构建疫球蛋白与细胞因子融合基因做家族特异性抗淋巴瘤疫苗.doc

构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因做家族特异性抗淋巴瘤疫苗 摘要 目的 构建免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因片段与细胞因子GM-CSF或IL-2的融合基因表达载体作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗，接种动物了解该疫苗抗淋巴瘤免疫功能。方法 从脐带血免疫球蛋白基因文库810个IgHV3/Bluescript克隆获得一些片段长度差异较大的基因片段，测序后利用生物信息资源分析预测其重链可变区的T细胞表位，同时分析本室以前构建的IgHV1个片段。选择包含了绝大多数细胞表位的IgHV1、IgHV3基因，分别将框架区(FR)为主的IgHV(FR)基因片段及IgHV(FR)与GM-CSF或IL-2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0中。表达载体通过脂质体转染COS细胞， ELISA法确定GM-CSF或IL-2的表达情况。将一些表达载体作为核酸疫苗免疫小鼠，通过间接免疫荧光法和细胞因子分泌法检测小鼠抗同一家族淋巴瘤和正常淋巴细胞的免疫反应。结果 分别将6个不同的IgHV3基因和个IgHV1克隆测序，翻译为免疫球蛋白序列，利用Rammense计算机评分系统预测这些IgHV1、IgHV3序列上分别受HLA位点限制的T细胞表位，每个IgHV序列中约存在30个左右T细胞表位，90以上的T细胞表位位于框架区，积分排位于前10的T细胞表位都位于框架区。个代表性基因剪切去除CDR3区后构建以框架区(FR)为主的IgHV(FR)和IgHV(FR)pcDNA3表达载体。另外将GM-CSF或IL-2基因连接到个IgHV基因的3端。最终获得IgHV(FR)、IgHV1(FR)GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)GM-CSF IgHV3(FR)-IL-2 种表达载体。表达载体体外转染COS细胞，检测48小时后培养上清中GM-CSF及IL-2。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0及IgHV3(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0中GM-CSF的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 200倍以上；IgHV1(FR)-IL-2 /pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0中IL-2的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 60倍以上。肌肉注射IgHV1(FR)-IL-2免疫动物组在首次免疫后第2周开始检测到抗属于IgHV1家族的淋巴瘤Namalwa细胞系的抗体，IgHV1(FR)组在首次免疫后第4周开始检测到抗Namalwa细胞抗体，IgHV3(FR)组、IgHV3(FR)-IL-2组和pcDNA3.0组小鼠始终对Namalwa细胞呈阴性反应。肌肉注射IgHV3(FR)-IL-2组在首次免疫后第2周开始检测到抗属于IgHV3家族的传代淋巴细胞系的抗体，IgHV3(FR)组第4周开始检测到抗体，而IgHV1(FR)组、IgHV1(FR)-IL-2组和pcDNA3.0组对IgHV3家族传代淋巴细胞系呈阴性反应；这些阳性血清不与K562和Daudi细胞反应，表明注射IgHV(FR)和IgHV (FR)-IL-2表达载体诱导产生的抗体可以识别属于同一家族的淋巴瘤或者其他淋巴细胞。IgHV1(FR)-IL-2 组和IgHV3(FR)-IL-2组免疫小鼠血清IFN-含量显著高于pcDNA3.0组（P0.01）；IgHV1(FR)-IL-2 组和IgHV3(FR)-IL-2组血清中IFN-含量显著比IgHV1(FR)组和IgHV3(FR)组高(P0.05)。结论 应用免疫球蛋白重链不同可变区中的框架区基因可以制备表达载体作为基因家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗，肌肉注射可以诱发小鼠的抗淋巴瘤免疫反应。同时融合了细胞因子的表达载体可以明显增强免疫反应。关键词 核酸疫苗；家族特异性；免疫球蛋白；框架区（FR）；细胞因子；淋巴瘤_ Construct immunoglobulin heavy chain variable region gene and cytokine gene co-expression vector as IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma LIU Hui1，2, ZHU Ping1, LIN Ning-Jing1, ZHANG Ying1, BU Ding-Fang1, WANG Yi-Jia1, WANG Yi-Qun1,YANG-Ying1(1Peking University First Hospital, Beijing 100034 and 2Beijing Hospital, Beijing 100730, China)Abstract Objective To construct the immunoglobulin heavy chain variable region (IgHV) gene and GM-CSF or IL-2 gene co-expression vector as IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma, and study the immune response of the immunized mice against lymphoma. Methods To obtain a set of clones whose gene fragments are difference in length from a gene bank (810 of IgHV3/Bluescript) that we construct from normal fetal umbilical cord blood before. These gene fragments in the clones were sequencing. The sequences were translated into amino acid sequences. T cell epitopes in the IgHV were predicted by bioinformatics. Meanwhile 6 clones of IgHV1 constructed by our lab before were analyzed. The most typical clone of IgHV1 and IgHV3 that contain the most of T cell epitopes were selected. The IgHV gene fragments that cut out complementary determining region 3 (CDR3) and composed mainly by framework region were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0. Meanwhile, the gene fragments of framework region of IgHV that linked with gene of GM-CSF or IL-2 were cloned into pcDNA3.0 to form fusion gene of IgHV (FR)-GM-CSF/IL-2. Then they were transected into COS cells by Lipofectin and detected their transient expressing product by ELISA. Some of expression vectors were used as nucleic acid vaccine to immunize mice. Indirect immunofluorescence staining and ELISA were used to assess the immune response against lymphoma and lymphocyte that belong same or different IgHV family. Results Six clones of IgHV3 and six clones of IgHV1 were sequencing and translated into peptides. The bioinformatics of Rammense were used to predict T cell epitopes of various HLA types in the IgHV peptide sequences. About 30 T cell epitopes existed in each IgHV peptides. Among the bioinformatics prediction, about 90% of T cell epitopes were in the framework region (FR) of IgHV, and the first 10% of higher prediction score were in FR. The CDR3 of two typical IgHV sequences were cut down and remained sequences (mainly composed of FR) were used to construct the IgHV1 (FR)/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) /pcDNA3.0 expression vectors. The 3 of IgHV1 (FR) and IgHV3 (FR) were linked GM-CSF or IL-2 gene. At last 6 of IgHV1 (FR)/pcDNA3.0, IgHV1 (FR) GM-CSF/pcDNA3.0, IgHV1 (FR)-IL-2/pcDNA3.0, IgHV3(FR)/pcDNA3.0, IgHV3(FR)GM-CSF/pcDNA3.0 and IgHV3(FR)- IL-2/pcDNA3.0 were obtained. The IgHV1 (FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) -IL-2/pcDNA3.0 were transfected into COS cells. In the supernatant, the GM-CSF and IL-2 were detected after 48 hours culture. The expression of GM-CSF in the group transfected with