胶体金ppt课件

金免疫技术,金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术，于70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。 目前，金免疫技术除用于免疫组织化学染色外，还应用于金免疫测定中，由于金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛、简便、快速的检验方法。,金免疫技术方法学主要有金免疫组织化学染色技术和金免疫测定技术，前者包括金（银）免疫光镜染色技术和金免疫电镜染色技术；后者包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等。,第一节 胶体金与免疫金的制备,一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存,一、胶体金特性及其制备,1.胶体金的结构 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。,2.胶体金性状 （1）胶体金一般性质：胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。,影响胶体金溶液稳定性的主要原因,胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。 水化层的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。,胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。,（2）胶体金的颜色和光吸收性：对同一种物质的水溶胶金颗粒来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，2040nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色或吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小（如表20-1所示）,3.胶体金的制备,（1）制备原理 向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。,（2）操作要点 最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。 先配制HAuC14水溶液，加热至沸。搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠（Na3C6H5O72H2O）水溶液。继续加热煮沸一定时间。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约23min。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。通过改变柠檬酸三钠的用量可以制得不同大小的胶体金颗粒,4.胶体金鉴定,胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描max来估计金颗粒的粒径。制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。,5.胶体金保存,胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。,6.注意事项,（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。,二、免疫金的制备,免疫金（immunogold）是指胶体金与抗原（抗体）的结合物,在免疫组织化学技术中，习惯上要称之为金探针。,1.制备原理,胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质的正电荷基团间靠静电力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合,同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条件。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。,2.技术要点,（1）胶体金溶液的pH值调整 用K2CO3或HC1溶液调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。 在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.1的聚乙二醇（PEG20000）稳定胶体金后，再测定胶体金的pH值。,（2）蛋白质最适标记量的确定 将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定量胶体金的试管中，然后分别加入NaCl溶液，混匀后静置数小时，对照管(无蛋白)及加人蛋白量不足的管，溶液颜色由红变蓝;蛋白量足或超过的管保持红色不变，其中含蛋白量最低的一管即为稳定胶体金所必须的最适标记量。以此比例并增加10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量。 由于蛋白质溶液含盐量较高或形成聚合物极易影响标记过程，因此，标记之前最好将蛋白质溶液用低浓度的盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。,（3）标记过程 在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，反应一定时间后加入 BSA并调整pH至8.5，放置室温继续反应数分钟。,（4）离心分离 离心条件视胶体金颗粒的粒径而异： 对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 轻吸上清液，沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤24次。以彻底除去未结合的蛋白质。,三、免疫金的保存,免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入含稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。,第二节 金免疫测定,一、胶体金免疫渗滤试验 二、胶体金免疫层析试验 三、临床应用及评价,一、斑点金免疫渗滤试验,(一) 原理 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上（这种固相载体具有过滤性能）制成抗原或抗体包被的微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加在膜上的标本、免疫金、及洗涤液等液体很快渗入吸水材料中，最后阳性反应在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的（一般在5分钟左右完成），同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤目的，简化了操作步骤，达到简便的目的,成为“床边检验(point of care test,POCT)”主要方法之 一,(二) 方法类型,1双抗体夹心法 用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，若标本中待测抗原则与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 2间接法 用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后, 滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰,易导致假阳性结果,临床上较少用。,(三) 技术要点,1.试剂盒组成 滴金反应板 (图20-1)胶体金免疫渗滤试验中主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的醋酸纤维素膜片三部分组成。胶体金标记物 洗涤液 。,2.操作要点,2.操作要点 将反应板平放于实验台面上，于小孔内滴加含待测抗原标本1-2滴，待完全渗入；于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂1-2滴，待完全渗入； 于小孔内滴加洗涤液2-3滴，待完全渗入；在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。,二、 斑点金免疫层析试验,(一) 原理 斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay,DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术，与胶体金免疫渗滤试验的过滤性能不同，DICA中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判定实验结果。本法除试剂盒外，不需任何仪器设备。,(二) 方法类型,1.双抗体夹心法 若图20-2所示，G处为金标抗体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。,2.竞争法 如图20-3所示, G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫金抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。,3间接法 为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图20-4)。,测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为含能与蛋白结合的有色染料的标本加样区，F处吸水材料；左面中央开有观察窗口B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。,（三）技术要点,1.试剂盒组成 主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上(如图20-2)，试剂条的底板为单面胶塑料片,层析条为多孔聚乙烯、硝酸纤维素、玻璃纤维素材料，A、B两端粘贴吸水性强的滤纸等材料。G为干燥固定在玻璃纤维膜等材料上的胶体金结合物。T为粘附有已知的抗体或抗原，C处粘附有质控品(抗免疫金抗体)，T、C点物质往往以直线的形式包被在膜上。,2.操作要点 以双抗体夹心法为例，将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5秒或在标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上；5-20分钟内观察结果；结果判断：出现一条棕红线质控条带为阴性，出现两条棕红线条带为阳性，无棕红线质控条带出现为试剂失效。,三. 临床应用及评价,1本法具有操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定，便于保存等特点，因此特别符合“床边检验”项目要求。 2本法灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临床应用中应引起高度重视。 3.该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验，目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）的检测。,第三节 金免疫组织化学染色技术(colloidal gold immunohistochemistry staining technique) 一、免疫金(银)光镜染色技术 二、免疫金电镜染色技术 三、临床应用与评价,一、免疫金（银）光镜染色技术,(一)原理 免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）是在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术。1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法。基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag+)还原成银原子(Ag)。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终使抗原位置得到清楚放大,（二） 技术要点,1. 配制银染色液 在pH3.5柠檬酸缓冲液中加入明胶、对苯二酚、硝酸银配制而成。 2染色被检血清经适当稀释后均匀滴加在细胞抗原片上，被检血清中抗体与片上抗原结合，流水冲洗后再用缓冲液冲洗，加BSA进行封闭；滴加适当稀释的SPA-胶体金进行反应；滴加新鲜配制的银染液，室温避光染色反应；流水冲洗、晾干、中性树胶封片后光镜下检查，银灰色颗粒沉积者为阳性。,（三）注意事项