课件：真菌胡志东.ppt

真菌特异性抗原检测的临床意义,天津医科大学总医院检验科 胡志东,1,2019,-,一、真菌感染的现状,2,2019,-,二、深部真菌感染的真菌种类 与类型,3,2019,-,三、真菌感染实验诊断的方法学,4,2019,-,诊断-准确、快速检出 真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学,治疗-高效.低毒 病原体的确定 敏感药物的选择 药物有效浓度的确定 发现抗真菌新药,5,2019,-,四、真菌特异性抗原的检测,1 (1-3)-D-葡聚糖 2 半乳甘露聚糖 3 甘露聚糖 4 D- 阿拉伯糖醇 5 烯醇化酶 6 新生隐球菌荚膜抗原,6,2019,-,(1-3)-D-Glucan(葡聚糖) “G”试验,7,2019,-,1,3,真菌细胞膜、壁结构,羊毛固醇C14去甲基化酶 14位还原和78位异构酶 角鲨烯环氧化酶,8,2019,-,(1-3)-D-Glucan生物活性,(1-3)-D-Glucan作为真菌细胞壁成分之一，一旦进入机体后，将引起真菌病，严重时将会引起严重的深部真菌感染疾病，因此,深部真菌感染对患者的健康与生命构成严重威胁.,传统检测方法为真菌培养，一是周期长，二是阳性率特别低 主要是抗生素类药物的滥用所引起 真菌感染出现逐渐上升趋势,9,2019,-,“G”试验缘何而来？,10,2019,-,比浊法反应机理,细菌内毒素 （1-3）-D-Glucan LAL-RM(反应物) 因子C 活化因子C 因子B 活化因子B 活化因子G 因子G 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 定量浊度仪 Turbidimetric technique GEL,11,2019,-,鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法。,12,2019,-,图2 鲎的外形,13,2019,-,已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和-葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。,14,2019,-,内毒素和-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线,15,2019,-,酵母菌、丝状真菌细胞壁成分 不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属 不能检测：隐球菌和接合菌 美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册 中国SFDA已获批准进入 临床应用 敏感性、特异性：90左右,D葡聚糖的价值,16,2019,-,美国大多数研究限于念珠菌菌血症 其他真菌感染（侵袭性曲霉菌病）的研究资料少 假阳性：血液透析(纤维素滤膜）；接受血制 品治疗（免疫球蛋白） 抗生素对结果的影响？,D葡聚糖的价值,17,2019,-,D葡聚糖（G试验）的缺陷 标本采集 不能鉴定何种真菌感染,18,2019,-,D葡聚糖参考值,健康人： 20 pg/ml,19,2019,-,关于G试验建议,G试验临床应用 1 明确诊断 （抗真菌药物治疗前） 2 治疗效果监测 （抗真菌药物治疗后） 3 连续2次采血进行G试验,20,2019,-,半乳甘露聚糖 （GM)（Galactomannan）,21,2019,-,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原 可以从血清、脑脊、胸水、BALF检测到 方法： ELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/ml Latex agglutination： 15ng/ml,22,2019,-,合适的判定折点：1.0, 0.7,0.5? 在儿童的应用价值？ 食物中的GM可以被吸收，假阳性？ 哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？ 非血液病患者应用不多 抗真菌治疗对结果的影响？,半乳甘露聚糖(GM)检测存在的问题,23,2019,-,两种试验敏感性、特异性相当 都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是D葡聚糖可能出现更早 两者结合，可以互补 弥补GM假阴性可能 同样在粒细胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究,半乳甘露聚糖(GM)与D葡聚糖的比较,24,2019,-,系统性真菌感染诊断的进展,25,2019,-,检测真菌的特异性酶,白念N-乙酰-D半乳糖苷酶 白念脯氨酸按肽酶 都柏林念珠菌 N-乙酰-D半乳糖苷酶 克柔 酸性磷酸酶 热带 吡烙磷酸酶 平滑 -D半乳糖苷酶 新生隐球菌 酚氧酶,26,2019,-,分子生物学技术,1 PCR 技术自标本中扩增真菌DNA 2 分子生物学技术用于真菌型别分析,27,2019,-,谢谢,28,2019,-,真菌细胞壁结构示意图,29,2019,-,比浊法反应机理图表,Endotoxin (1-3)-D-Glucan Activated Activated Factor C Factor C G Factor G Factor FactorB Activated Factor B Proclotting Enzyme Clotting Enzyme Coagulogen Coagulin 定量浊度仪 Turbidimetric technique GEL,30,2019,-,内毒素及(1-3)-D-Glucan 定量检测仪器及试剂盒,国外：美国 LAL-5000 日本 Toxinometer ET-201 及Wellreader sk 603等检测系统及Endospec and Endotoxin Single Test (厚生省) FUNGITELL(American FDA认可)FUNGITEC G TEST MK/ -Glucan test (Japan 厚生省) 国内：MB-80系列检测仪器及试剂盒EKT-5M set and GKT-5M set 国内独家研制生产，唯一荣获国家批准文号系列产品,31,2019,-,人体血液中细菌内毒素及 (1-3)-D-Glucan与临床之间的关系,通过对机体血液中的细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan含量测定，可以对革兰氏阴性菌及真菌（深部真菌）所引起的内毒素（真菌）败血症、菌血症、术前术后感染以及深部真菌感染症状进行诊断：主要表现为 A.某些感染症状的鉴别诊断（G+ 菌G-菌真菌病毒等） B.大多数免疫功能低下患者及不名疾病的早期诊断 C.对给药方案提供实验理论数据 D.对给药后的治疗效果以及预后判断具有很大意义。,32,2019,-,临床细菌内毒素及 (1-3)-D-Glucan检测的国内外发展,国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)-D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)-D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。 国内：MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)-D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set 获得SDA批准文号,33,2019,-,内毒素+ Ca2+、 Mg2+ C因子活化C因子 B因子活化B因子 凝固酶原凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白 凝胶 图3 鲎试剂与内毒素的反应机理（凝胶法）,34,2019,-,Endotoxin (1-3)-D-Glucan Activated Activated Factor C Factor C G Factor G Factor FactorB Activated Factor B Proclotting Enzyme Clotting Enzyme Coagulogen Coagulin 定量浊度仪 Turbidimetric technique GEL,图6 比浊法反应机理图表,35,2019,-,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector