课件：第七章活性菌类及其加工技术.ppt

功能性食品,食品营养与工程学院,第七章 活性菌类及其加工技术,了解双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌的概念、种类、微生态机体调节功能。 了解保健食品加工中常用双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌的分离、纯化、鉴定和发酵剂制备工艺技术。 掌握两歧双歧杆菌和保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌的特性、菌种扩大培养技术以相应功能性食品的生产工艺。,第一节 人体正常肠道菌群,一、人体肠道菌群与健康的关系 致病菌 人体肠道内细菌分类 机会性病原微生物 有益菌,致病菌 主要包括假产气菌、变形杆菌、葡萄球菌、梭状芽孢杆菌等。 性质：既能致病又能产毒素，是腹泻、便秘、肠道感染、肝损伤、癌症和脑炎的罪魁祸首。,葡萄球菌,致病菌,产气杆菌,现称“产气荚膜杆菌”，更多称其为“产气荚膜梭菌”，广泛分布于自然界以及人和动物肠道中的厌氧芽胞杆菌，是气性坏疽的主要病原菌。气性坏疽是战时多见的一种严重的创伤感染，以局部水肿、产气、肌肉坏死及全身中毒为特征 。,致病菌,变形杆菌,人和动物的寄生菌和病原菌。 肠细菌科中的一属革兰阴性运动细菌。变形杆菌广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内。 可引起多种感染。常见感染有呼吸道感染、腹泻、尿路感染、腹膜炎、中耳炎，还可引起食物中毒 。,致病菌,变形杆菌 引起的食物中毒,食品的染菌率自3.8%100%，其中以鱼、蟹和肉类染菌率较高。食品感染率高低与食品新鲜程度、运送时卫生状况密切相关。夏秋季节发病率较高。 变形杆菌食物中毒是由于进食被变形杆菌污染的食物导致的中毒。一般分为胃肠炎或过敏反应两种表现。可出现严重脱水和酸中毒，甚至休克、心衰等严重并发症。,葡萄球菌,葡萄球菌属，是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。多数为非致病菌，少数可导致疾病。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是医院交叉感染的重要来源。,致病菌,梭状芽孢杆菌,为厌氧性革兰氏阳性杆菌，罐装食品中引起腐败的主要菌种，解糖嗜热梭状芽孢杆菌。可分解糖类引起罐装水果、蔬菜等食品的产气性变质。 腐败梭状芽孢杆菌可以引起蛋白质食物的变质。肉类罐装食品中最重要的是肉毒梭状芽孢杆菌，其芽孢产生在菌体的中央或极端，芽孢耐热性极大，能产生很强的毒素。,致病菌,机会性病原微生物 包括肠球菌、大肠杆菌、链球菌等。 性质：在人体抵抗能力减弱时可致病，产生毒素，产生致癌因子和在肠内起腐败作用；但在人体健康时又能抑制外来有害菌的生长，刺激免疫功能的产生，合成某些维生素。,大肠杆菌,机会性病原微生物,肠球菌属,肠球菌属， 细胞球形或卵圆形，0.62.0m 0.62.5m，在液体培养基中呈成对或短链。不生芽孢。革兰氏阳性。有时以鞭毛运动。没有明显的荚膜。兼性厌氧。化能异养，发酵代谢；可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产L(+)-乳酸，但不产气，最终pH4.24.6，营养需要复杂。,机会性病原微生物,大肠杆菌,大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症，是人类和大多数温血动物肠道中的正常菌群。 但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。