杂环类药物的分析

,盐城卫生职业技术学院 林 锐 QQ: 505348076; E-mail: QQ: 56334613 ; E-mail:,杂环类药物的分析 The Analysis of Heterocyclic drugs,药物分析技术 Technology of Pharmaceutical Analysis,第九章 杂环类药物的分析 Chapter 9 The Analysis of Heterocyclic drugs,The ring compounds contain the heterocyclic atoms are called as heterocyclic compounds。 杂环化合物：指环状有机化合物的碳环中夹杂有非碳元素原子（如O、S、N等）的化合物。,第一节 概述 SECTION 1 General considerations,杂环: 环状有机化合物的碳环中夹杂有其他非碳原子的环状结构叫做杂环。 The carb-onring of organic ring compound contain the non-carbon atoms are called as heterocyclic。 非碳原子,又称杂原子,如N,S,O. The non-carbon atoms such as oxygen, nitrogen, and sulfur etc. in organic ring compounds are known as heterocyclic atoms。,共性Properties : (1)杂环类药物是合成药物中所占比例最多的一大类药物. (2)多为五元环或六元环,单环或并合环(monocyclic or dicyclic and polycyclic system). (3)杂环结构较稳定,不易开环,其性质受杂原子种类、数目、位置影响. (4)杂环上取代基性质较活泼,常用于分析. (5)含氮杂环,其碱性的强弱往往用于分析.,Native (natural) heterocyclic drugs Alkaloids(natural base) Vitamins Antibiotics Synthetic heterocyclic compounds Pyridines Phenothiazines Benzodiazepines,Properties:,1. pentatomic ring & hexatomic ring monocyclic or dicyclic and polycyclic system 2. stable 3. alkalinity of nitrogen atom on heterocyclic nitrogen compound 4. absorption spectra ( UV, IR ),异烟肼 （isoniazid）,吡啶（pyridine）,异烟腙（ftivazide）,丙硫异烟胺 （protionamide）,N,CH NOH,碘解磷定,CH3,I-,尼可刹米 （nikethamide）,尼可刹米，吡啶环的位被酰胺基取代。遇碱水解，放出二乙胺。 碘解磷定，吡啶环位有甲醛肟基取代，该基团在碱性中易降解。吡啶环氮原子与碘甲烷作用形成季铵盐，碱性下降。, 母核:吡啶环 芳叔胺,弱碱性 pKb8.8， 非水碱量法含量测定 或沉淀反应鉴别 吡啶环可发生开环反应，可用于吡啶类药物的鉴别,异烟肼 位上酰肼基 弱酸性 非水酸量法 还原性 鉴别或氧化还原滴定法含量测定 可与某些羰基试剂发生缩合反应 鉴别或比色法含量测定 酰肼键易水解引入特殊杂质游离肼, 取代基,尼可刹米 位上酰胺基 易水解，遇碱水解后，释放出具有碱性的二乙胺NH(C2H5)2，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色，故可以此进行鉴别。用于鉴别或凯氏定N直接蒸馏测定。,丙硫异烟胺 位上硫代甲酰胺基 易水解，加酸水解后，释放出硫化氢，能使湿润的醋酸铅试纸显黑色，故可以此进行鉴别。,3. absorption spectra ( UV, IR ),（1）母核能与金属盐反应生成有色沉淀。 pyridinewith heavy metal （2）碱性:吡啶环上氮原子具有叔胺性质， pKb=8.8（水中;in water ），非水碱量法滴定； tertiary aminealkaline （3）异烟肼:酰肼基有强还原性,且能与羰基缩合,氧化还原滴定或比色测定； acyl hydrazine (INH) reducing property：condensation reaction with carbonyl reagents （4）尼可刹米:酰胺基碱性下可水解,放出NH(C2H5)2,用于鉴别或凯氏定氮直接蒸馏测定。 acyl aminehydrolysis,2.性质Properties,与汞盐的反应 异烟肼,尼可刹米+HgCl2白色沉淀,二、鉴别Identification,1.