海洋制药实验报告.doc

试验中需要查阅的问题以及答案试验中需要查阅的问题以及答案 1 脱钙：脱钙：（1）盐酸的理论用量（2）所用盐酸的浓度，及反应时间， 并说明其对最终质量有什么影响？ 2 脱乙酰脱乙酰：（1）甲壳质 （2）壳聚糖是甲壳质的一种衍生物，它 具有什么特点或特征。 易溶于酸的溶解性，抗菌性， 成膜性，成纤性，吸附剂等等 （3） 用途（4） 衍生物？ 糖性质 （5） 工艺参数：氢氧化钠的浓度，时间，浓度，产品 质量。 （6） 质量指标：分子量,脱乙酰度 （7）如何制取高脱乙酰度的壳聚糖？ （8）如何获得低分子量的，如壳寡糖？ 3 脱蛋白脱蛋白：（1）如何检验脱蛋白是否完全？ （2）蛋白质如何回收？ 4 脱色：脱色：（1）氧化脱色高锰酸钾，过氧化氢 (2)如何除掉过量的氧化剂？ 5 废水的处理问题？废水的处理问题？ 6 （1）在脱乙酰度中）在脱乙酰度中，除了用盐酸和氢氧化钠酸碱滴定的方法，还 有没有其他方法？ (2) 分子量的测试方法 1%的溶液（1%的乙酸） ，测旋转粘度。 在其过程中不能加热，为什么？ 7 脱钙脱钙：怎么检测脱钙完全，如何回收钙？ .脱蛋白是否完全的检验的检验脱蛋白是否完全的检验的检验 双缩脲试剂是由双缩脲试剂 A 和双缩脲试剂 B 两种试剂组成. 双缩脲试剂 A 的成分是氢氧化钠的质量分数为 0.1 g/mL 的水溶液； 双缩脲试剂 B 的成分是硫酸铜的质量分数为 0.01 g/mL 的水溶液。 双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。 具体方法是： 先将双缩脲试剂 A 加入组织样液，摇荡均匀（必须营造碱性 环境），在加入双缩脲试剂 B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看 到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫 色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与 Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色 深浅与蛋白质浓度成正比。 双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经 180左右加热，放出一个分子 氨后得到的产物。 双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验 蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。 取产品 10g，加 1mol/L 氢氧化钠溶液回流煮沸 2 小时，离心。取上层清液 加双缩脲试剂，若不显紫红色，可证明本工艺条件脱蛋白符合要求。 蛋白质的回收蛋白质的回收 采用 100 硫酸铝和 100 硫酸铁还 40 壳聚糖符合絮凝剂，在烧杯中加入蛋 白废水，迅速加入絮凝剂，以 300 快速搅拌一分钟，再以 80 中速搅拌五分钟， 静置，沉淀。 如何出掉过量的过氧化氢？如何出掉过量的过氧化氢？ 不能加热，可以用亚硫酸钠或者草酸出去过量的过氧化氢。 分子量的测试方法分子量的测试方法 1%的溶液（的溶液（1%的乙酸）的乙酸） ，测旋转粘度。，测旋转粘度。 在其过程中不能加热，在其过程中不能加热，为什么为什么？ 加热对粘度有影响，如果加热糖苷键也容易断裂 脱钙：怎么检测脱钙完全，如何回收钙？脱钙：怎么检测脱钙完全，如何回收钙？ 向蟹壳上滴适量盐酸是否有气泡冒出，如有则没处理完全。 向含有氯化钙的废液中加入碳酸钠，沉淀得生物钙 HClHCl 的浓度的浓度、反应时间及温度对除无机盐的影响反应时间及温度对除无机盐的影响 从理论上说HCl 的浓度越高, 反应时间越长, 无机盐脱除得越彻底, 但HCl 浓 度超过一定值后, 可能对甲壳素造成降解, 并且酸处理超过必要时间后, 对脱无机盐 效果并没有明显增强。 2 mol/ L HCl 比1 mol/ LHCl 去除无机盐的效果要好得多。 并且当卤蝇蛆壳浸酸时间由2 h 增加到6 h 后, 无机盐含量已无大变化。比较结果可 以得出, 采用2mol/ L HCl 来脱盐, 室温下一次性酸处理1h 就可除去大部分无机盐。 另外, 为了避免甲壳素遭到破坏, 反应温度要温和, 一般在室温下进行。 不同反应条件对去除蛋白的影响不同反应条件对去除蛋白的影响 碱质量分数对去除蛋白结果的影响碱质量分数越高, 蛋白除得越干净。但 碱质量分数过高无助于降低成本和环境保护。 (1)(1)反应温度对除蛋白结果的影响反应温度对除蛋白结果的影响 反应温度越高, 蛋白质除得越干净。但为了后期提取的甲壳素不受到破坏, 温度应 在比较温和的条件下进行, 一般不采取直接加热的方法。 (2)(2)反应时间对去除蛋白结果的影响反应时间对去除蛋白结果的影响 随着反应时间的延长, 产物的含氮量降低, 但当含氮量达一定值时不再下降, 这是由 于甲壳素本身每一个结构单元都含有1 个 NH2。纯甲壳素的含氮量为7%, 但由于本实 验原料有色素、泥沙等杂质, 而且原料卤蝇蛆壳中还包含有部分尚未孵化的蝇蛆, 这 些蝇蛆在碱液中不会除去, 故其产物甲壳素不纯, 因此其含氮量低 8.1 壳聚糖定义以及结构特征壳聚糖定义以及结构特征 壳聚糖是甲壳素的 N-脱乙酰基的产物，一般而言， N-乙酰基脱去 55 以上的就 可称之为壳聚糖，这种脱乙酰度的壳聚糖能溶于 1%乙酸或盐酸 ，因此，凡是能溶于 1%乙酸或盐酸的甲壳素都可称之为壳聚糖。 作为有使用价值的工业产品壳聚糖，脱乙酰度必须在 70 以上 来源 甲壳素使地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物，广泛存在于甲壳纲 动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌的细胞壁和植物的细胞壁中。 结构特征结构特征 研究证实，甲壳素与其他多糖一样，其分子链也是螺旋形，X 射线衍射照片给出 的螺距为 0.515nm,一个螺旋平面由 6 个糖残基组成 3.壳聚糖理化特性 8.2 主要物理性质以及主要特性以及主要化学性质主要物理性质以及主要特性以及主要化学性质 壳聚糖是甲壳质最主要的衍生物，不同程度的脱乙酰作用可以获得不同脱乙酰 度的壳聚糖。粗壳聚糖相对分子质量为 1010 1010。 ，通常其脱乙酰度为 80 一 95。纯净壳聚糖为白色或灰白色、半透明的片状固体。 主要特性主要特性有: （1） 不能完全溶解于水和碱溶液中，但可溶于稀酸(pH6)，游离氨基质子化 促进溶解。溶于稀酸呈黏稠状，在稀酸中壳聚糖的 B 一 1，4 糖苷键会慢慢水解，生成 低相对分子质量的壳聚糖。 （2） 壳聚糖在溶液中是带正电荷多聚电解质，具有很强的吸附性。 （3） 壳聚糖的溶解性与脱乙酰度、相对分子质量、黏度有关，脱乙酰度越高， 相对分子质量越小，越易溶于水. （4） 壳聚糖具有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性和保湿性 N-脱乙酰度和黏度（平均分子量）是壳聚糖的两项主要性能指标 主要化学性质有：主要化学性质有： （1）甲壳素和壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤（主要是酰氯）反 应，导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基。