分生实验报告DNA的限制性酶切与回收.docx

实验五DNA的限制性酶切与回收【实验原理】1.限制性核酸内切酶是能够识别特异DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。其中类限制性内切酶是重组DNA技术的基本工具酶。经其切过的DNA有两种不同的切口：平端切口和黏端切口。本实验利用EcoR和BamH对质粒DNA进行双酶切，产生带有粘性末端的DNA片段。粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。2.经过电泳的DNA条带需要回收，进一步分离纯化以获得纯度较高的DNA片段。可先后使用溶胶液，漂洗液，和洗脱液将DNA回收。3.酶切缓冲液成分及作用： Tris-HCl，维持pH在7.48.0； Mg2+，内切酶活性所必需； NaCl/KCl，增加离子浓度，利于酶活性； 二硫苏糖醇(DTT)，保护酶，防止二硫键的形成4.星号活力限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称为星号活力。星号活力出现的原因：酶用量太大 100U / ug DNA。酶切体系中离子强度太低，12%)；有机溶剂的存在。5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。7.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。8.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。9.高于37或需长时间保温时，可加入矿物油覆盖在反应液上以减少水分蒸发。10.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。11. 不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。12.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。13.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。14.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。15. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。【实验结果】【实验分析】1. pUC18的凝胶中，右边凝胶条带色浅，混作一团，实验失败，可能是酶活性不足。左边凝胶条带分割明显，但颜色较浅，可能因为含量较少。或者因为胶失水过多，或者有碎胶影响其游走。pUC18经EcoR和BamH两种酶切之后，预期结果得到21bp和2.67kb两种DNA片段，本实验则要选取2.67kb作为载体。在marker中，最亮的那条条带为2kb的DNA片段，2.67kb的目的载体DNA条带片段正好在marker最亮条带的下方，另一条21bp的片段由于分子量太小，游动快，位于marker的最小条带的前方，符合实验预期。因此，该凝胶中，左边条带实验比较成功，回收时只需切割2.67kb的条带即可。2.Sp1的凝胶中，中间组凝胶中DNA游走不明显，DNA混作一团，可能是酶活性不足等导致实验失败。而左侧组较为成功，凝胶中的条带分成较为明显的三条条带，较符合实验预期。切割凝胶时，应选择左边凝胶，但是其在胶最前面仍有小的亮带，可能是有RNA混杂。而右侧组出现了不应该出现的DNA条带分离，可能是将SP1和Puc18误混导致。分析原因， DNA由于酶切不完全，大部分DNA没有被切开，导致上样的DNA样本分子量大，游走缓慢，结果中只有一条明显的条带，与少数不明显的浅条带。经与marker相比较，左边条带的结果较符合预期。Sp1所在基因经EcoR和BamH两种酶酶切得2.2kb和4.9kb两