IgHV(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 are 200 times higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The expression of IL-2 in the group transfected with IgHV(FR)-IL-2/ pcDNA3.0 are 60 times higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The antibody against IgHV1 family lymphoma cell line - Namalwa could be detected since the second week in the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2. The antibody could be detected since the fourth week in the mice immunized with IgHV1(FR). The antibody couldnt be detected in the mice immunized with IgHV3(FR), IgHV3(FR)-IL-2 and control pcDNA3.0. The antibody against lymphocyte line of IgHV3 family could be detected since the second week in the mice immunized with IgHV3(FR)-IL-2. The antibody could be detected since the fourth week in the mice immunized with IgHV3(FR). The antibody against antibody against lymphocyte line of IgHV3 family couldnt be detected in the mice immunized with IgHV1(FR), IgHV1(FR)-IL-2 and pcDNA3.0. The antibody against K562 could not be detected in the serum of mice of all the five groups. These results indicate that the antibody against lymphoma and lymphocyte of the same IgHV family could be induced by IgHV(FR)/ pcDNA3.0 and IgHV(FR)-IL-2/pcDNA3.0. The quantity of IFN- in serum of the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 were higher than immunized with IgHV1(FR)/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)/pcDNA3.0 or pcDNA3.0（ P0.05）. Conclusion The gene fragments of IgHV(FR) could be used to construct IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma .The vaccine could induce anti-lymphoma immune response in mice by muscle injection. The expressing vectors of IgHV(FR)-GM-CSF/IL-2 could induce stronger immunoreaction. Key words nucleic acid vaccine; gene family specific; Immunoglobulin; framework region; Cytokine; Lymphoma淋巴细胞表面的免疫球蛋白可变区序列各不相同，称为独特型。利用淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白独特型可以作为抗原，诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反应。免疫反应的目标是针对独特型上的抗原决定簇。迄今许多人认为这些抗原决定簇主要位于免疫球蛋白可变区上的超变区（CDR区）。每个淋巴细胞克隆都有不同的CDR 区，如果希望利用诱导免疫反应的方法治疗淋巴瘤，必须为每例患者提供不同淋巴瘤的不同CDR 区序列上的抗原来诱发免疫反应。我课题组近期的工作发现，独特型抗原的大部分抗原决定簇位于免疫球蛋白可变区（IgHV）的框架区 1。依据免疫球蛋白框架区的不同可以把淋巴细胞或者淋巴瘤细胞分为种基因家族。制备相应的IgHV家族特异性框架区序列表达载体作为核酸疫苗，有可能诱发机体抑制相应的淋巴瘤的生长的免疫反应。如果框架区序列与某种细胞因子序列形成融合蛋白共同表达还可能加强免疫反应。本文克隆了IgHV1、IgHV3框架区基因片段，构建IgHV1、IgHV3与细胞因子IL-2 或者GM-CSF的共表达载体，作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗注射给小鼠，观察到这种类型的核酸疫苗可以成功诱发抗淋巴瘤免疫反应。 材料与方法1. 