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中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 畜禽养殖废水处理工艺 1 引言 畜禽养殖业是我国农业的支柱产业,在维持畜产品稳定供给、提高人民生活水平方面发挥着 重要作用.随着畜禽养殖业的集约化、规模化发展,为提高动物生产性能、防治疾病,养殖过程 添加了一定量的重金属与抗生素.据统计 2006 年我国兽用抗生素消耗 9.7 万吨,占全国抗生素总 用量的 54%.而不被机体吸收、降解的抗生素排放到环境中,据 Zhou 等估算我国每年生猪和奶牛 养殖场抗生素排放量分别为 3080 和 164 t.而养殖业每年重金属排放铜、锌分别为 2397.23 t、 4756.94 t.畜禽养殖粪污表现出重金属与抗生素复合污染特征和研究发现畜禽养殖过程抗生素和 重金属使用与养殖场及其周边环境抗性基因丰度的提高呈正相关关系.畜禽养殖粪便、污水成为 抗性基因的重要蓄积库.抗性基因作为一种新型污染物,可能对公共健康、食品和饮用水安全构 成威胁.胡永飞等对 162 个健康人肠道微生物宏基因组(Metagenome)中的耐药基因进行了深入分 析,发现四环素抗性基因的丰度最高,而人类肠道四环素抗性基因极有可能来自于兽用抗生素的 使用以及抗性基因沿食物链的传播. 2014 年世界卫生组织发布的全球抗生素耐药报告明确指出抗生素抗性是 21 世纪公共卫 生的严峻挑战,针对动物生产应监督和促进畜禽业的合理用药,并强调了食用动物携带的抗生素 抗性及其在食物链上的传播方面数据的缺乏,应加强此方面的研究.我国和主要发达国家推行畜 禽养殖废水的生物处理、农田利用等工艺模式,然而畜禽养殖废水携带的抗性基因在此过程的转 归,以及抗性基因是否存在沿食物链的传播风险,亟需开展相关研究. 因此,本研究通过查阅国内外文献,总结归纳了畜禽养殖废水含有的抗生素抗性基因在生物 处理、农田利用过程的变化规律,并对今后的研究重点和方向提出建议和展望,以期为揭示抗性 基因消减规律,降低畜禽养殖废水抗性基因传播风险提供借鉴. 2 畜禽养殖废水中抗生素抗性基因分布 抗性基因根据其抗性机制不同分为 3 类,分别为降低细胞内抗生素浓度(包括降低细胞通透 性或外排)、靶向改变(包括靶向保护或靶向突变)以及抗生素失活.畜禽养殖业抗生素的大量使用 引起养殖环境抗性基因丰度的提高,抗性基因与抗生素之间存在相关关系.检测了我国 3 个省 36 份猪场环境样品(包括粪便、堆肥、土壤)中的 149 种抗性基因,结果表明检出的抗性基因对应的 抗生素分别为大环内脂林可霉素链阳杀菌素 B(macrolidelincosamidestreptogramin B,MLSB)、 内酰胺类、四环素类、喹诺酮氯霉素胺酰醇类、万古霉素等,按抗性机制分类抗生素失活检出 率最高,其后依次为外排和细胞保护机制;而抗性基因丰度与转座酶基因丰度、铜、土霉素含量 具有正相关关系.较高的抗性基因丰度可能由于在抗生素的选择压力下抗性基因宿主细菌的增殖, 以及某些抗性基因通过移动基因元件(Mobile genetic elements)发生基因水平转移(Horizontal gene transfer). 在畜禽养殖废水方面,四环素类、磺胺类、大环内脂类抗生素的抗性基因研究较多,按抗性 机制分类,畜禽养殖废水中抗性基因分布特征详见表 1.)测试了猪场废水中不同机制的四环素抗 性基因,发现核糖体保护(靶向保护)抗性基因(tetQ、tetM、tetW、tetO)比外排泵机制抗性基因 (tetA、tetB、tetC、tetL)、酶修饰(抗生素失活机制)抗性基因(tetX)丰度高,其在猪场废水中 丰度分别为 9.2510-2、5.5310-2、1.6910-2 和 1.3210-2 copies/16S rRNA.而和)研究 也表明 tetQ、tetM、tetW、tetO 在猪场废水中具有较高的丰度.)研究了猪粪水厌氧发酵土壤生 态系统中 3 种核糖体保护机制的四环素类抗性基因丰度 tetQtetOtetW,其中 tetQ 平均丰度最 高 1.8410-1 copies/16S rRNA.)