,机会性病原微生物,大肠杆菌 引发的食物中毒,大肠杆菌0 157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括我国等许多国家都有报道，且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157：H7引起肠出血性腹泻，约27的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危急生命。,案例,2008年4月1日中午12时， 村民姜某在家中举办生日宴，邀请亲戚朋友63人共进午餐，当晚18时40分出现首例病人。就餐人数63人，发病人数23人，罹患率36、51。其中男性10例，女性13例，末例病人发病时间为4月2日20时50分。病人最短潜伏期6 小时，最长潜伏期26小时，平均潜伏期16小时。所有病例均有共同的饮食史，都是4月1日生日宴就餐人员，未就餐者未发现类似病例。经调查23例患者均有进食同一凉拌拼盘食物史，而同桌进餐未吃该拼盘者（其它主、副食均一致）未发病。因此，确定该凉拌拼盘食品是引起食物中毒的可疑食物。 为了举办这次生日宴， 该村民于3月31日在自家厨房加工肉肠及熟食制品，加工场所简陋、生活垃圾和动物粪便随处可见，卫生条件极差，加工用具、容器、餐具在使用前没经过有效的消毒和洗涤，生熟食品混放，生熟刀案混用，使食品在制作和存放过程中受到严重污染。,链球菌,链球菌(Streptococcus)是化脓性球菌的另一类常见的细菌，广泛存在于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，新生儿败血症，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。,返回,机会性病原微生物, 有益菌 包括乳酸菌、双歧杆菌和一些真菌。 性质：能抑制外来有害菌生长，调节机体免疫功能，帮助人体结肠中残余食物的消化吸收，以及合成某些维生素。,乳酸菌, 有益菌,1 益生菌的概念,益生菌(probiotics)是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物。,人们对益生菌的认知过程,随着研究的深入,益生菌的定义在不断的变化； 1965年，Lilly提出“益生菌是对饲养动物肠道菌群平衡有益的促进物或微生物”； 1991年，对益生菌的定义作了补充: “益生菌是含生理活性物质,能通过胃肠或定植于结肠或在肠道增殖,调整肠道菌群,提高机体免疫力的活的微生物”。 后来发现，死菌体细胞成分或代谢产物也具有与活菌相同的生理功能； 1996年，对益生菌的定义不再强调活菌,他指出: “益生菌剂是含生理活性菌或死细胞(包含代谢产物与细胞组成),摄取后可改善粘膜表面菌群或酶的平衡,或刺激机体的特异性或非特异性免疫力的微生物制剂”。 因此,从广义上讲,益生菌可以是单一菌株,也可以是多种菌株甚至是它们的发酵产物。 即益生菌是一类对人体有益的微生态制剂,益生菌对健康的有益作用,它对健康的有益作用最早是由俄国科学家首先提出的。 经过研究发现：益生菌具有改善肠道菌群结构,抑制病原菌,消除致癌因子,提高机体免疫力,降低胆固醇等重要的生理功效；益生菌与人体健康的密切关系,使其作为一种生物添加剂在食品中广泛应用,发挥重要的生物学效应。,目前普遍认为,作为益生菌的细菌应该具备以下条件: 对宿主有益 无毒性作用 无致病作用 能在消化道存活 适应胃酸和胆汁 能在消化道表面定植 能产生有用的酶类和代谢物 在加工和贮存过程中能保持活性 具有良好的感官特性。,2 益生菌的种类,益生菌主要是人类和动物肠道内正常生理性菌和非肠道菌。 目前,常用的益生菌菌种有： 双歧杆菌 乳酸杆菌 某些链球菌,双歧杆菌,青春双歧杆菌 短双歧杆菌 两岐双岐杆菌 婴儿双岐杆菌 长双歧杆菌,乳酸杆菌,嗜酸乳杆菌 保加利亚乳杆菌 干酪乳杆菌 发酵乳杆菌,胚芽乳杆菌 短乳杆菌 纤维二糖乳杆菌 乳酸乳杆菌,链球菌,粪链球菌 乳链球菌 嗜热链球菌 乙酸乳酸双链球菌,粪链球菌是肠内繁殖最快的有益菌，能分解糖类物质，产生乳酸，以促进肠内乳酸杆菌、双岐杆菌繁殖，并抑制有害菌，调节肠内菌群。 但是，也有文章指出，粪肠球菌能产生有害化学物质，破坏DNA，进而引起促发直肠癌的基因活动。 