克隆免疫球蛋白重链可变区基因片段：本室建立脐带血免疫球蛋白基因文库中IgHV3有810个IgHV3/pBluescript克隆，在2琼脂糖电泳选择片段长度差异较大的6个IgHV3片段测序，生物信息资源分析计算机评分系统预测选择最适片段。含IgHV1家族个片段的IgHV1/pcDNA3克隆是本室以前构建的2，同样用计算机评分系统预测选择最适片段。2生物信息资源分析计算机评分系统预测T细胞表位：通过http:/www.expasy.ch /tools/DNA.html，将得到的IgHV1、IgHV3重链可变区的核酸序列翻译为氨基酸序列；在http:/ www.ncbi. /Igblast基因库，与胚系重链可变区的氨基酸序列比较同源性，区分出4个框架区（FR）和3个超变区（CDR）；利用Rammense4 计算机评分系统预测获得的IgHV1、IgHV3编码序列上位点限制性T细胞表位。确定细胞表位分布，选择代表性序列构建表达载体。3构建IgHV3、IgHV1去除CDR3区的真核表达载体：根据T细胞表位预测结果从IgHV1、IgHV3序列中各选取1个在多种HLA型别均具有较高积分T细胞表位的序列为模板，PCR获得IgHV1、IgHV3框架区基因片段，上游引物设计在IgHV1、IgHV3的引导区内，5端设计了Kozak序列及KpnI的酶切位点；下游引物分别设计在它们的FR3区，5端设计了终止密码子及EcoRI的酶切位点，序列如下：VH1上：5TATAGGTACCACCATGGACTGGACCTGGAG3VH1下：5TTAAGAATTCCTATCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3上: 5TATAGGTACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG3VH3下：5TTAAGAATTCCTAAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT325ml反应体系含1.5 mmol/L MgCl2、1buffer（Promega）、0.1mmol/L 4dNTP （Promega）、0.25mmol/L引物、50-100ng模板DNA和1.25IU TaqDNA聚合酶（Promega）；94预热5分钟后接30个循环（9430秒，5630秒，7230秒），72延伸7分钟。PCR产物经KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司）。4构建IgHV1、IgHV3和细胞因子融合基因真核表达载体：PCR获得3端含接头（linker）的IgHV1和IgHV3框架区基因片段:上游引物分别与VH1上和 VH3上相同，下游引物分别设计在它们的FR3区，5端设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为linker，序列如下：VH1(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACCGGATCCACCGCCACCTCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACCGGATCCACCGCCACCAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT3PCR反应条件同上。 PCR获得5端含linker的GM-CSF和IL-2基因片段: 用PcD-hIL-2和P-hGM-CSF质粒（北京大学医学部免疫教研室马大龙教授惠赠）作为模板扩增hIL-2基因和hGM-CSF基因，在GM-CSF和IL-2基因上游引物5端设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为接头（linker），下游引物5端设计了终止密码子及EcoRI的酶切位点，序列如下：hGM-CSF上：5GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCA 3hGM-CSF下：5TTAAGAATTCCTAACTCCTGGACTGGCTCCCAGC3h-IL-2上：5GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG3h-IL-2下：5TTAAGAATTCCTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC3PCR反应条件同上。将IgHV1和IgHV3框架区基因片段分别与GM-CSF和IL-2基因片段连接形成融合基因，取IgHV1和IgHV3框架区基因片各1ul分别与GM-CSF和IL-2基因片段1ul混匀，在PCR仪上94C变性10分钟，逐渐退火，每30秒下降10C，至温度下降至30C。在退火产物中加入Klenow片段、dNTP、buffer和去离子水室温30分钟，75C 10分钟灭活Klenow片段。各取1ul上述反应产物为模板进行PCR扩增IgHV1（FR）-GM-CSF、IgHV3（FR）-GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2 和IgHV3(FR)-IL-2融合基因, 上游引物分别用VH1上及 VH3上，下游引物分别用GM-CSF和IL-2的下游引物。PCR反应条件同上。PCR产物经KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中构建IgHV1、IgHV3和细胞因子融合基因真核表达载体。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司）。将IgHV(FR)/ pcDNA3.0、IgHV(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0和IgHV(FR)-IL-2/ pcDNA3.0在TOP10菌中大量扩增，用QIAgen Giga 无内热源质粒提取试剂盒大量提取质粒。IgHV1、IgHV3和细胞因子融合基因真核表达载体在体外表达：通过脂质体介导法瞬时转染COS细胞（非洲绿猴肾细胞系），在6孔板上接种2105COS细胞（2ml/孔），37C CO2培养箱中培养24小时后每孔细胞贴壁约60，细胞生长状态好。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0、IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0各复种2孔，以pcDNA3.0空质粒复种2孔作为阴性对照。按照Invitrogen公司提供的转染程序进行，脂质体Lipofectic:DNA为3：1（V/W）,导入外源DNA2ug/孔。转染48小时后取培养上清，通过双夹心ELISA法（DIACLONE公司）检测上清中的GM-CSF及IL-2表达量。. 免疫动物获得抗血清：将20只68周的健康纯系雄性Balb/c小鼠随机分为五组，每组4只。第1组注射IgHV3(FR)/pcDNA3.0。第2组注射IgHV3(FR)-IL-2/ pcDNA 3.0。第3组注射空质粒载体pcDNA3.0作为对照组。第4组注射IgHV1(FR)/pcDNA3.0。第5组注射IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0。预先在小鼠双侧股四头肌注射0.25%盐酸布比卡因，每侧50l，3天后分组免疫。各小鼠分别于第0、2、4周各免疫一次，共三次,100g/次。分别于第0、2、4、6、8周经小鼠眼内眦血管取血留取血清。7. 间接免疫荧光法检测小鼠免疫后抗Namalwa细胞和抗正常淋巴细胞抗体的生成情况：将淋巴瘤Namalwa(IgHV1家族)细胞、正常IgHV3家族B淋巴细胞、淋巴瘤Daudi细胞(非IgHV1、IgHV3家族)及红白血病K562细胞（5105/ml）离心机甩片，丙酮固定；将5组血清按一定比例稀释作为一抗，FITC标记的兔抗小鼠免疫球蛋白（DAKO公司）作为二抗，荧光显微镜下读片。实验中设置3种阴性对照：以1：40稀释的免疫前小鼠血清作为一抗，一抗和二抗均用PBS代替，仅一抗用PBS代替。8. 双夹心ELISA法检测小鼠免疫后血清中IFN-含量。按照晶美公司试剂盒说明。9. 统计学处理：将各组的小鼠血清抗体滴度取负对数后，采用t检验进行比较。各组的小鼠血清的IFN-含量采用t检验进行比较。 结 果1获得免疫球蛋白重链可变区基因片段：从脐带血免疫球蛋白基因文库中有810个IgHV3/pBluescript克隆获得片段长度均介于400500bp之间IgHV3基因片段，克隆产物经KpnI和EcoRI酶切后出现预期条带，选取6个片段长度差异较大的IgHV3/pBluescript阳性克隆测序，测序结果显示获得了IgHV3基因家族不同的片段，主要差异位于CDR3区（序列图略）。2生物信息资源分析选择IgHV1、IgHV3：6个新构建的IgHV3/pBluescript阳性克隆和本室保存的6个IgHV1/pcDNA3.0阳性克隆的IgHV基因和编码氨基酸序列在 /Igblast基因库与胚系重链可变区序列比较同源性。Rammense计算机评分系统预测这12个克隆的T细胞表位，积21分以上定为T细胞表位。每个IgHV1、IgHV3基因上有分别受HLA-A1、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*26、HLA-A3、HLA-B*2705、HLA-B*4402、HLA-B*5101和HLA-B8等位点限制的T细胞表位30个左右，其中90以上的T细胞表位位于框架区，而且积分排位于前10的T细胞表位都位于框架区。将分析到的T细胞表位所在序列与本课题组以往克隆的急性淋巴细胞白血病可变区序列3及Lefranc5报导的胚系可变区代表序列分析到的T细胞表位所在序列进行同源性分析，选择家族特异性、代表性的IgHV1、IgHV3序列各一构建表达载体。3获得IgHV1、IgHV3家族特异性真核表达载体：IgHV1、IgHV3各1个在多种HLA型别均具有较高积分T细胞表位的序列为模板，PCR扩增其框架区基因片段，片段长度约350bp左右，产物经KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中，获得IgHV1(FR)/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)/ pcDNA3.0，两者经KpnI和EcoRI酶切后出现预期条带（图1，2），测序结果分别与IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript测序结果比较，证实在IgHV1(FR)/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)/pcDNA3.0去掉了IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript的CDR3区，保留了其FR区，成功构建IgHV1、IgHV3框架区组成的家族特异性真核表达载体。