调查了上海地区猪场和牛场废水中磺胺类和四环素类抗性基因, 含量最高的分别为 sulA(1081010 copies mL-1)和 tetW(106107 copies mL-1),而 sulIII 含量与磺胺类抗生素浓度的相关性较好,这可能与磺胺类抗生素易生物降解性有关;tetM 含量与四环素类抗生素浓度相关性较弱.)也指出 TC 与 tet 无显著相关性.除四环素类与磺胺类抗 生素之外,泰乐菌素是应用最广泛的兽用抗生素之一,可能引起大环内脂类抗性基因以及 MLSB 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 的多重抗性基因丰度的提高.)对 3 家猪场大环内脂抗性基因 erm 进行了定量检测,废水中 ermB、 ermF 含量较高(在 1081010 copies mL-1 之间),而 ermX 在 104106 copies mL-1 范围. 通过寡聚糖杂交探针测试方法,发现猪粪水和氧化塘废水中 50%的 rRNA 携带 MLSB 多重抗性基因. 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 表 1 基于抗性机制分类畜禽养殖废水中抗性基因赋存特征 针对抗性基因与基因转移元件的相关性,sulI 与 intI1 具有极显著的相关性 (p0.001;r=0.803),这可能由于 sulI 经常与一类整合子结合在一起指出 tetM 可能由转座子 Tn916Tn1545 和结合质粒介导. 3 畜禽养殖废水中重金属对抗生素抗性基因的影响 畜禽养殖过程在饲料中添加铜、锌等重金属引起猪粪水中抗铜、抗锌细菌的增加,畜禽养殖 废水存在抗生素与重金属复合污染特征.在重金属的选择压力下,畜禽养殖粪水中重金属抗性基 因丰度较高.对猪饲料、肠道和粪便中抗铜细菌进行了分析鉴定,发现猪粪中抗铜大肠杆菌与饲 料中硫酸铜添加量正相关,分离得到的 239 株抗铜细菌中携带抗铜基因 pcoA、pcoC、pcoD,携带 抗铜基因的细菌也同时携带链霉素和四环素的抗性基因(strA、strB、tetB).而研究了猪粪中抗 锌细菌的分布规律,结果表明猪粪中普遍存在抗锌细菌,抗锌大肠杆菌的检出率与饲料中氧化锌 的添加成正相关关系;抗锌菌株主要携带抗锌基因 zntA. 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 畜禽养殖环境重金属的污染不仅引起重金属耐受菌及抗铜、抗锌基因丰度的提高,可能存在 重金属与抗生素的协同选择作用(coselection),重金属的选择压力可能使抗生素抗性基因丰度 维持在较高水平.欧盟国家已禁止抗生素饲料添加剂的使用,但减少抗生素使用并不会阻止抗性 基因的传播,养殖场重金属使用可能会通过协同选择增加抗生素抗性基因的传播.研究发现磺胺 类 sulA 与重金属 Hg、Cu、Zn 具有显著相关关系.研究发现猪场废水中高浓度的 Cu 和 Zn 显著提 高了耐 内酰胺大肠杆菌的丰度. 图 1 猪粪分离的具有重金属与抗生素协同抗性的质粒 pMC2 指出重金属和抗生素抗性的协同选择机制主要是因为重金属和抗生素的抗性机制的耦合作用, 包括交叉抗性(crossresistance)和协同抗性(coresistance).交叉抗性是某种抗性基因编码的酶 或蛋白具有提高细胞耐受多种抑菌物质(如抗生素或重金属)的能力,如多重药剂外排泵(multi drug efflux pumps),其可以将毒性物质迅速排出细胞外.而协同抗性指的是具有两种或多种抗 性功能的基因相互邻近并在一个移动基因元件上.如猪粪中分离的质粒 pMC2,携带大环内脂、四 环素等抗生素抗性基因和汞、铬等重金属抗性基因,具有很强的移动和结合能力总结了畜禽粪便 中重金属引起抗生素协同抗性的最小浓度(Minimum coselective concentration,MCC),Cu 和 Zn 的 MCC 值分别为 11.79 和 22.75 mg kg-1 DM,但作者也指出非常缺乏畜禽养殖废水重金属 对抗生素抗性基因协同选择的数据.