母核反应,（1）沉淀反应 与金属离子反应生成有色沉淀,INH, Nikethamide + HgCl2 白色,与铜盐的反应,异烟肼+CuSO4 （Cu2O）红棕色 INH +CuSO4（Cu2O） 尼可刹米+CuSO4+硫氰酸钾草绿色沉淀。 Nikethamide + CuSO4 + KSCN ,【鉴别】（3）取本品 2 滴，加水 1 ml ，摇匀，加硫酸铜试液 2 滴与硫氰酸胺试液 3 滴，即生成草绿色沉淀。,尼可刹米 ChP（2005）P164,(3）与碘化铋钾反应 异烟肼、碘解磷定可与碘化铋钾（酸性）反应，生成有色沉淀； 尼可刹米不与碘化铋钾反应，但可与碱性碘化汞钾反应产生沉淀,（2）开环反应：适用于a,a未取代， , 为烷基或羧基取代的。 ring-opening reaction of pyridine ring -non-substituted, and ,-substituted with alkyl, and carboxyl group,a. 戊烯二醛反应pentenedinal reaction (Knig reaction) (溴化氰-苯胺法),INH,黄色,异烟肼：,例:尼可刹米 ChP（2005） 【鉴别】（2）取本品 1 滴，加水 50 ml，摇匀，分取 2 ml，加溴化氰试液 2 ml与 2.5% 苯胺溶液 3 ml，摇匀，溶液渐显黄色。,pentenedinal reaction (Knig reaction) Nikethamide,Nikethamide,b.2,4-二硝基氯苯反应 (Vongerichten reaction) 异烟肼,尼可刹米,异烟腙ChP（2005）,purple-red,无水条件下，吡啶或其衍生物与2，4-二硝基氯苯共热或熔融；冷却后，加醇制氢氧化钠溶解，溶液即显红色。 本法鉴别异烟肼、尼可刹米时，需要氧化酰肼基为羧基，或将酰肼、酰胺水解为羧基。,例:异烟腙 ChP（2005）P218,【鉴别】 取异烟腙约50 mg，加2,4二硝基氯苯50 mg与乙醇3 m1，置水浴中煮沸23 min，加10氢氧化钠溶液2滴，静置后，即显鲜明的红色。,异烟肼不经处理的反应：,2.酰肼基团的反应,Oxidant: I2、Br2、KBrO3、AgNO3,（1）还原反应Reduction reaction ： Reaction of hydrazideINH,Silver mirror reaction : INH + AgNO3 + H2O (NH3H2O) Ag ,异烟肼 ChP（2005）P217 【鉴别】 （2）取异烟肼约10 mg，置试管中，加水2 ml溶解后，加氨制硝酸银试液1 m1，即发生气泡与黑色浑浊，并在试管壁上生成银镜。,异烟肼银镜反应,N,CONHNH2,+ AgNO3 + H2O,N,COOAg,+ HNO3 +,NH2,NH2,NH2,NH2,+ 4 AgNO3,4Ag + N2 +4HNO3,（2）缩合反应Condensation reaction ： 与芳醛缩合形成腙， hydrazine non-substituted condense with aromatic aldehydes to form hydrazone 如香草醛、水杨醛、二甲氨基苯甲醛 condensating reagent: vanillin, salicylal(salicylic aldehyde) para-dimethylaminobenzaldehyde,黄色max=380nm,异烟肼 ChP（2005） P217 【鉴别】 （1）取本品约0.1 g，加水5 ml溶解后，加10香草醛的乙醇溶液1 m1，摇匀，微热，放冷，即析出黄色结晶，滤过，用稀乙醇重结晶，在105干燥后，测定熔点，其熔点为228231，熔融时同时分解。,II . hydrazine non-substituted condense with 1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid to produce red color,（三）分解产物的反应,1. 尼可刹米 ChP（2005）P164 【鉴别】 （1）取本品 10 滴，加氢氧化钠试液 3 ml ，加热，即发生二乙胺的臭气，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色。,用红色石蕊试纸检查,2. 丙硫异烟胺 ChP（2005）P77 【鉴别】（1）取本品约 50 mg，加盐酸溶液（9100）3 ml ，缓缓加热，发生的气体可使湿润的醋酸铅试纸显黑色。,（四）紫外吸收光谱特征 UV-spectrophotometry,丙硫异烟胺 ChP（2005）P77 【鉴别】（2）取本品，加乙醇制成每1 ml 中含 20 g 的溶液，照分光光度法（附录A）测定，在 291 nm 的波长处有最大吸收，吸收度约为0.78。,吡啶类药物的紫外特征吸收鉴别法 药 物 溶剂 max(nm) E 异烟肼 HCl(0.01mol/L) 265 约420 水 266 378 尼可刹米 H2SO4(0.05mol/L) 263 273 NaOH(0.01mol/L) 255 840 260 860 丙硫异烟胺 乙醇(20g/ml) 291(0.78),（五）IR,尼可刹米 ChP（2005）P 164 【鉴别】（4）本品的红外吸收图谱应与对照的图谱（光谱集 135 图）一致。