International Probiotics Association 和世界卫生组织（WHO）均建议：益生菌中不宜使用肠球菌！,美国食品药物管理局认为安全的益生菌菌种,美国食品药物管理局认为安全的益生菌有40种，其中包括： 黑曲霉、米曲霉、凝固芽孢杆菌、粘连芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、厌氧性拟杆菌、发酵乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、弯曲乳杆菌、载耳布吕克氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚牙乳杆菌、罗特氏乳杆菌、肠系膜明串球菌、乳酸片球菌、毛状拟杆菌、瘤胃拟杆菌、猪拟杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、嗜热性双歧杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒片球菌、戊糖片球菌、费氏丙酸菌、谢曼氏丙酸杆菌、酿酒酵母、乳酸链球菌、二乙酰乳酸链球菌、粪链球菌、中(间)链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌。,3 益生菌的生理学功能及作用机理,（1）维持肠道菌群平衡，治疗肠道功能紊乱 益生菌可粘附于肠粘膜上皮细胞，通过自身及产生代谢物和抑制物排斥致病菌； 在微环境下保持优势，并与肠道中其他细菌相互作用，调整菌群间关系，以保证肠道菌群最佳优势组合，并维持肠道菌群平衡。,（2）抗癌、抗肿瘤作用 益生菌的抗肿瘤作用是由于益生菌的存在及其生成的代谢产物优化了肠道菌群的组合，增强了免疫功能，抑制了肿瘤细胞的增殖和致癌物质的产生。 Moore等人报导了对肠道菌群与癌症间的关系,他们对不同地区,不同饮食习惯，结肠息肉患者和肿瘤低发区,挑选出的87名对象进行研究,从这些人的粪便中分离出55-60个菌株作统计学处理。 结果显示, 癌症发病率的高低和膳食组分密切相关,而含益生菌的膳食己被证明具有明显降低癌症发病率的功效。,（3）增强免疫系统的功能 人体免疫功能会随着年龄的增长而降低,免疫系统的功能失调将带来健康问题,如过敏和炎症反应。 益生菌的活菌细胞、死细胞或是发酵产物都具有免疫调节功能。,（4）营养作用 益生菌代谢产生的酸可促进对维生素D、钙和铁离子的吸收。 研究表明益生菌可合成多种维生素，如硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、尼克酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸、叶酸和维生素B12。 当某些因素造成肠道菌群失调时，明显表现出维生素缺乏症。,（5）控制内毒素的产生 益生菌可抑制肠道中腐败细菌的繁殖，从而减少肠道中内毒素和尿素酶的含量，使血液中内毒素和氨含量下降。 让肝病患者食用益生菌，发现血氨、游离血清酚及游离的氨基氮明显减少。,（6）延缓机体衰老 益生菌能使机体中某些具有抗衰老作用的酶活性升高，使衰老的物质浓度降低。 研究表明：用婴儿双歧杆菌活菌液喂养老龄大白鼠，观察到试验组的大白鼠经喂养后，血中抗衰老生化指标(如超氧化物歧化酶SOD)比对照组显著升高，衰老生化指标(过氧化脂质LPO)显著降低。,（7）降胆固醇功能 许多研究证明益生菌可以降低胆固醇,每天吃酸奶可使血清胆固醇降低; 最近有人用老鼠作实验,先给试验鼠吃罗氏乳杆菌每天104个细胞,连续7天,再给予高胆固醇饲料,与对照组相比,其总胆固醇下降20%,三甘油脂下降33%。,（8）抗高血压功能 近来,膳食疗法来治疗高血压的研究很多,根据Tacano研究表明,益生菌食品能在一定程度上控制血压。 