另外,养殖废水复合污染的特性也增加了抗性基因研究的难 度.4 畜禽养殖废水处理工艺对抗性基因的消减 (Removal of antibiotic resistance genes during process of animal wastewater treatment) 4.1 常规生物处理工艺 厌氧消化是畜禽养殖场采用最为广泛的废水处理工艺.指出厌氧过程抑制细菌代谢,对抗性 基因传播具有抑制作用.指出 ARGs 去除与厌氧菌群结构具有相关性,主要表现在抗性基因的宿主 菌群在厌氧环境中的变化. 针对厌氧消化处理养殖废水抗性基因的变化,现场调研较多,参数优化的研究较少,针对猪 场废水的研究较多,其他种类的养殖废水研究较少,不同生物处理工艺抗性基因赋存特征详见表 2.研究了不同规模猪场的废水生物处理系统抗性基因去除效果,结果表明厌氧消化和好氧生物处 理对 tetA、tetW、sul1、sul2、blaTEM 抗性基因平均去除率在 33.3%97.56%.考察了环境温度下 厌氧消化在不同季节的处理效果,夏季 ermB、ermF、ermX 的去除效果优于冬季,夏季厌氧消化 出水较猪场原废水 ermB、ermF、ermX 和 tetG 平均降低 1.2、0.8、0.7 和 1.1 log 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 copies mL-1,表明温度是厌氧消化去除抗性基因的重要控制指标.针对温度对厌氧消化抗性 基因消减的影响,)指出高温厌氧消化对四环素类抗性基因 tetA、tetO、tetW、tetX 有显著去除, 它们的去除符合一级反应动力学模型,而 tetL 只存在于革兰氏阴性菌,厌氧处理对其去除效果 不明显,而在好氧高温处理(55 )过程中 tetL 丰度表现出线性降低趋势.比较了高温和中温厌 氧消化对牛粪中耐药菌的影响,结果表明高温可全部消灭多重耐药菌(抗头孢唑啉、新霉素、万 古霉素、土霉素、氨苄西林等),而中温发酵只可以去除多重耐药菌 12 log cfu mL-1. 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 表 2 猪场废水生物处理过程中抗性基因的赋存特性 除厌氧消化工艺以外,氧化塘、人工湿地也是畜禽养殖场广泛使用的废水处理工艺.Joy 等. 调查了氧化塘储存猪场废水 40 d 抗性基因的变化,ermB 和 ermF 的丰度分别降低了 50%60%和 80%90%,而 tetX 和 tetQ 丰度的消减符合一级反应动力学模型.将氧化塘处理猪场废水后抗性基 因的去除趋势归为两类,一类是相对丰度大幅降低甚至低于检测限,包括 tetB、tetL;另一类为 经处理后丰度不变甚至有所提高,包括 tetG、tetM、tetO 和 tetX,可能因为这类基因常位于转 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 移原件上,在废水中发生了基因的水平转移.郑加玉等采用水平流人工湿地处理猪场废水,结果 表明 tetW、tetM 和 tetO 的浓度平均去除率分别为 95.73%、92.21%和 95.05%;可能由于土壤对抗 性基因的吸附作用,湿地土壤中抗性基因的丰度有明显升高现象.Liu 等模拟垂直流人工湿地中添 加沸石研究抗性基因的消减规律,发现在 HRT 为 30 h 时猪场废水抗性基因去除效果较好. 4.2 膜生物反应器(Membrane bioreactor,MBR)工艺 膜分离技术近年已在畜禽养殖废水处理领域得到了一定的研究与应用,并日益得到重视.例 如,Padmasiri 等采用厌氧 MBR 处理猪场废水,有机负荷为 1.0 kg m-3 d-1 高于其他厌氧 消化工艺采用好氧 MBR 处理猪场厌氧消化液 TN 负荷 0.11 kg m-3 d-1 较高.然而针对 MBR 处理畜禽养殖废水抗性基因去除规律的研究较少.Du 等调研了污水处理厂采用 A2OMBR 工艺处理生 活和工业混合废水对四环素类和磺胺类抗性基因的去除效果,结果表明 MBR 工艺对 tetG、tetW、 tetX、sul1 和 intI1 分别去除了 2.20、2.90、1.71、2.15 和 2.07 log copies mL-1,膜出 水抗性基因丰度仍然较高(2.854.97 log copies mL-1),然而作者并未给出膜孔径等膜分离 工艺参数. 