,三、杂质检查Limit Test,TLC Turbidimetric method Difference spectrophotometry,（一）异烟肼中游离肼的检查 for free hydrazine inIsoniazide(INH),杂质来源 原料引入、降解产生,1. 薄层色谱法（TLC） （1） ChP（2005）P217 杂质对照品法,取本品，加水制成每 1ml 中含 50mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加水制成每 1ml中含 0.20mg（相当于游离肼50g 的溶液，作为对照溶液。吸取供试品溶液 10l 与对照溶液 2l 分别点于同一硅胶薄层板（用羧甲基纤维素钠溶液制备）上，以异丙醇丙酮（32）为展开剂，展开后，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15min后检视，在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。,（2） BP（1998） 游离肼 杂质对照品法 有关物质 高低浓度对比法,BP 对照溶液制备 取硫酸肼50mg，加水50ml使溶解后，加丙酮稀释至100ml；量取10ml，加供试品溶液0.2ml，加丙酮-水(1:1)稀释至100ml。 检查方法 于硅胶GF254薄层板上，分别点加供试品溶液与对照溶液各5l，以醋酸乙酯-丙酮-甲醇-水(50：20：20：10)为展开剂，色谱分离后，于254nm紫外光下检测，供试品色谱中出现的杂质斑点强度不大于对照溶液色谱斑点(异烟肼)；再喷以二甲氨基苯甲醛溶液，并在日光下检视，对照溶液色谱中硫酸肼斑点的强度大于供试品溶液色谱中的杂质斑点。,2. 比浊法 JP（13） 检查方法 灵敏度法 反应原理 游离肼+水杨醛水杨醛腙采用样品中加水杨醛的乙醇溶液观察浑浊的方法来控制限量。 原理：游离肼可与水杨醛反应生成水不溶性的水杨醛腙，呈现混浊。 方法：取本品0.1克，加水5毫升使溶解，加水杨醛（1 20）0.1毫升，迅速振摇混合，放置5分钟内不得现混浊。 优点：不用对照品，价廉、简单易行 缺点：准确度差,3. 差示分光光度法,游离肼+对二甲氨基苯甲醛黄色缩合物 于456nm波长处有最大吸收 异烟肼+对二甲氨基苯甲醛缩合物 于456nm波长处无吸收 游离肼+3%丙酮无色的二甲基甲酮连氮,参比：异烟肼+游离肼+对二甲氨基苯甲醛+3%丙酮 样品：异烟肼+游离肼+对二甲氨基苯甲醛 测定，对照法定量,对照品溶液的制备与测定 取50ml量瓶2个，各加1g/ml肼标准液5ml。其中一个加对二甲氨基苯甲醛试液于456nm波长处，以对二甲氨基苯甲醛试液的水稀释溶液(2050)为对照，测定吸收度；于另一个量瓶中加入丙酮1.5ml，并按同法操作，以含3%丙酮的对二甲氨基苯甲醛试液的水稀释溶液为对照，测定吸收度。然后计算二溶液的吸收度差值A456nm。 供试品溶液的制备与测定 2mg/ml供试品水溶液,分取二等份分置50ml量瓶中，照上述对照品溶液的制备与测定项下，自“其中一个”起，依法操作并计算A456nm。 Cg = ( C /A456nm)d (A456nm)g,（二）尼可刹米中有关物质的检查,ChP（2005） TLC 高低浓度对比法 配制两种不同浓度的对照溶液,四、含量测定Assay,（一）异烟肼的含量测定217,氧化还原滴定法 常用氧化剂：碘、溴、溴酸钾、高锰酸钾、重铬酸钾、NaNO2、硫酸铈等。其中碘量法，溴量法，溴酸钾法最常用。 oxidant:iodine；bromine；potassium rominate （1）溴酸钾法 potassium bromate method ChP（2005）原料及制剂,操作：,原理：,等当点:稍过量的Br2,测定方法 取本品约 0.2g，精密称定，置 100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取25m1，加水50m1、盐酸20ml与甲基橙指示剂1滴，用溴酸钾滴定液（0.01667mo1/L）缓缓滴定（温度保持在1825）至粉红色消失。每1ml的溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）相当于3.429mg的C6H7N3O。,反应摩尔比 32,a.缓缓滴定并充分振摇,防止局部浓度过高终点提前； b.到终点后,补加一滴指示剂,如颜色褪去即可,否则未到终点；,讨论,c.ChP77、85、90、95、2000、2005均采用本法测定异烟肼（片）； d.