其抗高血压效果在先天性高血压老鼠实验中得到证实,从啤酒酵母和瑞士乳杆菌发酵乳中分离的三肽物质(Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro)具有抑制血管紧张素转移酶活性的作用。 （ACE）,（9）益生菌的其他功能 提高食物转化率,促进人及动物生长发育; 改善人体健康水平,有益菌大量增殖,产生竞争性排斥作用,控制消化道疾病; 消化分解抗营养因子,如植酸、胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和非淀粉多糖，促进营养物质的利用等。,二、肠道有益菌的产生和变化,（一）人类的肠道系统,为什么说肠道问题至关重要？,营养物质均通过肠道吸收，没有好肠道就没有营养吸收； 90%的毒素是从肠道进入人体； 84%的营养不良问题是由肠道造成； 许多人体必需的维生素，需要靠肠道内细菌合成； 0.1%的有害病菌、病毒漏网而进入人体，人体就将面临疾病困扰。,胎儿：结肠中无细菌 婴儿：结肠中有益菌占9099% 断奶后：以革兰氏阴性菌为主,（二）有益菌的产生,（三）有益菌的变化,双歧杆菌和乳杆菌在肠道内不能以形成菌落的形式定殖繁殖，必须通过外源性因素如直接补充有益菌或补充能使有益菌增殖的因子，才可获得期望的由有益菌占主导地位的肠道菌群组成。,三、有益乳酸菌的性质及安全性 （一）作为食品功能因子时应具备的性质 1、功能有效性 对人体有保健作用并保持其有效性； 对酸和胆汁稳定，能在肠道存活。 2、食用安全性 有精确的菌属、种、品系的鉴定方法，不同产品中应用的最小有效剂量有确切的数据积累； 具备食品安全性和临床安全性。 3、加工稳定性 在食品加工、贮存过程中保持稳定。,（二）乳酸菌的安全性,1、传统或新型食品中乳酸菌的安全性原则 （1）食品生产者有提供安全性食品的义务和责任，有益菌食品和其他食品同样应具有安全性； （2）有益菌食品是一种新食品，必须具备适当的法定许可； （3）当菌有长期的安全使用历史，作为发酵菌株也是安全，生产的食品不被视为新型食品； （4）该菌有长期的有据可查的消费历史，某一菌株属于无病原菌的种，有长期的安全食用历史，是安全的，不构成新食品。,（5）菌属是无病原性的种，无长的安全食用历史，应用不一定安全，生产的新型食品需安全性测试； （6）新菌株已知属于病原性的种，适当处理用作生产食品，其产品被认为是新型食品； （7）菌的分类学已经涵盖DNA-DNA杂交、rRNA序列测定等内容，这些内容常用于菌的诱变体测定。 （8）带有传递性抗菌素抗性基因的菌株，不能产生市场化的产品； （9）没有适当分类学描述的菌株不能市场化。,2、基因改性乳酸菌的安全性 基因改性微生物用于食品生产，产品被认为是新产品，应进行安全评估。 安全评估包括表现型（指生物的某一具体性状，如体内不能产生酪氨酸酶）和遗传型（基因型又称遗传型）特征，它们在食品的应用数据和以前的应用历史等。 表现型基因型环境影响,对于遗传改性微生物及其产品，需要测定： （1）遗传改性对寄生生物体性质的影响； （2）遗传改性微生物的遗传稳定性； （3）新遗传物质表达的专一性； （4）遗传改性微生物中遗传物质的传递和遗传改性微生物在肠道的生存和定殖能力。,四、益生菌在食品中的应用,目前,在食品中益生菌主要用于发酵乳制品的生产,但它也正逐步被用于开发各种功能食品,如果汁、糖果、冰棋淋、冷冻酸奶等。 在中国与亚太地区益生菌的最普及的应用仍是奶制品领域，如酸奶和乳酸菌饮品等。,应用于功能性食品的常见益生菌也主要指两大类乳酸菌群。 一类为双歧杆菌,该类乳酸菌为全球公认有益菌,尚未有不利于人体的报道出现；常见的有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等； 另一类为乳杆菌,如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、和罗伊氏乳杆菌（新型菌）等。,第二节 双歧杆菌,一、双歧杆菌的种类及特性 （一）双歧杆菌常见菌种 寄生于人体肠道有9种，主要为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌等。 婴儿期：婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌为主。 成年期和老年期：青春双歧杆菌、长双歧杆菌为主。,（二）双歧杆菌特性 1 、属 革兰氏阳性 专性厌氧菌 2、最适生长条件 最适培养温度3638；对热耐受性差。生长初期最适pH为6.57.0，但总体抗酸性弱。 3、能发酵葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖 低聚果糖是真正的双歧杆菌生长因子。,革兰氏染色法,通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。,4、分解葡萄糖时代谢产物为乙酸和乳酸 产品中存在双歧杆菌，乙酸、乳酸的比值大于1； 产品中不存在双歧杆菌，存在乳酸时，其比值小于1。 5、蛋白分解力微弱 双岐杆菌蛋白分解力微弱，对抗菌素敏感。,阳性紫色 阴性红色,6、细胞形状多样 不同菌种，不同培养条件，有棍棒状、勺状、V字形、弯曲状、球杆菌状和Y字形等。 7、对营养要求复杂 许多菌株用胺盐作氮源，其他菌株用有机氮作氮源。,二、双歧杆菌的生理功能 （一）对肠道菌群的调节作用 在代谢过程中具有防御外来病原菌在肠道内定殖生长； 通过与外来菌在肠道内竞争营养源（糖）以及产生短链脂肪酸，增加肠道酸度，使环境变成酸性，起到对抗病原菌的作用。,（二）免疫调节作用 双歧杆菌细胞中的成分含有免疫调节剂，可产生免疫物质； 抑制恶性肿瘤，能帮助人体抵抗病原菌的侵袭。,（三）降血脂作用 降低血中胆固醇的水平，清除体内过多的自由基，对机体抗氧化，延长寿命起一定作用。,（四）产生维生素等活性物质的作用 双歧杆菌能产生B族维生素如叶酸、尼克酸等； 能产生酪蛋白磷酸酶和溶菌酶等； 在食物消化、增强肠道抵抗力等方面起促进作用。,（一）培养基制备的原则 1、对营养和生长物质的要求 2、控制低氧化还原电位 在培养基中添加还原性物质以降低其氧化还原电位，有利双歧杆菌的厌氧培养。 3、在生长过程中的pH控制和缓冲容量 产酸微生物在生长过程中保持一定的pH非常重要。 4、控制培养基中最终pH 培养基灭菌前，培养基的pH调至6.67.2，在培养基灭菌后添加pH调整物质，要测定其最终的pH。,三、双歧杆菌的培养、分离与鉴定（P164）,氧化还原电位,氧化还原电位 : 不论反应形式如何，所谓氧化即失去电子，所谓还原即得到电子，一定伴有电子的授受过程。 在活细胞中，好氧性的细胞电位高，厌氧性的电位低，酶的活性和细胞同化能力以及微生物的生长发育等也有受氧化还原电位影响的情况。,（二）培养基的制备 1、非选择性培养基（表7-3） 非选择性培养基常用TPY培养基，用于从人类、牛胃和蜜蜂肠道等来源的双歧杆菌的最初穿刺培养。 2、双歧杆菌最适生长培养基（表7-4） 3、双歧杆菌选择性培养基（表7-5、7-6） 双歧杆菌为专性厌氧菌，在有氧下不能生长于平皿或试管斜面上。 要选择适宜的培养基，控制厌氧条件，以适合双歧杆菌生长发育。,穿刺培养,是将接种针深插固体培养基中进行接种以培养微生物的一种方法。用于厌氧性或兼性厌氧性细菌的培养。 在厚的软琼脂层中进行穿刺培养，可根据细菌自穿刺部位的扩散状况来了解细菌的运动性能。,4、糖分解试验用基础培养基（表7-7） 5、液体培养基（表7-8） 用于分离纯化后双歧杆菌的扩大培养。 6、样品计数稀释液（表7-9） 当进行样品或菌种稀释时，采用表7-9的缓冲溶液。,（三）双歧杆菌的培养、分离和鉴定 1、样品的收集 获取样品前，不能对样品源进行任何修饰。 2、样品的制备和稀释 一般选择具有还原性物质的溶液作为缓冲液，且在沸水浴中去氧。 3、接种培养 4、菌种鉴定（表7-10）,四、双歧杆菌的发酵工艺 （一）发酵菌种 为提高酸度和风味成分含量，用混合菌种（双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌，称为BAT）。 （二）菌种和母发酵剂的提供和保存 由高校和研究所提供，或从适合物质提取分离。 菌种的保存常用冷冻法。 液氮（-195.8）长期保存 -25-40短期保存,五、双歧杆菌在功能食品中的应用,添加益生菌的食品可以改善消化功能,促进胃肠蠕动；尤其对防止婴幼儿、老年人腹泻和消化不良、便秘等胃肠道疾病有重要作用。,双歧杆菌产品的两个发展方向。 直接利用双歧杆菌生产活性双歧杆菌制剂及健康食品； 生产双歧杆菌生长因子保健食品或经双歧杆菌发酵但不带活菌的功能食品。,（一）微生态制剂 1、微生态制剂的种类 微生态制剂，也称微生态调节剂，在微生态学原理指导下制得的含有大量有益菌的制剂。 有的微生态制剂还含有这些微生物的代谢产物、能促进有益菌生长的促进因子。 微生态制剂具有维持宿主的微生态平衡，调整其微生态失调，提高其健康水平的功能。,益生菌：一种或几种有益菌（从肠道相应部位分离出的正常菌群），将其培养增殖，浓缩干燥制成菌剂； 益生素：不被宿主消化吸收却又能有选择性地促进其体内有益菌的代谢和增殖。 如有益菌的生长因子。 合生剂：制剂中有益生菌和益生素二部分的制剂。,微生态制剂的种类,2、微生态制剂的质量及在问题 较好的微生态制剂的标准是： （1）含一至几种高质量的有效菌株（种）； （2）活菌含量高； （3）保质期长，不低于原始菌数的一半； （4）良好的微生态调节和其他保健作用； （5）较强的抗氧、抗胃酸和抗胆汁酸功能； （6）尽可能添加双歧因子类可促进外源性和内源性增殖的物质； （7）稳定、安全、可靠、质优价廉。,（二）双歧杆菌酸奶 双歧杆菌酸奶生产的技术难点是既要保证产品中含有一定数量的双歧杆菌，又要使产品的口感和风味被消费者接受。 常用的混合发酵剂有两歧双歧杆菌-嗜酸乳杆菌（AB发酵剂）、 两歧双歧杆菌-嗜酸乳杆菌-嗜热链球菌（ABT发酵剂）等。,（三）双歧杆菌果蔬汁发酵饮料 利用营养丰富的果蔬汁为主要发酵基质，以双歧杆菌进行发酵生产含活菌的营养保健饮料也是近年来的一个研究热点。,影响蔬菜汁双歧杆菌保健饮料活菌数量的因素 1、贮藏温度 乳酸乙酸 （总酸度为弱酸性对保存有利） 3、蔗糖、甜味剂 对活菌保存影响最小,（四）双歧杆菌酵母共生发酵乳 该种发酵乳生产的依据是用生物除氧以提供双歧杆菌良好的生长厌氧环境。 菌种为 两歧双歧杆菌+乳酸酵母,（五）AB-乳 AB-乳是以经均质、强力热处理和浓缩的全脂乳为原料，接种0.1%冷冻浓缩的AB发酵剂（嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌），在37发酵至要求的酸度，冷却至10下冷藏。,（六）高蛋白双歧杆菌酸奶 以灭菌脱脂乳为原料，接种3%的乳酪链球菌和丁二酮乳酸链球菌的混合发酵剂，发酵至酸度85OT左右后冷却。,酸度,滴定酸度（OT）定义：以酚酞为指示剂，中和100ml乳所消耗0.1MNaOH溶液的毫升数。 正常的新鲜牛乳的滴定酸度约为1420OT，一般为1618OT。,（七）双歧杆菌奶粉 奶粉是双歧杆菌活菌保护的一种主要基质，而且双歧杆菌冷冻干粉剂较液态下有更高的常温活菌保存率。,第三节 乳酸杆菌,一、乳酸杆菌的种类及特性 （一）乳酸杆菌的种类 保加利亚乳酸杆菌，常和嗜热链球菌利用共生作用而配合使用； 有利于生成酸、乙醛和双乙酰等风味成分，构成饮料的主要发酵风味。,（二）乳酸杆菌的特性 1、细胞形态多种多样 细胞形态多种多样；无芽孢，革兰氏染色呈阳性。 2、营养要求复杂 几乎每个种都有各自特殊的营养要求。 3、最佳生长条件 生长温度2553，最适温度3040。耐酸，最适pH为5.56.2，在pH5或更低情况下可生长，在中性或初始碱性条件下生长速度降低。 4、对糖进行发酵时存在不同的发酵类型 糖发酵时分为同型乳酸发酵和异型乳酸发酵。,乳酸发酵,指糖经无氧酵解而生成乳酸的发酵。 由于菌种不同，代谢途径不同，生成的产物有所不同，将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧杆菌发酵。 