同常规生物处理工艺相比,MBR 的生物量高,可能存在较大的抗性基因水平转移风险.Yang 等以 RP4 质粒作为水平转移研究对象,研究了 MBR 中抗性基因的水平转移效率,结果表明 RP4 在 MBR 中维持较高丰度 104 copies/mg biosolid,具有较高的水平转移效率(2.7610- 5/recipient),而 RP4 在常规活性污泥法的水平转移效率约 410-6 /recipient;尽管存在较高 的水平转移效率,但由于微滤膜(PVDF,0.22 m)的截留作用,出水检测不到携带抗性基因的 RP4.由于膜的截留,一方面可消减膜出水的抗性基因浓度,另一方面导致反应器内污泥浓度高, 可能使抗性基因在反应器内积累,提高了污泥中抗性基因的水平传播.污泥是重要的抗性基因蓄 积库,经过堆肥或厌氧消化处理后作为肥料土地利用,污泥的土地利用存在抗性基因的污染隐患. 4.3 消毒工艺 已有研究考察了消毒工艺(包括紫外、臭氧、加氯)处理畜禽养殖废水时对耐药菌的杀灭效果. 研究发现,加氯量和臭氧用量分别为 30 mg L-1 和 100 mg L-1 时,猪场氧化塘废水中细 菌总数分别去除了 2.23.4 log cfu mL-1 和 3.33.9 log cfu mL-1,然而林可酰胺、金 霉素、磺胺甲恶唑耐药菌对加氯消毒不敏感,而四环素耐药菌对加氯消毒敏感,臭氧对耐药菌的 影响并未给出相应结果.加氯对抗万古霉素肠球菌具有较好的灭杀作用.而 GomezAlvarez 等研究 加氯消毒对饮用水中抗性基因的影响,宏基因组数据表明加氯消毒后饮用水中仍含有编码 内 酰胺酶(bla)、外排泵等抗生素抗性基因,表明耐受液氯氧化性的细菌同时携带抗生素抗性基因. 关于紫外和臭氧对畜禽养殖废水抗性基因的去除研究较为缺乏,研究了紫外灭菌对市政排水抗性 基因消减的影响,结果表明紫外强度为 249.5 mJ cm-2 时对抗性基因消减效果最佳,tetX 和 16S rRNA 分别去除了 0.58 和 0.60 log.Oh 等采用模拟实验研究了臭氧对耐药性埃希氏大肠杆菌 (Eschericia coli, E. coli)的去除,结果表明臭氧剂量为 3 mg L-1 时耐药性 E. coli 去 除了 1 log. 4.4 组合工艺 畜禽养殖废水通常采用厌氧好氧组合工艺进行处理.Chen 等在监测某猪场夏季废水处理工艺 对抗性基因去除效果时,发现经过厌氧消化好氧滤池处理,ermB 丰度分别降低了 1.2 log、0.9 log copies mL-1,而 ermB 在出水储存池中已低于检测限;tetG 在厌氧、好氧过程分别降低了 1.1 log、3.4 log copies mL-1.对我国东部某猪场废水采用厌氧消化与氧化塘组合工艺去除 抗性基因的效果进行了调查,发现 tetO、tetQ、tetW 有明显去除,丰度从 10-1 降至 10-3 copies/16S rRNA,这可能由于 tetQ 和 tetW 宿主细菌多为厌氧菌,而 tetO 多为好氧菌携带,这 些抗性基因无法在厌氧好氧交替环境中维持.而关于生物处理与消毒组合工艺对畜禽废水中抗性 基因的去除作用,研究结果非常缺乏. 中国污水处理工程网() 找污水处理技术,上中国污水处理工程网 5 畜禽养殖废水农田利用对土壤和植物中抗性基因的影响 由于畜禽养殖废水中富含有机质、氮、磷等营养物质,通常经过厌氧发酵、氧化塘等工艺处 理后,作为肥水还田利用,这既节约了处理成本,也促进了养分循环利用,目前我国、美国、欧 洲等国家都推行畜禽养殖废水的农田利用.然而,畜禽养殖废水农田利用可能产生抗性基因从养 殖场向农田土壤的传播风险. 土壤是重要的抗性基因储存库,其中主要的抗性基因来源包括土壤中固有的抗性微生物所携 带的抗性基因,以及外源进入土壤中抗性微生物所携带的抗性基因,但有关土壤中抗性基因的研 究较为缺乏.)指出猪粪施用于农田存在抗性基因的水平转移风险,由于粪源微生物与土壤微生物 不同,粪源微生物进入土壤后在几个月中大量消失,但抗性基因可通过水平转移进入土壤本土微 生物中,进而引起土壤微生物抗性基因丰度的增加.