化学计量关系：3/2 T=0.016673/2137.14=3.429 The indicator was oxidized into colorless by bromine. T=3/2MW0.01667 =3/2137.145/300 =137.145/200=3.429(mg/ml),（2）溴量法 反应摩尔比 14,剩余溴量法bromometric method ：,原理：,操作：,Br2（过）+KI I2+2KBr I2+Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6,0.1mol/LBr2: （溴酸钾3g+溴化钾15g水1000ml）,在稀HCl反应条件下： KBrO3+5KBr+6HCl Br2+6KCl+3H2O,讨论： ChP63版曾用本法测定异烟肼 a.酸度0.700.86mol/L，所测结果一致，高、低都会使结果偏低； b.放置时间1530min； c.滴定温度30； d.测定应在25min内完成,（3）剩余碘量法iodometric method,反应摩尔比 14,操作：,原理：,I2(the excess) +2Na2S2O3(VS)2NaI+Na2S4O6,讨论： a.本法简便,但因碘氧化力较弱,反应不 易完全。常因反应时间、温度不同有 所差异； b.用于制剂分析时,含有还原性赋形剂时 有干扰； c.化学计量关系：(1:4) INH : I = 1 : 4 0.1mol/L I23.429mg C6H7N3,Titer(T) =a/bMWmg/mmol0.1mmol/ml1ml =1/4137.140.11 = 3.429mg/ml,2. 非水溶液滴定法 non-aqueous titration method （1）非水酸量法 non-aqueous acidimetry （2）非水碱量法 non-aqueous alkalimetry,（二）尼可刹米的含量测定,1. 非水溶液滴定法 ChP（2005）原料 P164 2. 紫外分光光度法 ChP（2000）注射液 P165 内容量移液管,用内容量移液管精密量取本品1m1，置 100ml 量瓶中，用 0.5 硫酸溶液分次洗涤移液管内壁，洗液并入量瓶中，加 0.5硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，加0.5硫酸溶液稀释成每1ml中约含尼可刹米20g的溶液，在263nm的波长处测定吸收度，按C10H14N2O的吸收系数（ ）为292计算，即得。,（三）异烟腙的含量测定,非水溶液滴定法 电位法指示终点 ChP（2005）原料及片剂 P218,（四）丙硫异烟胺的含量测定 P78,1. 非水溶液滴定法 ChP（2005）原料 2. 银量法 ChP（2005）片剂,取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于丙硫异烟胺0.3g）置具塞锥形瓶中，加丙酮20ml使丙硫异烟胺溶解，精密加入硝酸银滴定液（0.1mo1/L）50m1，摇匀，放置15min，加水50m1、硝酸3m1、硝基苯5ml与硫酸铁铵指示液2m1，用硫氰酸铵滴定液（0.1mo1/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硝酸银滴定液（0.1mo1/L）相当于 9.014mg的C9H12N2S。,利用开环反应或酰肼基团与试 剂呈色测定。 ring-opening reaction of pyridine reduction and condensation reaction of hydrazide,2.比色测定Colorimetric method,3.非水滴定法 non-aqueous titration method,利用吡啶环的碱性，进行非水 滴定。 non-aqueous alkalimetry non-aqueous acidimetry,99：79. 下列药物中，哪一个药物加氨制硝酸银能产生银镜反应 A. 地西泮 B. 阿司匹林 C. 异烟肼 D. 苯佐卡因 E. 苯巴比妥,97：132用于吡啶类药物鉴别的开环反应有(B E) A. 茚三酮反应 B.戊烯二醛反应 C.坂口反应 D. 硫色素反应 E.二硝基氯苯反应,例1. ChP（2005）异烟肼的测定方法为(A) A. 溴酸钾滴定法 B. 溴量法 C. TCL D. NaNO2 E. 比色法,例2. 能和2,4一二硝基氯苯发生呈色反应的药物是(A) A. 异烟腙 B. 硫酸奎宁 C. 阿莫西林 D. 四环素 E. 炔孕酮,例3. 能和硫酸铜及硫氰酸铵反应，生成草绿色沉淀的药物为(C) A. 对乙酰氨基酚 B. 异烟肼 C. 尼可刹米 D. 地西泮 E. 维生素E,例4. 经高锰酸钾或溴水氧化后，可发生开环形成戊烯二醛反应的药物为(E) A. 葡萄糖 B. 皮质酮 C. 维生素C D. 土霉素 E. 异烟肼,例5. 溴酸钾法测定异烟肼含量的方法是 A. 属于氧化还原滴定法 B. lmol溴酸钾相当于3/2mol的异烟肼 C. 采用永停滴定法指示终点 D. 在HCl酸性条件下进行滴定 E. 还可以用于异烟肼制剂的含量测定,例6. 异烟肼可由原料反应不完全或贮藏中的降解反应而引入哪种杂质 A. 间氨基酚 B. 水杨酸 C. 对氨基苯甲酸 D. 游离肼 E. 其他甾体,例7. 可用于异烟肼鉴别的反应有 A. 与氨制硝酸银的反应 B. 戊烯二醛反应 C. 坂口反应 D. 硫色素反应 E. 二硝基氯苯反应,SECTION 2 Analysis of Phenothiazine Drugs,一、Structure analysis,General considerations basic structure: 硫氮杂蒽母核 sulfur nitrogen heterocyclic anthracene,（1）含S、N的三环共轭的大体系，S、N与苯环形成 p-共轭具有紫外吸收光谱特征,（2）硫氮杂蒽环上硫原子为-2价，具有还原性，易氧化呈 色，生成砜或亚砜,（3）硫氮杂蒽环上硫原子有两对孤对电子，易与 金属离子配合呈色,R: -H, -Cl, -COCH3, -CF3, -SCH2CH3,2.取代基,R：脂烃胺基、哌嗪基，具碱性,R: dimethylamino, diethylamino group nitrogen heterocyclic ring,R：卤素,奋乃静,癸氟奋乃静,盐酸氟奋乃静,盐酸三氟拉嗪,盐酸二氧丙嗪,共同点,（1）硫氮杂蒽母核为共轭三环系统； （2）含两个杂原子多环共轭体系，有UV吸收； （3）硫氮杂蒽母核的硫为二价， 易被氧化生成砜或亚砜遇不同氧化剂如硫酸、硝酸、三氯化铁试液及过氧化氢等，随着取代基的不同，而呈不同的颜色。其紫外吸收光谱有明显不同，它们具有四个峰值。 （4）与金属离子配合，生成有色物，可比色测定,不同点：R，R取代基不同,（二）性质 1. 紫外与红外吸收光谱 本类药物的紫外特征吸收，主要由母核三环的系统所产生，一般具有三个峰值。即在 204209nm（205nm附近）、250265nm（254nm附近）和300325nm（300nm附近）。最强峰多在 250265nm。,2位上的取代基（R）不同，会引起吸收峰发生位移。 其结构中-2 价的硫，具还原性，可被氧化,氧化产物砜及亚砜有四个吸收峰。 吩噻嗪类药物随取代基 R 和R的不同，产生不同的红外吸收光谱。 10位上烃胺侧链R对最大吸收波长有一定影响.碳链越短影响越大。即使氨基在四个碳链的末端,对吸收峰的位置仍会有影响。,2.具还原性,易被氧化呈色,3. 易与金属离子配合呈色 本类药物中未被氧化的硫，可与钯离子形成配位化合物，其氧化产物则无此反应。此性质可用于 鉴别和含量测定，并具有专属性，可消除氧化产物的干扰。,4. 碱性,二、鉴别 Identification,（一）UV和IR,特征的紫外吸收： 具有三个峰值205nm、254nm和300nm附近，两个谷220nm和280nm附近；若被氧化则有四个吸收峰，可用于判断样品中有无氧化物。,药物名称 溶 剂 浓度（g/ml） max（nm） A E1%1cm 盐酸氯丙嗪 盐酸（9 1000） 5 254 0.46 915 306 盐酸异丙嗪 盐酸（0.01mol/L） 6 249 883937 奋乃静 无水乙醇 7 258 0.65 癸氟奋乃静 乙醇 10 260 盐酸氟奋乃静 盐酸（9 1000） 10 255 553593 盐酸三氟拉嗪 盐酸（1 20） 10 256 630 盐酸硫利达嗪 乙醇 8 264与315 ,盐酸氯丙嗪 ChP（2005）P274,鉴别 （2）取本品，加盐酸溶液（91000）制成每1ml 中含 5g 的溶液，照分光光度法（附录A）测定，在 254nm与306nm的波长处有最大吸收，在 254nm的波长处吸收度约为0.46。,奋乃静 ChP（2005）P328,鉴别 （2）取本品，加无水乙醇制成每1ml 中含 7g 的溶液，照分光光度法（附录A）测定，在 258nm 的波长处有最大吸收，吸收度约为0.65。,（3）奋乃静的红外吸收图谱应与对照的图谱（光谱集 243 图）一致 盐酸异丙嗪、盐酸异丙嗪的红外吸收图谱应分别与对照的图谱（光谱集350、351 图）一致,（二）显色反应,1.氧化剂氧化显色 氧化剂 硫酸、硝酸、过氧化氢,(1),氧化剂：H2SO4、溴水、FeCl3、H2O2,(2),（可用于比色测定）,药物名称 硫 酸 硝 酸 过氧化氢 盐酸氯丙嗪 显红色, 渐变淡黄色 盐酸异丙嗪 显樱桃红色,放置 生成红色沉淀,加热即溶解, 后颜色渐变深 溶液由红色转变为橙黄色 奋乃静 显深红色;放置后 红色渐褪去 盐酸氟奋乃静 显淡红色, 温热 后变成红褐色 盐酸三氟拉嗪 生成微带红色的白色沉淀; 放 置后, 红色变深, 加热后变黄色 盐酸硫利达嗪 显蓝色 ,奋乃静 ChP（2005）P328,鉴别 （1）取本品 5mg，加盐酸与水各 1ml，加热至80，加入过氧化氢溶液数滴，即显深红色；放置后，红色渐褪去。,盐酸异丙嗪 ChP（2005）P511,鉴别 （1）取本品约 10mg，加水1ml 溶解后，加硝酸5滴即显红色，渐变淡 黄色。,鉴别 （1）取本品约 5mg，加硫酸5ml 溶解后，溶液显樱桃红色；放置后，色渐变深。 （2）取本品约 0.1g，加水 3ml 溶解后，加硝酸 1ml，即生成红色沉淀；加热，沉淀即溶解，溶液由红色转变为橙黄色。