4获得IgHV1、IgHV3和细胞因子融合基因真核表达载体：经PCR获得在5端包含编码10个氨基酸序列接头（linker）的IgHV1(FR)和IgHV3(FR)片段，长度约380 bp左右；同时经PCR获得在3端包含编码10个氨基酸序列接头（linker）的GM-CSF和IL-2片段，片段长度分别为418bp和429bp；将IgHV1(FR)和IgHV3(FR)片段分别与GM-CSF和IL-2片段连接，经PCR扩增分别获得IgHV1(FR)GM-CSF 、IgHV1(FR)-IL-2、 IgHV3(FR)-GM-CSF和IgHV3(FR)-IL-2融合基因片段，片段长度约800 bp，产物经KpnI和EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0中，得到IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV3(FR) -GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0。表达载体质粒经KpnI和EcoRI酶切后出现预期条带（图1，2）。将融合基因质粒进行双向测序，结果显示融合基因序列完全正确，无移码突变和碱基错配。5IgHV1、IgHV3和细胞因子融合基因真核表达载体可以在体外表达： ELISA检测瞬时转染COS细胞48小时后培养上清中GM-CSF及IL-2的表达量（表1）。培养上清中IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0及IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0中GM-CSF的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 200倍以上；IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0中IL-2的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 60倍以上。说明IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0可在体外暂时表达并分泌GM-CSF; IgHV1(FR)-IL-2/ pcDNA3.0和IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0可在体外暂时表达并分泌IL-2。6.免疫动物血清抗体可识别同家族淋巴瘤细胞或者同家族淋巴细胞的独特型抗原:5组免疫动物第2、4、6、8周鼠血清与IgHV1家族淋巴瘤细胞系Namalwa细胞反应， IgHV1(FR)-IL-2组在首次免疫后第2周开始检测到抗Namalwa细胞抗体，IgHV1(FR)组在首次免疫后第4周开始检测到抗Namalwa细胞抗体，IgHV3(FR)组、IgHV3(FR)-IL-2组和pcDNA3.0组小鼠的血清始终呈阴性反应；5组免疫动物第2、4、6、8周鼠血清与IgHV3家族正常淋巴细胞系细胞反应， IgHV3(FR)-IL-2组在首次免疫后第2周开始检测到抗体，IgHV3(FR)组在首次免疫后第4周开始检测到抗体，IgHV1(FR)组、IgHV1(FR)-IL-2组和pcDNA3.0组小鼠的血清始终呈阴性反应；小鼠阳性血清分别与K562和Daudi细胞行间接免疫荧光检测不与K562和Daudi细胞反应（图3）。进行血清倍比稀释发现出现阳性反应的组在第6周时抗体滴度达到高峰，第8周开始下降（表2,图4,5）。将第1组(IgHV3(FR)组)和第2组(IgHV3(FR)-IL-2组)以及第4组(IgHV1(FR)组)和第5组(IgHV(FR)-IL-2组)小鼠免疫后6周血清的抗体滴度取负对数行t检验，结果显示第2组抗体滴度高于第1组,第5组抗体滴度高于第4组,差异具有统计学意义P0.05(分别为0.049825和0.024008)。 7. 免疫动物血清中IFN-含量的检测: IgHV1(FR)-IL-2 组和IgHV3(FR)-IL-2组与pcDNA3.0组相比具有显著统计学差异, P值分别为0.000453和0.000959 ；IgHV1(FR)组和IgHV3(FR)组血清中IFN-含量与pcDNA3.0组相比无统计学差异(P值分别为0.464644和0.356843)（表2）；IgHV1(FR)-IL-2 组和IgHV3(FR)-IL-2组小鼠血清中IFN-含量比IgHV1(FR)组和IgHV3(FR)组高，差异具有显著统计学意义,P值为0.000134。讨 论尽管肿瘤的化疗和放疗取得了很大进展，但是这些疗法缺乏特异性，目前已经认识到，只有调动患者自身的免疫功能，才有望治愈肿瘤。肿瘤的免疫治疗需要了解肿瘤相关抗原。淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白独特型抗原可以作为肿瘤抗原，诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反应。这种免疫反应的目标是针对独特型上的抗原决定簇。我们注意到6，B淋巴细胞依据免疫球蛋白重链可变区(IgHV)基因标记分类，可以分为IgHV1-IgHV7个基因家族。正常人体内分属个家族的B细胞共同执行免疫功能，各占一定的份额。如果某一家族的淋巴细胞克隆性扩张而且失控，会导致淋巴系统恶性肿瘤；如果各家族淋巴细胞所占份额异常，免疫反应失衡，也可能导致自身免疫疾病。淋巴瘤同样可以根据基因类型分成7个基因家族，利用这一特征有可能发展针对某一基因淋巴瘤的新型免疫治疗方法。各个IgHV基因家族的框架区完全相同,CDR有所不同。迄今许多人认为这些抗原决定簇主要位于免疫球蛋白可变区上的互补决定区（CDR），主要在CDR3区，每个淋巴细胞克隆都有不同的CDR3 区。如果希望利用诱导免疫反应的方法治疗淋巴瘤，必须为每例淋巴瘤患者制备不同的CDR3序列上的抗原来诱发免疫反应。我课题组近期的工作发现，事实上独特型大部分抗原决定簇位于免疫球蛋白可变区（IgHV）的框架区 1。