高效液相色谱仪的使用.ppt

高效液相色谱仪的使用,仪器的组成,1 泵 2 进样器 3 柱温箱 4 检测器 5 数据输出设备,分离原理,溶液流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发上作用（吸附、分配、离子吸附、排阻、亲和）的大小强弱不同，在固定相中的停留时间就不同，从而先后从固定相中流出。,常见的检测器还有差示折光检测器（通过连续测定流通池中溶液折射率来检测试样浓度）、电导检测器（根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质浓度）。 光电二极管阵列检测器：紫外检测器的重要进展，全波长扫描、准确定性。,仪器的使用,流动相的选择,对样品有适宜溶解性（试溶解样品） 不能用纯乙腈（粘度大，容易在单向阀上形成液膜） 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 所有流动相都应该用色谱纯级，水为超纯水，并且使用前应过滤、超声脱气 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中,峰拖尾的处理,添加10-30 mMol 三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾 添加1% 醋酸或10-30 mMol磷酸盐可以抑制酸性化合物拖尾,色谱柱的保护,一般情况下，使用前用甲醇冲柱30min，再换流动相。使用完毕后用50%甲醇冲柱30min，再用纯甲醇冲柱至柱压稳定。若流动相中有缓冲盐（乙酸、磷酸盐等）应先用纯水冲柱30-60min，然后同上。,注意事项,1 清洗进样针的液体应该是溶解样品的溶剂 2 样品在进样前，必须经微孔滤膜过滤 3 由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈 4溶解样品和标准品的溶液应相同,常见问题,1 柱压不稳 2 保留时间不稳定 3 峰型不好 4 不出峰（检查流动相配比是否无误、清洗进样针） 5 基线不稳,解决方法,1 检查是否漏液 2 检查管路中是否有明显的气泡 3 观察柱温是否稳定 4 若无上述情况，可用水、异丙醇、甲醇、0.1mol/L的盐酸溶液高流速（5-8ml/min）冲洗管路 5 经4处理后，若还不正常，可拆下单向阀依次用水、甲醇、异丙醇超声清洗,准备工作,1 、准备所需的流动相，用合适的0.45m滤膜过滤，超声脱气20min。 2 、根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）和定量环。 3、 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的0.45m滤膜过滤。（注意腐蚀性与有机系的的溶剂） 4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；,样品,数据分析,物质的定性,淫羊藿苷标准品,淫羊藿提取液,定量计算,公式中：A为峰面积、C为浓度,常用的计算方法还有归一化法、内标法。,色谱条件： 流动相：甲醇-水（50：50）， 色谱柱：C18色谱柱， 检测波长：270nm， 柱温：30， 流速：1.0mL/min。 样品前处理：取药材细粉0.3g，精密加入甲醇50ml定重，加热回流1h，放冷再定重，补充损失甲醇，摇匀，经 0.45m过滤即可上机检测。 标准品浓度：0.6mg/ul，供试品浓度6mg药材/ml。,HPLC检测实例：丹参酮IIA含量的HPLC测定,实验数据及处理 （1）、以色谱峰面积为纵