课件：脊髓损伤的修复与再生.ppt

神经系统损伤的普遍性,治疗的艰巨性,脊髓损伤与修复,阮怀珍 教授 神经生物学教研室 Tel：753672 E-mail: ,Spinal Cord Injury and Regeneration,教学目的,掌握:神经损伤后胞体和轴突的反应 影响脊髓损伤后神经再生的因素 理解:脊髓继发性损伤的机制 脊髓损伤模型的制作 了解:髓损伤研究的现状与策略,教学重点： 神经损伤后胞体和轴突的反应 影响脊髓损伤后神经再生的因素 教学难点： 脊髓继发性损伤的机制因 教学对象： 硕士研究生,使用教材： 医用神经生物学基础，蔡文琴主编 参考资料： 神经生物学-从神经元到脑，杨雄里等译 神经科学基础，李继硕主编 网络信息资源： 教研室网站 49/ 军队院校网络教学应用系统1/mta/VirClass/VMList.htm,全球不同的国家，脊髓损伤的年发病率为15/100万-40/100万。 美国每年约有1万例新的SCI患者 我国上海SCI的年发生率约为13.7/100万以上。,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)基础研究主要集中在三个方面： (1）脊髓损伤后脊髓内继发病理改变的预防和逆转。 (2）脊髓损伤后功能受损但结构完整的神经细胞功能的恢复。 (3）脊髓损伤后被离断的神经连续性的重建，即脊髓的再生或脊髓移植。,一、神经损伤后胞体和轴突的反应 二、脊髓继发性损伤的机制 三、脊髓损伤模型 四、实验性脊髓损伤的观察评定方法 五、影响脊髓损伤后神经再生的因素 六、脊髓损伤的内源性保护性因子 七、脊髓损伤的治疗策略 八、脊髓损伤修复的实验研究,主要内容,受损轴突远端发生溃变 近端轴突发芽 损伤区周围的胶质细胞增多 巨噬细胞向损伤处迁移 神经元形态、生化及代谢变化 ,外周神经系统(PNS)和中枢神经系统（CNS）损伤后 基本的损伤反应：,一、神经损伤后胞体和轴突的反应,1、轴突损伤后神经元形态和功能的改变,胞体,轴突近端,轴突远端,急性期反应特征 CNS、PNS相似(逆行性反应-虎斑溶解) 尼氏体分散、消失 *染色质溶解 chromatolysis *细胞核偏移 *细胞体肿胀 *突触末梢的减少 ,（1）形态学改变,（2）神经元化学标志物的变化,大多数轴突损伤的神经元-电活动的增强.再生恢复。,（3）电生理学变化,多数情况下，具有共同的形态、功能、投射或发育特征的神经元轴突损伤后有相似的胞体反应,2.轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素,（1）神经元类型,相同的神经元群在动物的不同年龄段对轴突损伤的反应性不相同,出生后早期几天是运动神经元的易损期,Adult,Baby,（2）动物的年龄,外周神经轴突损伤后神经元多存活，条件适宜时神经可以再生,成年动物中枢神经系统神经元轴突损伤后神经元常死亡,（3）轴突延伸的环境,神经轴突的侧支的位置与数量 轴突损伤部位与神经元胞体间的距离,（4）从损伤区到神经元胞体的距离,神经元保持适宜的兴奋性，可促进其在轴突损伤后的存活,在药物诱发的低血钠条件下，轴突切断后几乎所有的加压素类神经元均死亡，提示降低神经元的活动性可能加重神经元对轴突损伤后神经元死亡的易感性。,（5）神经元兴奋性,Degeneration-退行性变,3.神经轴突的反应轴突溃变,Intact axons in PNS and CNS,轴突变性,髓鞘的崩解、 分离脂滴球,周围的细胞吞噬。 Ast.Microglia,Macrophage 3-10 Days清净,Waller在距今150年前，首次发现和记录,（1）损伤远端轴突反应瓦勒氏(Waller)变性,清除慢2w,Olig.Ast.胶质瘢痕,（1）数个鞘髓郎飞氏结崩解 （2）近端轴突的断端坏死，出芽，生长锥 （3）吞噬细胞吞噬消化残留的坏死轴突,（2）损伤近端轴突反应,神经丝(neurofilament) 血影蛋白(spectrin) 微管相关蛋白（MAPs） 其它细胞骨架成分,崩解,钙依赖性蛋白酶(calpain),轴突断端钙内流激活蛋白酶，将使轴突骨架去组装,（3）损伤后轴突细胞骨架的变化,4. 轴突损伤反应中枢与外周的差异,（1）PNS雪旺氏细胞 vs CNS少突胶质细胞 （2）CNS中巨噬细胞的募集及清除作用不及PNS （3）CNS中小胶质细胞向吞噬细胞转变的延迟 损伤后细胞环境存在着巨大差异。,跨神经元变性,周围神经元变性仅限于受损神经元，不累及下一个神经元，而CNS受损可跨越突触引起与之接触的下一个神经元变性。称为跨神经元或跨突触变性（transynaptic Degeneration ）。,(4) 跨神经元变性（transynaptic degeneration）,半影区,Centre Region,半影区(Penumbra zone),(5)继发性CNS损伤(Secondary injury),目前认为SCI后的微循环和神经生化机制是脊髓继发性损伤的两大机制。 脊髓的微循环调节方式:化学调节、自动调节、神经调节和神经元代谢调节,二、脊髓继发性损伤的机制,白质血流的改变与创伤程度有关。 脊髓局部缺血: 血管直接损伤 血管活性物质的释放引起血管痉挛 血管闭塞、血栓形成、血栓素A2(TXA2)和白三烯的释放,1. 局部缺血,缺血、缺氧氧化磷酸化过程障碍 无氧代谢增加 PaCO2升高, PaO2及血pH值下降 ATP被耗尽Ca2+依赖性的ATP酶及Na+/K+-ATP酶失活膜去极化 Ca2+内流 导致膜磷脂的过氧化和花生四烯酸代谢及其产物增加组织进一步缺血，血管进一步痉挛。,2. 基本生化恶性循环,自由基选择性抑制前列环素 (PGI2 )的合成，使血栓素A2 (TXA2 )相对过剩。 自由基对细胞膜双磷脂结构进行过氧化作用，生成多种脂质过氧化物，损伤细胞膜，并引起溶酶体及线粒体的破裂。,3.自由基大量产生,引起血管通透性增加和组织水肿导致微血管明显收缩，但有时微血管反而呈麻痹性扩张,4. 单胺类物质过量释放,5. 内源性一氧化氮的失活,一氧化氮（NO）具有多种生物功能，主要包括：血管舒张、神经信息的传递和细胞毒作用。NO由SCI后大量释放的血红蛋白及氧自由基的作用而失活。,脊髓血管通透性增加; 加速了花生四烯酸代谢产物的释放; 对Ca2+、自由基、兴奋性氨基酸进行介导或与其协同作用. 加剧了血管痉挛、血栓形成及血管内皮损害，遏制了脊髓微循环血流量。,6. 肽类物质大量释放,内源性阿片样肽、内皮素(ET)的过度释放。,7.血小板激活因子释放增加,Ca2+内流是引起细胞死亡的最后公共通路。 Ca2+的增加能导致膜磷脂的过氧化和花生四烯酸代谢的增加，加重血管痉挛，引起组织水肿及缺血； 凝血作用增强，加重脊髓缺血和微循环障碍。 钙离子还可阻止线粒体内的电子传递，引起自由基释放，以及阻止ADP向ATP转化,8.钙离子内流,短期内EAA的瀑布性释放引起N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA受体）过度活动，导致细胞内Na+、Ca2+蓄积，进而引起组织细胞水肿并阻塞毛细血管，从而导致微循环障碍。,9.