我们从正常新生儿脐带血标本获得IgHV1、IgHV3基因片段的框架区基因与正常胚系序列及B-ALL序列高度同源2，能代表其同一IgHV基因家族的共同特性，即具有IgHV家族特异性，如果在框架区存在能诱发免疫反应的抗原决定簇，则有可能制备出由框架区编码基因构成的IgHV家族特异性基因疫苗。我们利用Rammense4计算机评分系统预测从脐带血获得的IgHV1、IgHV3基因上分别受HLA-A1、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*26、HLA-A3、HLA-B*2705、HLA-B*4402、HLA-B*5101和HLA-B8等位点限制的T细胞表位，预测结果显示，在每个IgHV序列中约存在30个左右T细胞表位，其中90以上的T细胞表位位于框架区，而且积分排位于前10的T细胞表位都位于框架区，提示能诱发免疫反应的抗原决定簇主要在在框架区，而且不同的HLA分子均可以在框架区内找到与其匹配的抗原决定簇。我们在前一实验中3（中华医学杂志待发表）曾经体外合成了一段预测的T细胞表位是HLAA*0201识别的IgHV1框架区的9肽。用它作为抗原刺激T2细胞，可使T2细胞表面MHC分子表达增高，再进一步把T2作为抗原呈递细胞（APC），与HLAA0201人的外周血相作用，通过四聚体检测外周血中肽特异性CTL细胞数量，外周血中肽特异性CTL细胞数量明显增加，证实框架区9肽确实可以诱导肽特异性CTL细胞免疫反应。国外一课题组 7-8测定了192例淋巴系统肿瘤患者的IgHV序列，也发现相当多的抗原决定簇位于框架区，而且效价高的都集中在框架区。我们设想，既然在IgHV框架区存在高效价抗原决定簇，有可能用IgHV框架区基因制备IgHV家族特异性基因疫苗，解决必须为每例患者制备个体化的独特型疫苗的问题。因此我们从正常新生儿脐带血标本获得IgHV1、IgHV3基因片段中找出IgHV同一基因家族的共同特性，克隆其框架区基因片段到真核表达载体，探讨制备IgHV家族特异性抗淋巴瘤基因疫苗的可能性。为了加强免疫反应，我们将GM-CSF或IL-2与IgHV1和IgHV3框架区基因构建于同一载体中，使细胞因子在最适的地方及时间表达分泌，从而最高效地发挥其免疫增强作用，在构建IgHV(FR)-GM-CSF和IgHV(FR)-IL-2融合基因时，我们在引物中设计了包含编码10个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列（Gly- Gly- Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly-Ser）作为接头,甘氨酸结构简单，易于折叠，对融合蛋白的立体构象影响小，从而使表达的IgHV(FR)、hGM-CSF及hIL-2的空间构象尽量与天然产物相近，以保持其生物学活性。最终获得了IgHV1(FR)、IgHV1(FR)GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)GM-CSF IgHV3(FR)-IL-2 种表达载体。比较空质粒pcDNA3.0与融合基因克隆转染COS细胞后GM-CSF和IL-2的表达量，发现融合基因表达载体能在真核细胞中有效表达并分泌GM-CSF和IL-2。动物实验表明融合基因表达载体能诱导出更强的免疫反应。IgHV(FR)、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)-IL-2 4种表达载体免疫小鼠（GM-CSF人鼠不同源而未作）均可以使小鼠产生抗同一家族淋巴瘤细胞的特异性抗体，该抗体可以识别同一家族淋巴瘤细胞表面的天然抗原决定簇，不识别其它淋巴瘤细胞表面抗原决定簇，也不识别K562细胞，提示所产生的抗体是基因家族特异性的；细胞因子连接组免疫动物所产生的抗体滴度更高。连接细胞因子的表达载体免疫动物不仅可以诱导动物产生特异性抗体，而且可以增强被免疫动物的细胞因子IFN分泌，从而有可能通过细胞因子进一步起到抗肿瘤的作用。免疫小鼠所产生的免疫反应还可以作用于同一基因家族的正常淋巴细胞，由于淋巴瘤往往是肿瘤患者体内主要淋巴细胞克隆，某一基因家族的正常淋巴细胞所受影响与肿瘤恶性进展相比，副作用有限。IgHV家族特异性基因疫苗调控某一群淋巴细胞生长的功能还可能有其它应用潜力。许多文献9报道系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化等自身免疫病发生淋巴细胞亚群的平衡紊乱，出现了寡克隆淋巴细胞增殖，如果能够控制其生长就有可能治疗自身免疫疾病。 参 考 文 献1. 张野坪,朱平,石永进等. TCR抗原决定簇DNA疫苗诱导抗淋巴瘤免疫反应的分子机理. 中华血液学杂志, 2002;23:68-72.2. 林宁晶,朱平,张野坪等.组合免疫球蛋白基因疫苗诱发小鼠抗淋巴瘤体液免疫反应 中华医学杂志, 2002;82:766-770.3. 刘英,朱平,胡亚美. 急性B淋巴细胞白血病免疫球蛋白框架区肽作为T细胞表位体外扩增肽特异性细胞毒T细胞 中华医学杂志,待发表.4. Rammense HG , Bachmann J . SYFPEITHY : database for MHC ligands and peptide motifs . Immunogenetics ,1999 ;50:213-2195. Lefranc MP . IMGT , the international immunogenetics database . Nucleic Acids Research , 2001 ; 29 : 207-209 .6. 朱平，刘继华.急性淋巴细胞白血病恶性克隆的免疫球蛋白基因特征分析. 中华医学杂志,2001;81:1057-1061.7. Harig S, Witzens M , Krakhardt, et al: Induction of cytotoxic T-cell responses a