同型乳酸发酵：在微生物的同型乳酸发酵中，通过糖酵解途径由糖类生成丙酮酸，经乳酸脱氢酶作用形成乳酸。 异型乳酸发酵：除乳酸以外，还产生乙醇、乙酸和二氧化碳等副产品称为异质乳酸发酵。,二、乳酸杆菌的生理功能 1、调节肠道菌群平衡、纠正肠道功能紊乱 乳酸菌通过其自身代谢产物和与其他细菌间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合及稳定性。,2、抑制内毒素产生、免疫激活、抗衰老和抗肿瘤 乳酸菌产生的乳酸能抑制出肠腐败细菌的生长； 乳酸菌及其产物能诱导干扰素、促进细胞分裂而产生体液及细胞免疫； 乳酸菌的抗肿瘤作用是由于肠道菌群的改善结果，抑制了致癌物的产生。,3、降低血清胆固醇、生成营养物质 长期饮用发酵酸奶的人群能保持较低的血清胆固醇水平； 改善（克服）乳糖不耐症； 明显提高蛋白质、钙、磷、铁和维生素D的吸收与利用率,乳糖不耐症,乳糖不耐症是指人体不能分解并代谢乳糖，这是由于肠道内缺乏所需的乳糖酶，或者是由于乳糖酶的活性已减弱而造成的。 据估计，全球约75%的成年人体内乳糖酶的活性有减弱的迹象。该症状发生的概率在北欧约5%，而在一些亚洲及非洲国家则超过90%。简单的说，乳糖不耐症就是缺乏乳糖酶或其活性不足所造成的状况，这种酶是用来消化乳糖的。此类病症在亚洲及非洲很常见。,乳糖不耐症主要有三种类型： 1原发性乳糖不耐症：可由环境因素所致，例如在一个没有奶制品的环境下给小孩断奶。这种情况经常发生在亚洲与非洲国家。 2继发性乳糖不耐症：可由环境因素所致；或由特定肠胃疾病所致，包括罹患肠道寄生虫，在上述情况下，制造乳糖酶的官能将被永久性的破坏。若婴儿乳糖摄入过多也会导致暂时性的乳糖不耐。 3先天性乳糖酶不足：这是由于遗传功能紊乱造成的生产乳糖酶的官能失灵。这种与生俱来的病症可以在出生后不久确诊。,乳糖不耐患者的数量也随着年龄而增长。在23岁，6岁及910岁的孩子中，患有乳糖不耐的人数分别为： * 6%15%，美国白人以及北欧地区 * 18%，30%，47%，墨西哥裔美国人 * 25%，45%，60%，南非黑人 * 约30%，80%，85%，中国及日本 * 3055%，90%，90%，秘鲁混血儿,三、乳酸杆菌的培养、分离与鉴定,（一）分离培养 乳杆菌属是专性或严格的发酵菌，有复杂的营养要求，需要选择合适的培养基进行分离。 1、半选择性与选择性培养基 乳杆菌是区系中的主要菌类时，要求使用半选择性培养基。 乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，使用选择性培养基。,选择性培养基,一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。,2、分离培养条件的控制 大多数乳杆菌在厌氧或增加CO2压力条件下生长较好，特别是在初始分离时。,厌氧箱,（二）菌种鉴定（P190） 1、取样及制备试样 2、乳酸菌培养与菌落判定 3、乳酸菌菌种鉴定（P194,表7-19） 分离的乳酸菌中，鉴定乳杆菌与双岐杆菌菌种，必须分析其糖分解的形状、产生与生长温度等才能确定。,四、乳酸菌的发酵工艺,（一）菌种纯培养物的活化及保存 分离培养或市售的商品乳酸菌菌种由于保存、运输等影响，活力会减弱，需进行多次接种活化，以恢复其活力。 纯培养物作维持活力保存时，需保存在05冰箱中，每隔12周移植一次。为了避免菌种退化，应该进行不定期的纯化处理。 （二）母发酵剂的制备 （三）生产发酵剂的制备,五、乳酸杆菌在功能食品中的应用 乳酸杆菌功能食品包括活性菌微生态制剂和发酵食品。 乳酸杆菌经扩大培养后浓缩分离得菌体，添加保护剂，干燥成粉剂，制成胶囊或片剂。,（一）凝固型活菌酸乳 蔗糖+稳定剂 原料乳标准化调配均质杀菌冷却（4045） 种子发酵剂母发酵剂生产发酵剂接种 成品冷藏15冷却10发酵罐装消毒瓶,1、凝固型酸乳生产中常用的混合发酵剂是？ 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1：1）。 2、生产发酵剂的制