兴奋性氨基酸大量增加,理想的模型应符合以下要求: 1临床相似性: 脊髓损伤模型的制作过程与临床脊髓损伤过程相近似,动物的手术制备尽可能少 2可调控性: 调整损伤强度 3可重复性,三、脊髓损伤模型,1闭合性挫伤模型 2开放性挫伤模型 （1）脊髓背侧损伤模型： Allen于1911年首创重物坠落法。优点: 与人类脊髓损伤性相近; 脊髓损伤节段可以限定,撞击量可以调控; 硬脊膜仍完整,可以防止外源成分侵入脊髓损伤区。,（一） 急性挫伤模型,不足: 重物下坠撞击脊髓的瞬间脊柱和脊髓的不稳定及脊髓的偏向移位,导致损伤的程度就有差异。 重物坠击脊髓未及时移开,又造成不同时间的脊髓压迫伤。 实验动物的种类不同,同一类动物之间各个体大小不一样,造成各种动物截瘫的冲击量阀值尚未确定。 （2） 脊髓腹侧损伤模型,采用环套制造动物模型,（二） 切割型脊髓损伤模型,锐利的刀片横断或半横断脊髓或切除一段脊髓,造成脊髓横断性损伤或脊髓缺损。,（三） 脊髓压迫模型,采用各种不同手段(如：压迫、钳夹、气囊阻塞、结扎、电烧等。)阻断主动脉、肋间动脉、腰动脉、脊髓动脉，造成脊髓缺血而产生脊髓损伤的模型。,（四） 脊髓缺血模型,脊髓双侧皮质脊髓束纤维,（五）电解损毁模型,脊髓损伤后动物死亡的原因 创伤刺激; 失血性休克,多器官衰竭; 呼吸道、泌尿道、伤口感染; 褥疮,脊髓损伤造模术后处理,防治并发症、降低死亡率的措施： 控制室温1822,清洁笼具,尽可能单笼喂养; 预防感染:术前皮肤消毒,术中严格无菌操作,术后肌注青霉素3天; 术后注意保暖,皮下注射生理盐水或葡萄糖液,以补充血容量,预防失血性休克; 每天挤压膀胱排尿23次,直至膀胱功能恢复;肛内注开塞露,每天1次; 每天定时翻身,预防褥疮发生。,存在的问题： 实验动物的种类。 临床上大多数脊髓损伤均由骨折脱位引起，不仅脊髓组织发生机械变形，而且脊髓前后动脉也受损伤。 制造动物模型的外科技术方法的差异。 动物大小和体重。 校准损伤装置的方法等。,四、实验性脊髓损伤的观察评定方法,神经功能观察 组织形态学观察 神经电生理检查,1Gale联合评分法(the combine behavioral score, CBS): 本法最初由Gale等所创立,只包括鼠尾拍动与热板试验。现经改良,已包括开放空间中运动能力分级、脚趾伸展能力分级、触地反应能力分级、回缩反应能力、矫正反射、斜板试验与游泳试验等7个方面。,（一）SCI模型动物运动能力评分法,2. BBB分级法(the Basso, Beattie, Bresnahanlocomotorrating scale, BBB): Tarlov法将SCI后后肢运动功能评价分为05级，用此法进行损伤脊髓功能的分级评估是比较准确的,但分级过于笼统,不够精细。Basso等据此进行了改良,形成了分级为21级的较为精细详尽的BBB法。,（二）组织形态学观察,1显微镜观察：电子显微镜(elect ron microscope) 可以细致地观察神经元尼氏体、轴突、髓鞘等超微结构在SCI 前后的变化,因而在SCI 研究中被广泛应用。 2组织化学观察 ：神经丝蛋白 、胶质纤维酸性蛋白 、髓鞘碱性蛋白 、降钙素相关基因肽 、5-羟色胺 、多巴胺-羟化酶 、酪氨酸羟化酶等。,3神经束路示踪法：神经束路示踪法可以直观看到神经纤维的生长和走行,逐渐成为SCI 研究不可或缺的手段。 辣根过氧化物酶 、菜豆凝集素、麦芽凝集素 、生物素化葡聚糖胺等。,1体感诱发电位 2运动诱发电位 3交感性皮肤反应 4. 肌电图(EMG)和神经图检查 5反射检查,（三）神经电生理检查,1缺乏促进及引导轴突再生的有效神经营养因子 2缺乏合适的引导通路基质: 层粘蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）和细胞表面粘附分子（CAM）等与脊髓再生生长锥的延长有关。 LN能降解胶质瘢痕中阻碍轴突生长的蛋白多糖硫酸软骨素,五、脊髓损伤后影响神经再生的因素,CNS再生困难 成髓鞘细胞为少突胶质细胞，神经纤维无基膜包裹,？,3胶质瘢痕及空洞,CNS损伤部位: 星形胶质细胞增生、突起相互交织最终形成胶质瘢痕，GFAP染色呈强阳性。,4存在轴突生长抑制因子,髓鞘相关蛋白 Myelin-Associated Glycoprotein，MAG Nogo 少突胶质细胞髓鞘糖蛋白 Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein，OMgp 抑制性分子位于少突胶质细胞的膜上,中枢神经,周围神经,小胶质细胞、少突胶质细胞、星型胶质细胞,雪旺细胞,CNS再生困难的原因 成髓鞘细胞为少突胶质细胞；神经纤维无基膜包裹；小胶质细胞清除作用较慢；胶质瘢痕形成,阻断抑制分子：Nogo-A阻断性抗体IN-1 去除抑制分子 合适的细胞充填损伤神经周围 应用营养因子刺激神经元再生,促进中枢系统再生途径：,突触前抑制兴奋性神经递质的释放，从而降低兴奋性毒性作用； 调节K+和Ca2+通道，抑制神经元的兴奋性和胶质细胞的Ca2+过度内流，从而阻止细胞内Ca2+超载； 使血管扩张，增加脊髓的血流量，同时抑制血小板聚集，防止血栓形成。,六、脊髓损伤的内源性保护性因子,（一）腺苷,前列环素 具有很强的扩血管作用，它能对抗其它几种前列腺素(PGs) 的缩血管和血小板聚集作用，因而对SCI起着一定的保护作用。,（二）促甲状腺激素释放激素,拮抗兴奋性氨基酸和血小板活化因子的作用、促进损伤后Mg2+的恢复、稳定细胞内外阳离子平衡、稳定磷脂、改善能量代谢等。,（三）前列环素,神经节苷脂是构成神经细胞膜双脂层结构的主要成分之一,在神经细胞分化、发育、神经组织的损伤修复、神经元的可塑性以及突触传递等方面起着极为重要的作用,（四） 神经节苷脂,（五） 神经营养因子,能支持神经元存活，促进其生长、分化，维持其功能，神经元受损时可保护其存活和促进其再生的一大类化学因子.,依据早期、中期和晚期3个阶段病理生理改变 早期：减轻继发性损伤造成的损害：手术、采用离子通道阻滞剂、氧自由基清除剂，小胶质细胞活性物质抑制剂等治疗措施可以减轻神经元和胶质细胞的继发性损伤； 中期；诱导损伤轴突再生，替代损失的神经元，促进髓鞘再生； 晚期：通过康复训练，恢复损伤节段以下脊髓的功能。,七、脊髓损伤的治疗策略,1.脊髓切开：脊髓后正中线切开减压 2.硬膜切开 3.带蒂大网膜及肌瓣转移覆盖 4.脊髓缝合及移植,(一) 手术治疗,1.高压氧治疗：采用23大气压的高压氧来提高损伤脊髓组织内的氧张力，使组织修复并恢复神经功能。 2.局部低温加药物灌注：利用局部冷冻或低温降低细胞的代谢率，减少组织的氧耗量，故可增强脊髓缺氧的耐受性，减轻脊髓水肿，降低脑脊髓压力；降温还可阻止酸性物质的产生。,(二) 物理方法,1.类固醇:作用机制 对抗继发炎症反应；减轻脂质过氧化反应；抑制Ca2+细胞内蓄积,维持组织血流、氧供，抑制SCI后神经细胞凋亡。强化SCI后自身神经保护因子、营养因子、促再生因子如硫磺酸含量上升。减轻局部水肿。,(三)药物治疗,3.电场治疗：诱导神经纤维的再生，抑制胶质细胞的成熟,2.阿片受体抗抗剂 3.钙通道阻滞剂:（1）降低或拮抗花生四烯酸的活性。（2）减少血栓素-A2 的生成。（3）降低自由基及其引发的脂质过氧化。（4）改善脊髓血流量。 4.抗儿茶酚胺类药物 5.抗氧化剂和自由基清除剂,6.神经节苷脂 对抗兴奋性氨基酸毒性； 减少脂质过氧化反应和减少自由基形成； 保护胞膜Na+-K+-ATP酶活性,防止离子失衡; 防止胞内钙蓄积; 防止乳酸性酸中毒;,直接嵌入受损神经胞膜中修复胞膜; 促进多种神经生长因子作用，促进轴突和树突的发芽和再生; 调控多种炎性因子及其表达; 抑制一氧化氮合酶的活性，减少一氧化氮的合成，防止一氧化氮对神经细胞的损伤。,PN脊髓内移植能使损伤神经元发挥很大的再生潜能，生长突破宿主移植物界面。同时移植的PN对损伤脊髓两端的再生连接起到了一个有效的桥梁作用，传导再生轴突延伸较远的距离。 增加血液供应 雪旺氏细胞和神经营养因子的作用,八、脊髓损伤修复与再生的实验研究,（一）周围神经脊髓内移植,抑制胶质瘢痕形成，减少损伤脊髓区再生轴突的屏障; 营养和诱导作用,促进轴突再生并重新髓鞘化; 传导作用：连接损伤脊髓两断端的“桥状结构”，支持并引导再生轴突穿越损伤区; 代替作用：填补损伤脊髓的组织缺损，代替某些脊髓节段缺失的神经元，发出轴突，恢复神经的感觉、运动和反射功能,（二）胚胎脊髓移植,图1 单纯胚胎脊髓移植组伤后4周脊髓灰质部分神经元尼氏体溶解，核固缩 图2 损伤+移植+BDNF组伤后4周脊髓灰质神经元已恢复正常 图3 单纯脊髓损伤对照组伤后4周脊髓灰质神经元数量明显减少，尼氏体溶解，核固缩 图4 损伤+移植+NGF组伤后4周脊髓灰质神经元大部分恢复正常,1. 大鼠胚胎脊髓移植,移植后2周脊髓灰质前角BDNF免疫反应阳性细胞， 2. 损伤后2周脊髓灰质前角BDNF免疫反应阳性细胞,移植后2周脊髓灰质前角NT-3免疫反应阳性细胞，,V+F组神经元数目较多，排列紧密，分化较好。T-胚胎脊髓，H-受体脊髓,尼氏染色。,FSC组界面区胶质细胞增殖，T-胚胎脊髓，H-受体脊髓,GFAP染色。,V+F组移行区缺乏明显的胶质增生，T-胚胎脊髓，H-受体脊髓,GFAP染色。,1雪旺氏细胞 SC产生的NTF对神经元的存活具有协同作用; 表面细胞粘附分子（CAM）与轴突生长锥表面相应的分子亲和性结合。 SC分泌细胞外基质（ECM）, 改变生长锥内细胞骨架成份及第二信使反应性变化，导致轴突生长延长。,（三）细胞移植,2嗅球成鞘细胞移植 促进中枢神经元轴突的生长，其作用强于雪旺氏细胞,3.胚胎及神经干细胞移植,细胞移植,可能机理为: 替代缺失的各种神经细胞； 神经干细胞可分化成少突胶质细胞,在动物脊髓内使损伤的神经轴索再髓鞘化； 促进受损的神经元轴索再生和神经环路重建； NSCs 分化后可以分泌多种神经营养因子,改善脊髓微环境,同时产生多种细胞外基质,填充脊髓损伤后遗留的空腔,为轴突再生提供支持物。,干细胞,增 殖,迁移/分化,胶质细胞途径,神经元途径,前体细胞,靶点,形成新髓鞘,抑制瘢痕 引导轴突,以中间神经元构成通路,调节 未受损通路,替换 受损神经元,移植干细胞 诱导体内干细胞,4骨髓基质细胞移植: 5活化巨噬细胞移植：,基因治疗是指通过分子生物学技术和细胞转移技术，将特定的DNA片段转移至特定细胞，使DNA在这些细胞中得到表达，并合成蛋白。通过基因转移的方法，可以为脊髓损伤后神经生长提供一个合适的微环境，从而使轴突再生成为可能。,（四） 基因治疗,（1）合适的靶基因： 即作为替代、修复或调控的目标基因。,基因治疗的条件,（2）载体的选择： 转移载体要求转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。,用于SCI的基因转移载体主要有 逆转录病毒载体：即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。 腺病毒：重组腺病毒可以在神经元和胶质细胞中表达外来转移基因。 伴腺病毒：能整合进非复制细胞