这是壳聚糖化学反应中研究得最多的一 种。 （2）甲壳素和壳聚糖的羟基，尤其是 C6-OH，可与一些含氧无机酸（或其酸酐） 发生酯化反应，这类反应类似于纤维素的反应，在壳聚糖的氨基上也可能发生反应。 如甲壳素的硫酸酯与肝素结构类似，并具有抗凝血功能。 （3） 甲壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基醚， 苄基醚、羧甲基醚等。 （4） 壳聚糖的氨基是一级氨基，有一孤对电子，具有很强的亲核性， 能发生许多反应，N-烷基化是除 N-酰化以外的另一类重要的反应。 （5） 甲壳素和壳聚糖可以被氧化剂氧化，氧化反应的机理很复杂，可 使 C6-OH 氧化成醛或羧基，也可使 C3-OH 氧化成羰基(成酮反应)等 （6） 甲壳素和壳聚糖的特殊结构使得它们对具有一定离子半径的一些 金属离子在一定的 PH 条件下具有螯合作用。 （7）甲壳素和壳聚糖可通过双官能团的醛或酸酐等进行交联，这样其可 被用作色谱分离的载体或用作固定化酶载体 壳聚糖的主要性能及测定壳聚糖的主要性能及测定(性能指标性能指标) N-脱乙酰度和黏度（平均分子量）是壳聚糖的两项主要性能指标 9.1 脱乙酰度脱乙酰度 脱乙酰度（D.D.）的高低，直接关系到它在稀酸中的溶解能力、黏度、 离子交换能力、絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力。测定的方法有酸碱滴 定法、电位滴定法、氢溴酸盐法、胶体滴定法、苦味酸分光光度法、UV、IR 法等 9.2 黏度黏度 黏度反应了高分子物质的分子量大小，在壳聚糖的生产上，常用旋转 黏度计来测定其黏度，这是表观黏度，其数值可大体反映出壳聚糖分子量的大 小。常由此说高黏度壳聚糖、中黏度壳聚糖、低黏度壳聚糖。 壳聚糖及其衍生物的应用进展 壳聚糖的应用领域壳聚糖的应用领域 壳聚糖及其衍生物具有优良的生物特性，近年来国际上十分重视对它的开发 和应用。综述了壳聚糖在生物医药学领域的应用。 壳聚糖 (chitosan, CS)是由甲壳素 (chitin) 脱乙酰化制得的一种高分子氨基多糖， 又名甲壳胺、几丁聚糖，无毒无味，分子链上丰富的羟基和氨基使其易发生化学 反应而具备多种功能。壳聚糖具有良好的生物相容性和可生物降解等特点，降解产 物一般对人体无毒副作用，在体内不蓄积，无免疫原性，还具有降血压、降血 脂、降血糖、抗肿瘤、抗酸、抗溃疡等作用，因而在生物医学领域和药学领域有着 极广泛的应用前景。笔者就壳聚糖及其衍生物在医药领域的应用作一简要介绍。 10.1 医学方面医学方面 （1） 治疗高血压 医学研究已经证明，高血压和血中 Cl-含量密切相关。在胃的酸性条件下壳聚糖以聚 阳离子的形式存在，入血后能与 Cl-螯合，降低血中 Cl-浓度，降低血管紧张素转化酶 活性，减慢缓激肽分解，减少血管紧张素的生成，并减少醛固酮的分泌，扩张血管， 降低血容量，从而起到降压的作用。 （2） 治疗高血脂 血脂升高是导致心脑血管疾病的主要因素之一。壳聚糖可以阻碍胆固醇在肠道 的吸收，具有降血脂作用。它是自然界唯一带正电荷碱性基团的聚合物，易与带负 电荷的胆汁酸结合并促进其排出体外，而无胆汁酸的存在则胆固醇无法转化为胆 固醇酯，从而减少了胆固醇的体内吸收；胆汁酸的减少还促使肝脏将胆固醇转化为 胆汁酸，降低了血液中胆固醇的含量。壳聚糖也是一种非离子吸附剂，通过其氨 基和羟基等基团来吸附胆固醇和甘油三酯，可促进这些物质排出体外，吸附量与其 脱乙酰度、形态有关。用戊二醛为交联剂制备壳聚糖微球，采用血液灌流方式清除血 液中高含量的胆固醇和甘油三酯，有望成为治疗高脂血症的新方法 .。壳聚糖还能降低 低密度脂白 (LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)，具有双向调节作用，作用机制尚待研 究，降低 LDL 的程度和脱乙酰度、相对分子量有关。 例高脂血症患者，口服壳聚糖(2gd)1 个月后总胆固醇、 LDL 均显著下降，胆固 醇有极显著下降，对肝功能无明显影响。口服壳聚糖片剂可以降低脂类的吸收，目前 临床用 于防治动脉粥样硬化及脂肪肝。 （3） 降低血糖 糖尿病患者体液常呈酸性，对胰岛素的敏感性下降：壳聚糖具有调节体液 pH 值作用，可使胃肠 pH 值稍向碱性侧移动 0.5 个单位，有利于增强胰岛素的敏感性 和 利用率，从而改善糖代谢、降低血糖。壳聚糖还具有调节内分泌系统的作用，能够促 进胰岛 B 细胞恢复功能，使胰岛素分泌量趋向正常，维持血糖正常代谢。壳聚糖对糖尿病并 发症也有一定的治疗和预防作用。 （4）抗肿瘤作用 壳聚糖及其某些改性的衍生物具有很好的抗肿瘤作用，机理是活化巨噬细胞、自 然杀伤细胞 (NK 细胞)、攻击肿瘤细胞(LAK 细胞)、T 和 B 淋巴细胞，诱导体内产生 干扰素。试验证明，壳聚糖在浓度为 64mgL 时可增强 NK 细胞的杀伤作用， 96mgL 时强 LAK 细胞杀伤作用。国外报道，脱乙酰化度为 70的甲壳素 DAC-70 对 BALB-C 雄性鼠 的肉瘤有较强抑制活性。壳聚糖及其衍生物可以附着在血管内皮黏附分子上，能抑制 肿瘤血管内皮细胞的生成，封锁肿瘤细胞对血管的黏附和移动，使癌组织不能向周围 组织浸润、散和转移，从而达到治疗和预防癌症的目的，因此能够作为早期癌肿的治 疗药物。壳聚糖还被用于接受放射治疗的患者。壳聚糖能保护正常细胞，减轻患者放 射反应，提高其对放射反应的耐受能力，与抗癌药并用，可提高疗效、减少化疗的不 良反应。 （5） 促进免疫功能 壳聚糖在体内对直接活化巨噬细胞、NK 细胞、 LAK 细胞、B 和 T 淋巴细胞，介导 机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，增强机体免疫监视功能。壳聚糖与胆汁酸结合 使人体内 pH 值偏于碱性，为淋巴细胞攻击癌细胞创造了环境，增强了人体免疫功能。壳聚糖既 能活低下的免疫功能，又能有效效抑制免疫功能亢进。黄俊明等研究了壳聚糖对小鼠 的免疫调节作用，结果表明壳聚糖可提高绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应能力， 增强受试动物的血清溶血素抗体反应和巨噬细胞的吞噬反应，能促进小鼠的免疫作用。 壳聚糖微球具有免疫调节活性，因此可作为免疫促进剂直接静脉注射于患者体内。 （6）增强肝功能 壳聚糖可促进脂质代谢，降低胆固醇和脂肪，能修复肝细胞，增强肝功能，从而 保护肝脏。4g(kgd)以上的壳聚糖可明显减轻脂肪肝大鼠肝脂变程度，促进线粒 体功能的恢复。壳聚糖与干扰素并用，可促进肝炎病毒抗体的产生，有利于防治肝 炎。 （7） 保护胃肠道 壳聚糖分子中的氨基可与酸性物质结合，中和过多的胃酸；可在胃酸中形成胶 状物质，附在胃壁上形成保护膜，可减轻胃损伤面受到的刺激、腐蚀，促进损伤面 的修复，有利于胃溃疡愈合，是一种理想的抗酸剂。壳聚糖还能轻度抑制胃蛋白 酶分泌，增加胃黏膜血流量，保护胃黏膜细胞。 （8） 其他 壳聚糖可与摄人体内的毒素、化学色素、重金属及放射性物质鳌合，促进其排出 体外；它还能促进沉积在骨骼内的重金属和放射性物质排出体外，同时达到解毒和 护肝的目的。 壳聚糖还有止血、抑菌、消炎和促进伤口愈合作用。磺化壳聚糖与肝素的结构 相似，具有良好的抗凝血活性，是抗凝血剂中最有吸引力的改性物。其凝血机制为 带正电荷的壳聚糖与细胞表面含负电荷的神经氨酸残基的受体间发生相互作用， 促进血小板聚集和凝血系统激活。壳聚糖具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌、阴 性菌及白色念珠菌均有明显抑制效果，抗菌活性与其分子结构中游离的氨基含量 及分子量有关。将改性壳聚糖制备成的人工泪液用于临床无泪液、干燥性角膜炎、 结膜炎疗效良好，优于以甲基纤维素为原料的原人工泪液。壳聚糖与人体的亲合 力强，能抑制伤口愈合过程中的纤维增生，促进组织生长，有良好的保护和促进创 面愈合作用，且有抗感染作用，因此对烧伤、烫伤等有很好的效果。目前国内已 经制备出的壳聚糖无纺布，用于创、烧伤包扎时不会产生排斥反应，也不会粘连伤 口，并且有止血作用。 壳聚糖可选择性抑制纤维细胞生长，促进表皮细胞生长，在临床上可预防组织粘 连、减少瘢痕形成，因此可直接涂布于关节腔内以防止关节粘连。陈百成等在兔 膝关节滑膜切除术中置人壳聚糖膜，发现壳聚糖膜组关节粘连的程度明显低于未放 膜组。徐瑞生等对 24 例髌骨骨折患者，于术中关节腔内涂布 2几丁糖 4mL，术 后 1 个月和 1 年时的伸屈度均比常规手术 (未做任何处理)患者的大，表明几丁糖能 有效预防髌骨骨折手术后膝关节粘连的发生。关节腔内注射壳聚糖凝胶可防止关 节软骨的退化，对各种创伤性关节炎及骨性关节病均有疗效。目前已开发和潜在的应 用实例还包括人造皮肤、可吸收手术缝合线、骨修复材料、人工透析膜、伤 I=I 敷料、 抗凝血材料等“ 。 10.2 药物制剂方面药物制剂方面 壳聚糖及其衍生物是新型的药物制剂辅料，具有多种功能，可作为助溶剂、助悬 剂、粘合剂、中药澄清剂、缓控释制剂载体、靶向制剂载体、药用膜、滴眼剂增稠 剂、吸附剂、吸收促进剂等。近年来，壳聚糖还被广泛用于生物大分子药物给药体 系中。 甲壳质(CHITIN)又名甲壳素，壳多糖，几丁质；是一种天然氨基多糖高分子物 质，广泛存在于节肢动物的壳和真菌的胞壁中，其性质稳定，具有良好的生物相容性 和可降解性，毒性极小且来源广泛。在自然界中的生成量仅次于纤维素，估计海洋生 物的年合成量在 10 亿吨以上。 ( () ) 甲壳质及其衍生物的应用：甲壳质及其衍生物的应用： 1)化学工业：絮凝剂，重金属离子的分离及回收，涂料，染料，分离膜，粘接剂， 酶的制造，酶固定化载体，吸附剂，液晶，生物降解性塑料，纤维。 2)医疗：人工渗析膜，人工皮肤，手术缝合线，创伤包覆材料，抗菌剂，药品包覆 膜。 3)农业：农药(土壤杀菌剂)土壤改良剂，肥料等 4)食品工业：制造小麦胚芽，低热值食品添加剂，保健食品添加剂，水处理剂等等。 5)日用品：香烟过滤嘴，隐形眼镜片，化妆品添加剂，保水剂等。 甲壳质及甲壳胺的药用价值及研究：甲壳质及甲壳胺的药用价值及研究： 1、抗肿瘤作用:甲壳胺通过增强机体非特异性免疫对肿瘤有抑制作用，其作用机制 是促进巨噬细胞活性；为了更深刻了解其作用途径，又进一步研究了甲壳胺对小鼠脾 脏 NK 细胞活性 IL-2 分泌的影响。IL-2 是活化的辅助性淋巴细胞分泌的一种调节免疫 应答的重要介质。IL-2 对 NK 细胞，T 细胞，B 细胞等活性均有增强作用。甲壳胺能促 进 IL-2 的生成，因此提高了机体的非特异性免疫功能，这是其抗肿瘤作用的主要机理 之一。 2、对实验性胃溃疡的治疗作用：甲壳质在胃中可形成粘稠的