,癸氟奋乃静 ChP（2005）P454 鉴别 （2）取本品约 5mg，加甲醇2ml 溶解后，加 0.1% 氯化钯溶液 3ml，即有沉淀生成，并显红色，再加过量的氯化钯溶液，颜色变深。,2. 与钯离子配合显色,利用分子结构中未被氧化的硫与金属钯离子络合形成有色配合物，如与癸氟奋乃静形成红色配合物。,3.氟元素显色反应(盐酸氟奋乃静),（三）分解产物的反应 癸氟奋乃静 ChP（2005）P454 鉴别 （1）取本品 15 20mg，加碳酸钠与碳酸钾各约0.1g，混匀，在 600 炽灼 1520分钟，放冷，加水2ml 使溶解，加盐酸溶液（12）酸化，滤过，滤液加茜素锆试液 0.5ml，应显黄色。,（四）氯化物的反应,盐酸氯丙嗪 ChP（2005） 鉴别 （3）本品的水溶液显氯化物的鉴别反应（附录 ）。,三、有关物质检查 1. 癸氟奋乃静及其注射液 TLC 参比杂质对照品法 以盐酸氟奋乃静为对照品 2. 其他药物 TLC 高低浓度对比法,(一)盐酸异丙嗪中特殊杂质检查 主要有：2-二甲氨基-1-丙醇；N,N,-三甲基-10H-吩噻嗪-10-乙胺异构体和结构不清的分解产物 。因此采用TLC法中的高低浓度对比法控制上述这些杂质的限量。 (二)盐酸硫利达嗪中有关物质检查 本品遇光不稳定，在生产和贮藏过程中易引入有关物质，因其结构不清，因此也采用TLC法中的高低浓度对比法控制杂质的限量。,特殊杂质检查,四、含量测定Assay,（一） 非水溶液滴定法 原料药 吩噻嗪类药物母核上氮原子碱性极弱,不能进行滴定,10位取代基上N原子为碱性,可在非水介质中以高氯酸标准液，以结晶紫为指示剂。 HClO4在冰醋酸溶液中，具强氧化性，可氧化吩噻嗪类药物产生红色的氧化物，干扰指示剂终点的观察。排除方法： （1）改用中性溶剂 （2）加抗坏血酸 （3）电位法指示终点,非水碱量法测定吩噻嗪类药物 药物名称 冰HAc Hg(Ac)2 终点颜色(结晶紫) 奋氖静 20 - 蓝绿色 癸氟奋氖静 20 - 蓝绿色 盐酸三氟拉嗪 20 5 蓝绿色 盐酸异丙嗪 10 4 蓝色 盐酸氟奋氖静 20 5 蓝绿色 盐酸二氧丙嗪 25 10 蓝色 盐酸氯丙嗪 醋酐10 5 玫瑰红色(橙黄IV),（二）紫外分光光度法UV 制剂分析,直接分光光度法 2. 萃取后分光光度法 3. 二阶导数分光光度法 4.萃取双波长分光光度法,1.直接分光光度法 供试品不需提取分离，溶于适当的溶剂中即可进行含量测定。 1.奥沙西泮原料的测定 在229nm，采用标准对照法测定。 2.盐酸异丙嗪片的测定 在249nm，采用 910测定。 3.盐酸异丙嗪注射液的测定299nm 108 测定波长的选择：注射液处方加VC作抗氧剂，可还原异丙嗪红 色氧化产物，从而防止异丙嗪氧化变色。VC （max 243nm）在盐 酸异丙嗪最大吸收波长249nm处有吸收，干扰注射液测定。因此 选用299nm波长测定盐酸异丙嗪注射液的含量时，维生素C在 此波长处则不产生干扰,但 108 。,同理，盐酸氯丙嗪片剂测定波长为254nm（ 为915）； 注射液测定波长改为306nm（ 为115）。,操作：取10片，除去糖衣后，精称，研细称取粉末适量加水、盐酸溶解过滤，取滤液于249nm处测定。 已知：盐酸异丙嗪=910，即可计算 优点：不需标准品 缺点：仪器精密度要求高 测定中注意问题：避光、防止氧化。,2. 萃取后分光光度法 盐酸氯丙嗪注射液,3.萃取-双波长分光光度法 本法是USP（24）收载的方法，用于盐酸氯丙嗪注射液的含量测定，主要用来校正样品中氧化物对测定的干扰。 测定原理 利用氯丙嗪的最max为254nm，其氧化物在此波长也有吸收，同时在277nm氧化物也有吸收，且其A=A254-A277.而氯丙嗪在此波长无吸收。因此，可由两波长处测得A计算氯丙嗪含量。,（1）原理 在待测组分（a）的最大吸收波长（测定波长，1）处测定待测组分和干扰组分（b）吸收度的总和；另选一适当波长（参比波长，2）测定吸收度，并使干扰组分在测定波长和参比波长处的吸收度相等，即 ，而待测组分在这两个波长处吸收度的差值足够大。,（2）定量依据 样品在二波长下吸收度差值（A）：,即，吸收度差值（A）仅与待测组分的浓度有关，而与干扰组分无关， 干扰组分的干扰被消除。,（3）必要条件 干扰组分在两个波长处吸收度相等 待测组分在两个波长处吸收度相差足够大,（4）应用 萃取 除去抗氧剂的干扰,双波长分光光度法测定 排除氧化产物的干扰 测定波长 254nm 参比波长 277nm 对照法定量,4.二阶导数分光光度法 盐酸氯丙嗪注射液 抗氧剂维生素C的二阶导数光谱近似为接近基线的一条直线，不干扰盐酸氯丙嗪的测定。因此盐酸氯丙嗪可从其二阶导数光谱量取峰266nm谷254nm距离，标准曲线法定量 其测定方法如下：,光谱绘制 测绘条件： 波长范围为200nm320nm；狭缝为12nm；纸速为120mm/min。 线性关系 精取盐酸氯丙嗪对照液(50g/ml)制得标准系列，以 HCI(0.1mol/L)为空白，按光谱绘制项下分别测定。用尺量取不 同浓度系列溶液光谱266nm-谷254nm距离（DL），并以峰谷距离为纵 坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 供试品测定 精密量取盐酸氯丙嗪注射液2.0ml，按光谱绘制项 下的方法，测得二阶导数光谱，量取光谱峰-谷(266nm254nm) 距离，从标准曲线上求出浓度，计算百分含量。,（三）铈量法： 原理:适当pH下,用硫酸铈氧化吩噻嗪进行测定 开始时,吩噻嗪失去一个电子 游离基（红色） 等电点吩噻嗪失去2个电子 无色， 终点：红色无色 条件：在硫酸酸性下,自身指示终点或电位法、永停法指示终点,优点： 硫酸铈作滴定剂具有高的氧化电位，且为一价还原；不存在对环取代基的副反应，专属性高。 本法既可用于原料，亦可用于片剂的测定,（1）赋形剂不干扰,复方制剂中咖啡因、苯丙胺、可待因、巴比妥类药物等不干扰； （2）反应为一价还原（Ce4+Ce3+）,对环上取代基无作用； （3）用于原料药，也可用于制剂分析。,硝苯地平的测定 基本原理 硝苯地平的测定原理，可用下列反应式表示： 终点时:微过量的Ce4+将指示剂中的Fe2+氧化成Fe3+，使橙红色配合物离子呈淡蓝色或无色，以指示终点的到达。,原理：吩噻嗪类药物可与一些金属离子（如Pd2+）在适当pH值的溶液中形成有色的络合物，借以进行比色测定。,（四）比色法,2. 铁盐比色法,1. 钯离子比色法,反应在 pH20.1 的缓冲液中进行,钯离子比色法,优点： 钯离子比色法可选择性地用于未被氧化的 吩噻嗪类药物的测定。,钯离子比色法可选择性地用于未被氧化的吩噻嗪类药物的测定 （1）钯离子试剂： PdCl2和十二烷基硫酸酯钯盐. 用PdCl2时，形成的有色配位物水中溶 解度小,样品量大时,产生沉淀. 十二烷基硫酸酯钯盐,其配位物溶解度 大,吸收强度增大（约2倍）. （2）本法优点：氧化产物不干扰。,讨论：,95：131盐酸氯丙嗪的含量测定方法有 A. 中和法 B. 非水滴定法 C. 紫外法 D. 旋光法 E. 铈量法,99x：87. 中国药典（1995年版）对盐酸异丙嗪注射液的含量测定，选用299nm波长处测定，其原因是 A. 299nm处是它的最大吸收波长 B. 为了排除其氧化产物的干扰 C. 为了排除抗氧剂的干扰 D在299nm处，它的吸收系数最大 E. 在其他波长处，因其无明显吸收,99x：78. 有氧化产物存在时，吩噻嗪类药物的鉴别或含量测定方法为 A. 非水溶液滴定法 B. 紫外分光光度法 C. 荧光分光光度法 D. 钯离子比色法 E. pH指示剂吸收度比值法,例1. 中国药典(2000年版)中地西泮原料药中2-甲氨基-5-氯二苯酮的检查法为 A. TLC B. HPLC C. GC D. 沉淀法 E. 显色法,例2. 检查盐酸氯丙嗪中“有关物质”时，采用的对照溶液为 A. 杂质的标准溶液 B. 标准“有关物质”溶液 C. 供试品溶液 D. 供试液的稀释溶液 E. 对照溶液,例3. 某药物于酸性溶液中，加硫酸铈试液则产生红色，继续滴加硫酸铈试液，红色由浅变深，继由深又变浅直至红色消失，该药物应为 A. 雌二醇 B. 氯丙嗪 C. 诺氟沙星 D. 硫酸镁 E. 苯巴比妥钠,例4. 吩噻嗪类药物与钯离子反应，需在以下哪种酸性条件下进行 A. pH4 B. pH33.5 C. pH20.1 D. pH1 E. pH5,第三节 苯并二氮杂卓 类药物的分析,环庚三烯,卓,一. 结构分析,氯氮卓（1955年合成）,地西泮（1959年合成）,硝西泮,氯硝西泮,奥沙西泮,盐酸氟西泮,艾司唑仑,阿普唑仑,共同点：,1.二氮杂卓环为七元环，环上氮原子具有强碱性，苯基的取代使碱性降低，可进行非水滴定法测定；苯并二氮杂卓母核 弱碱性，UV吸收，用于含量测定； 2. 结构中的环一般比较稳定，但在酸性溶液中可水解，形成相应的二苯甲酮衍生物。 可用于鉴别和比色测定。（氯氮卓水解生成芳伯胺基；地西泮水解生成芳仲胺基和甘氨酸）; 3.本品多为游离碱，不溶于水，而溶于 甲醇、乙醇和氯仿中。,3. 含卤素,（一）化学鉴别法 1.芳伯胺基反应：氯氮卓、艾司唑仑、奥沙西泮 氯氮卓水解生成芳伯胺基(重氮化偶合反应) 2.茚三酮反应：地西泮 地西泮水解生成甘氨酸（茚三酮反应） 3.硫酸荧光反应：地西泮 本类药物加硫酸，在紫外灯下，呈荧光。 4.沉淀反应 5. 分解产物的反应,二、鉴别试验,（二）UV 和 IR （三）TLC,(一) 化学鉴别试验 1。沉淀反应 氯氮卓 橙红色沉淀 阿普唑仑 盐酸氟西泮 KBiI4 也生成橙红色沉淀 氯硝西泮 放置后，沉淀颜色变深， 因此可以相互区别。,阿普唑仑 + 遇硅钨酸 白色沉淀，药典中也用于鉴别。,氯氮卓 ChP（2005）P773 【鉴别】（1）取本品约 10mg，加盐酸溶液（91000）10ml 溶解后，加碘化铋钾试液 1 滴，即生成橙红色沉淀。,沉淀反应,阿普唑仑 ChP（2005）P300 鉴别 （1）取本品约 5mg，加盐酸溶液（91000）2ml 溶解后，分为两份：一份加硅钨酸试液 1 滴，即生成白色沉淀；另一份加碘化铋钾试液 1 滴，即生成橙红色沉淀。,2.水解后重氮化偶合反应 氯氮卓、艾司唑仑、奥沙西泮,氯氮卓 ChP（2005） 鉴别 （1）取本品约 10mg，加盐酸溶液（12）15ml，缓缓煮沸 15 分钟，放冷，溶液显芳香第一胺类的鉴别反应（附录）。