以 GCEox 为载体固定 DNA 探针，以 Cu(Phen)(PC)(H2O) 为电化学杂交指示剂能在将峰电流Ipa与浓度对数 logCT 作图，在 5.010-101.010-8 mol/L 范围内，Ipa 与 logCDNA 呈良好的线性关系(图8 B)，Ipa/(A)= 0.46 log(CT/mol/L) + 6.24， =0.998。能在较低的浓度范围内对DNA片段进行定量检测。AIp/10-6AE/VBIp/10-7A logCT图8不同浓度靶序列CT对微分脉冲氧化曲线的影响(A); Cu(bpy)(MBZ)2氧化峰电流Ipa与S2浓度对数log CT的关系曲线(B) Figure 8 Dependence of DPVs of Cu(bpy)(MBZ)2 on the concentration of target sequence CT (A), and the plot between oxidation peak currents of Cu(bpy)(MBZ)2 Ipa and logarithmic of CT, log CTOther conditions are the same as Figure 8-13. 3.4 传感器的选择性 因为在本实验中采用微分脉冲伏安法能得到更灵敏的电化学信号，我们采用微分脉冲伏安法来研究传感器的基因杂交传感性能。图9为 S1/GCEox 与不同基因片段 (S2 ，S3 , S4) 杂交前后在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中进行DPV扫描得到的电化学曲线。由图可知，杂交前，配合物在 S1/ GCEox 上于-0.20 V 处有一对应于配合物的氧化峰(图9曲线a)；当S1/GCEox 与1.010-6mol/L 非互补链(S3)杂交后，在 S1-S3/GCEox 上，只能得到一个较杂交前相近的氧化峰(图9曲线b)，表明电极表面的探针链S1与S3没有发生杂交作用，电极表面仍保持单链状态，从而获得如 S1/GCEox 相似的氧化峰;当 S1/GCEox 在 1.010-6 mol/L 基本互补序列(S4)中浸泡杂交1 h 后，在相同的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中得到一个较强的氧化峰(图9曲线 c )，表明 S1 与 S4 在电极发生大部分杂交，配合物在S1-S4修饰电极表面产生了富集；当 S1/GCEox 在 1.010-6 mol/L 互补序列(S2)中浸泡杂交1 h 后，在相同的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中得到一个明显增强的氧化峰(图9曲线 d )，表明 S1 与 S2 在电极发生杂交形成了双螺旋结构，配合物在 S1-S2 修饰电极表面产生了富集;。这些结果表明本实验修饰电极对探针的固定方法和 Cu(Phen)(PC)(H2O) 指示剂的应用对电化学检测非互补和互补PAT基因具有良好的选择性。Ip/10-6AaE/V图9 S1/GCE(a)与非互补链靶序列S3(b),基本互补链靶序列S4(c)，非互补链靶序列S2(d),杂交后在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 中检测的微分脉冲伏安曲线 Figure 9 DPVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at S1/ GCE without (a), hybridized with non-complementary sequences S3 (b), and complementary sequences S4 (c)，and complementary sequences S2 (d) Cu(bpy)(MBZ)2 + 0.02 mol/L pH 5 BR Pulse amplitude, 50 mV; Pulse width, 50 ms; Pulse period, 200 ms; Increasing potential, 4 mV.4.小结在本实验中，我们研究了配合物与 dsDNA 和 ssDNA 在电极表面相互作用的研究表明配合物与 dsDNA 和 ssDNA 存在不同的结合力和结合模式，能作为一种 DNA 二级结构的电化学探针，计算了其与 ssDNA 和 dsDNA 的结合动力学参数、热力学参数和电化学参数等。初步研究了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作为电化学杂交指示剂在检测转基因植物基因片段 CaMV35S 中的应用，结果表明该配合物在 CaMV35S 与互补序列杂交前后的修饰电极上能获得差异性很大的电化学响应，表明该配合物能作为一种潜在的电化学活性杂交指示剂。参考文献：1 Gooding J J. Electrochemical DNA hybridization biosensors, Electroanalysis, 2002, 14: 1149-1156 2周文骏, 沈鹤柏, 杨永桃, 等. Tb3+荧光离子探针检测三链DNA的形成, 光谱学与光谱分析, 2004, 24: 1605-1608 3 Zhao X, Tapec-Dytioco R, Tan W. Ultrasensitive DNA detection using highly fluorescent bioconjugated nanoparticles, Journal of the American Chemical Society, 2003, 125: 11474-11475 4 Wakeley P R, Errington J, Hannon S, et al. Development of a real time PCR for the detection of Taylorella equigenitalis directly from genital swabs and discrimination from Taylorella asinigenitalis, Veterinary Microbiology, 2006, 118: 247-254 5 Fitzmaurice J, Glennon M, Duffy G, et al. Application of real-time PCR and RT-PCR assays for the detection and quantitation of VT 1 and VT 2 toxin genes in E. coli O157:H7, Molecular and Cellular Probes, 2004, 18: 123-132 6 Volkmann H, Schwartz T, Bischoff P, et al. Detection of clinically relevant antibiotic-resistance genes in municipal wastewater using real-time PCR (TaqMan), Journal of Microbiological Methods, 2004, 56: 277-286 7 Anna-Maria C, Ian K, Silvano P. Diagno. Rapid detection of mecA and nuc genes in staphylococci by real-time multiplex polymerase chain reaction, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2005, 51: 13-17 8 Tarja J, Arja K, Antti W L, et al. rapid solution hybridization method for detection of human papillomaviruses, Molecular and Cellular Probes, 1990, 4: 341-352 9 Jal