而研究发现牛粪农田利用引起土壤中抗性基 因 blaCEP 丰度的提高是由于携带抗性基因的假单胞菌(Pseudomonas sp.)和紫色杆菌 (Janthinobacterium sp.)的增殖,而这两种细菌来自于土壤,而非粪便引入.粪便农田利用可引 起抗性基因丰度提高,但其微生物学机制仍不明确. 畜禽养殖废水还田利用一定时间内会显著提高土壤中抗性基因丰度.对北京某猪场周边土壤 四环素抗性基因进行了定量检测,发现丰度较高的四环素类抗性基因为 tetB/P、tetT、tetM、 tetO 和 tetW,其基因拷贝数范围在 106108 copies g-1 DM,并认为 tet 抗性基因存在由畜 禽养殖向土壤的转移.的研究发现,猪场废水农田利用后土壤中抗性基因 tetQ、tetZ 和整合子 intI1、intI2 分别提高了 500、9 和 6、123 倍.的研究发现,施用猪场厌氧消化液的土壤中四环 素类抗性基因丰度为 105108 copies g-1,显著高于未施用猪场废水的土壤,而作物类型对 抗性基因的丰度影响较小.)研究了抗性基因沿土壤深度的变化,结果表明 tetO、tetW、tetM、 tetA 丰度沿土壤深度在 080 cm 逐渐降低.)发现,饲料中添加磺胺嘧啶显著影响猪粪还田后土壤 中 sul 抗性基因的变化,添加磺胺处理组在第 60 dsul1 抗性基因丰度降低至 10-3 copies/16S rRNA、而 sul2 升高至 10-1 copies/16S rRNA,饲料未添加磺胺嘧啶处理组 sul1 和 sul2 均呈现 降低趋势,丰度分别为 10-6 和 10-5 copies/16S rRNA 研究了施用猪粪的玉米根际土壤与非根际 土壤微生物群落变化,结果表明根际土壤 sul1 和 sul2 抗性基因略低于非根际土壤,可能与根际 环境磺胺嘧啶降解速度快有关,而 sul 基因常与质粒结合,根际土壤是质粒发生结合转移的热点 区域.考察了土壤类型对抗性基因的影响,发现壤土中 sul2 基因丰度高于砂土.)采用宏基因组文 库研究了土壤中不可培养细菌携带的抗性基因,结果表明猪粪还田的土壤携带四环素类、利福平、 氨基糖胺类、氯霉素类抗性基因.同未施用畜禽粪便的土壤相比,发现施用猪粪的土壤中大环内 脂类抗性基因(ermA、ermB、ermF 等)和质粒(IncQ、IncW)丰度有提高.发现携带多重抗性的质粒 IncP-1在粪便施用后的土壤中扩散. 在畜禽养殖粪污还田利用时,不同种类抗性基因随时间的消减规律各不相同.指出施用猪粪 后,土壤中抗性基因表现出先增加后降低趋势,但抗性基因相对丰度在 1 年的施肥间隔后无法回 到本底值,尤其是 sul1、ermB、strB、intI1、IncW repA 在土壤中丰度较高.的研究发现,猪粪 还田后 sul1、sul2、ermF 快速升高,随后 ermF 消减速度最快,在施肥 4355 d 后降至本底水平, 而 tetG、tetO、tetW 在施肥土壤和控制土壤中无差异;并且作者指出粪便还田后 12 个月内土壤 抗性基因丰度较高,应采取措施防止抗性基因进入水体或邻近土壤中.不同类型抗生素的抗性基 因在土壤中恢复本底值的时间不同,例如,MLS 抗性基因恢复到土壤本底值需要 20 d,sul1 需要 2 个月,而四环素类抗性菌株需要 6 个月.关于畜禽养殖废水对养殖场受纳水体的影响,发现猪场 氧化塘下游河流中 250 m 仍可得四环素抗性基因 tetM.研究了福建闽江流域 E. coli 的耐药性, 畜禽养殖废水可能是该流域抗生素耐药率高的重要因素,河水分离的 E. coli 中 41%携带一类整 合子,整合子介导的抗性基因包括 aadA1、drfA1、drfA27、arr3 等. 有关土壤环境中重金属与抗生素抗性基因的研究较少.指出土壤中 Cu 含量(0140 mg kg- 1DM)与 tetM、tetW、ermB、ermF 具有相关性,且 blaOXA 与 Cu 具有极

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