氯氮卓和奥沙西泮，其反应如下：,3.水解后呈茚三酮反应 地西泮,4. 硫酸-荧光反应 本类药物溶于硫酸后，在紫外光（365nm）下，显 不同颜色的荧光。例如：,地西泮 黄绿色 黄色 氯氮卓 黄色 紫色 艾司唑仑 + H2SO4 亮绿色 + 稀硫酸 天蓝色 硝西泮 淡蓝色 蓝绿色 奥沙西泮 淡黄绿色,地西泮 ChP（2005）P179 鉴别 （1）取本品约 10mg，加硫酸3ml，振摇使溶解，在紫外灯（365nm）下检视，显黄绿色荧光。,5. 分解产物的反应,地西泮 ChP（2005） 鉴别 （4）取本品 20mg，用氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，以 5% 氢氧化钠溶液 5ml 为吸收液，燃烧完全后，用稀硝酸酸化，并缓缓煮沸 2 分钟，溶液显氯化物的鉴别反应（附录 ）。,本类药物多为有机氯化合物，用氧瓶燃烧法 破坏，显氯化物反应。Ch.P用于地西泮和三唑仑 药物的鉴别。,5. 氯化铜焰色反应 分子结构中含有氯元素的药物，在铜网上燃烧 发出CuCl2绿色火焰。此反应药典未用于本类药物鉴别。,（二）紫外特征吸收和红外吸收光谱 药物名称 溶 剂 浓度（g/ml） max（nm） A 地西泮 0.5%硫酸甲醇溶液 5 242 约0.51 282 约0.23 366 氯氮卓 盐酸溶液(91000) 7 245,308 阿普唑仑 盐酸溶液(91000) 12 264 盐酸氟西泮 硫酸甲醇(136) 10 2392,2842 比值1.952.50 3622 氯硝西泮 0.5%硫酸甲醇溶液 10 2392,3072 奥沙西泮 乙醇 10 229, 3152(较弱) 红外吸收光谱:已用于地西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、盐酸氟西 泮、氯硝西泮和奥沙西泮的鉴别。,TLC法 1.常用的五种苯并二氮杂卓类药物的TLC法 按常规法点样10l于硅胶G薄层板上，以苯-丙酮（3 ：2）为展开剂,饱和15min，用上行法展开15cm，挥发溶剂，用稀硫酸喷雾，于105干燥30min，置紫外灯下检视荧光斑点，结果见表8-6。,2.酸水解产物的TLC法 利用苯并二氮杂卓类药物经酸水解产生的二苯甲酮衍生 物进行鉴别。由于不同的苯并二氮杂卓类药物水解后可能会 获得相同的二苯甲酮衍生物，因此本法的专属性较差。,三、特殊杂质的检查,（一） 有关物质的检查 Ch.P 收载的八种本类药物，除氯氮卓外，其余均作此项检查。其检查方法除了三唑仑采用GC法外，其余均用TLC法进行检查。USP(24)和BP(2000)中对氯氮卓都规定了此项检查， 而且均用TLC法进行检查。 1. 地西泮中有关物质的检查 地西泮在合成过程中因其副反应，可能引入N-去甲基苯甲二氮卓及化学结构不清的 有关物质， 地西泮的原料及片剂 可采用TLC 高低浓度对比法,地西泮中有关物质的检查，检查方法为：取本品，加丙酮制成1ml含100mg的溶液作为供试液；精密量取供试液适量，加丙酮制成1ml中含0.3mg的溶液，作为对照液。吸取上述两溶液各5l，分别点于同一硅胶板上，进行检查，其杂质限量为,A.0.03% B.0.02% C.3% D.0. 3% E.0.1%,2. 氯氮卓中有关物质的检查 USP（24） TLC规定其分解产物2-氨基-5-氯-2-苯甲酮含量不得 过0.01%；中间体7-氯-1，3-二氢-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮杂卓-2-酮-4-氧化物含量不得过0.1%。 氧化物、氨基物 杂质对照品法 有关物质 参比杂质对照品法 BP（1998）TLC 高低浓度对比法,3.氯氮卓中有关物质的反相高效液相色谱法 色谱条件：色谱柱为250mm2.6mm（i.d.）Nucleosil10C18柱；n=3000；流动相为甲醇-磷酸液(0.05mol/L)(60:40),40%氢氧化钠溶液调pH为6.0； 流速为1ml/min;紫外检测器波长为254nm。 检测结果：氨基物（）的tR为12.0min、 氧化物（）的tR为4.3min， 痕量杂质（、）的tR为13.8、3.6、4.7min。,（二）降解产物的检查 地西泮注射液 分解产生2-甲氨基-5-氯二苯甲酮 HPLC 主成分自身对照法,1. 峰面积归一化法,取一定量供试品溶液进样，测定各杂质及药物的峰面积，计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率，不能超过限量。注意溶剂峰不应计算在总峰面积内。,优点：不需杂质对照品，简便易行。,缺点：检测波长处，各杂质和药物的吸收强度可能有差异，控制杂质峰面积百分率不一定就是杂质限量，准确度差。,2. 主成分自身对照法,杂质峰面积与主成分峰面积相差悬殊时应用。,方法,分别进样，测定供试品溶液中各杂质峰面积及其总和，与对照溶液主成分峰面积比较，控制供试品中杂质的量。,优点：不需杂质对照