课件：第九章血脂及血浆脂蛋白检验.ppt

第九章 血脂及血浆脂蛋白检验,第一节 概述 第二节 血清总胆固醇测定 第三节 血清三脂酰甘油测定 第四节 血清高密度脂蛋白胆固醇测定 第五节 血清低密度脂蛋白胆固醇测定 第六节 血清载脂蛋白A1和B测定 第七节 血清脂蛋白电泳分析 第八节 血清脂蛋白（a）测定,本章内容概要,第一节 概述,血脂及血浆脂蛋白 脂蛋白代谢紊乱,一、血脂及血浆脂蛋白,血脂：是指血浆中脂类的总称。属于中性脂肪（甘油三酯和胆固醇）和类脂（磷脂、糖脂、固醇、类固醇）的总称,定义：,脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质 与蛋白质结合成脂蛋白的形式存在。,（一）血浆脂蛋白的分类,超速离心法：根据脂蛋白在一定密度的介质中漂浮 速率不同而进行分离的方法。,电泳分离法：根据不同密度的脂蛋白所含蛋白质的 表面电荷不同，利用电泳将其分离， 并与血浆蛋白质的迁移率比较以判断 其部位。,分离方法,超速离心法：,乳糜微粒（chylomicron,CM）,极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）,中间密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein,IDL）,低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）,高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）,脂蛋白（a）（lipoprotein (a),Lp(a)）,乳糜微粒、前-、和 四条脂蛋白区带,电泳法,（二）血浆脂蛋白的组成,组成：,蛋白质、三脂酰甘油、磷脂（PL）、游离胆固醇（FC）及胆固醇酯（CE）等成分组成。,其中蛋白质部分称为载脂蛋白（Apo）,A ApoA A A B48 ApoB 载脂蛋白（a） B100 C ApoC C C ApoD 近年来，还发现了Lp（a）,脂蛋白分类,1.乳糜微粒CM 颗粒最大，脂类含量高达98%，密度极低。由小肠粘膜细胞在吸收食物脂类（主要是甘油三酯）时合成，经乳糜导管，胸导管到血液。主要功能为运输外源性甘油三酯。 2.极低密度脂蛋白vldl 主要在肝脏利用脂肪酸和葡萄糖合成。若食物摄取过量糖或体内脂肪动用过多，均可导致血vldl增高。vldl中脂类占85%-90%，其密度也很低。主要功能为vLdL是运输内源性甘油三酯。 3.低密度脂蛋白LdL的结构大致可分为三层：内层、 中层、外层。游离胆固醇分布于三层之中。,4.高密度脂蛋白HBL 是一组不均一的脂蛋白 HBL主要由肝合成，小肠也可合成，HBL按密度大小又可分为HBL1、HBL2和HBL3。HBL1又称为HBLc，仅在摄取高胆固醇膳食后才在血中出现，健康人血浆中主要含HBL2和HBL3。HBL主要是将胆固醇从肝外组织转运到肝进行代谢。 5. 脂蛋白（a） lp(a)核心部分由甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇酯等脂质和载脂蛋白b100组成，结构类似LdL。 lp(a)含有两类载脂蛋白，即apoB100和apo(a) lp(a)是动脉粥样硬化性疾病的一项独立危险因子。,（三）血浆脂蛋白的结构与功能,结构：大致为球形颗粒，由两大部分组成 即疏水性的内核和亲水性的外壳（图10-1）。 内核由不同量的CE与TG组成 表层由载脂蛋白、PL及FC组成 FC及PL的极性基团向外露在血浆中，载脂蛋白是兼性化合物，它的疏水部分掩蔽在脂蛋白中，而亲水部分突出于脂蛋白颗粒的表面。,血浆脂蛋白的结构与载脂蛋白的功能有密切的联系,脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白(Apo),载脂蛋白定义：,种类：,按1972年Alaupovic建议的命名方法，用英文字母顺序编码，分为ApoA、B、C、D、E、F、G、H、J等。由于氨基酸组成的差异，每一型又可分若干亚型。,功能：,维持脂蛋白的结构 例如：ApoA、ApoC、ApoE 调节脂蛋白代谢的关键酶 例如：ApoA、ApoC能激活磷脂酰胆碱胆固醇脂酰基转移酶（LCAT） 促进胆固醇的酯化，ApoC激活脂蛋白脂肪酶（LPL），促进 CM和VLDL中三脂酰甘油降解 识别脂蛋白受体 例如：ApoE能识别肝细胞CM残余颗粒受体 ApoB100识别LDL受体,脂蛋白受体,定义：,脂蛋白受体是一类位于细胞膜上的糖蛋白。它能以高 度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，从而介导细胞对 脂蛋白的摄取与代谢，进一步调节细胞外脂蛋白的水平。,脂蛋白与脂蛋白受体的作用：,不仅是运送细胞所必需的脂蛋白，也能消除血和外周组织中具有潜在致动脉粥样硬化的脂蛋白。,种类：,已有很多种，主要有LDL受体、残粒受体及清道夫受体。,LDL受体： 不仅能识别ApoB100、ApoE，在细胞结合、摄取和降解LDL及其它含ApoB100的脂蛋白过程中起中介作用，对维持细胞和全身胆固醇平衡起重要作用。,各种脂蛋白受体功能,残粒受体： 能识别ApoE，是清除血液循环中CM残粒和-VLDL残粒的主要受体，它也能结合含ApoE的HDL。,清道夫受体： 主要存在于巨噬细胞表面,介导修饰LDL(包括氧化LDL和-VLDL)从血液循环中清除。,二、血浆脂蛋白代谢紊乱,血浆脂蛋白代谢分类：,外源性代谢途径：指食物中摄入的胆固醇和甘油三酯在 小肠中合成CM及CM代谢的过程 。,内源性代谢途径：指肝脏合成VLDL，然后转变为IDL和LDL 并被肝脏或其它器官代谢的过程,胆固醇的逆向转运：,HDL参与将胆固醇从外周组织运输到肝脏的过程。,脂蛋白代谢紊乱,（一）高脂蛋白血症,定义：,高脂血症是指血浆中胆固醇或和甘油三酯水平升高。血浆脂类以血浆脂蛋白形式存在，因此，高脂血症一定时会导致高脂蛋白血症。,分型：,1表型分型法,主要是基于各种血浆脂蛋白升高的程度不同而进行分型。该分类法不包括病因学，故称表型分类。,（1）型高脂蛋白血症 又称家族性高乳糜微粒血症,（2）a型高脂白血症,（3）b型高脂蛋白血症,（4）型高脂蛋白血症,（5）型高脂蛋白血症,（6）型高脂蛋白血症,高脂蛋白血症表型分型法,甘油三酯及胆固醇危险水平的划分标准,2按是否继发于全身性疾病分类,继发性高脂血症：,原发性高脂血症：,继发性者由一些全身性疾病引起血脂异常，如糖尿病、肾病综合征、肾功能衰竭、甲状腺功能减退症、肝胆疾病、系统性红斑狼疮、肥胖症、饮酒等。此外，某些药物如-受体阻断剂、降压药等也可引起血脂异常。,在排除继发性高脂血症后，可诊断为原发性。已知部分原发性高脂血症由先天性基因缺陷所致,3高脂血症的基因分型法,家族性高脂血症的临床特征,低脂蛋白血症,1家族性低-脂蛋白血症,2-脂蛋白缺乏血症,3家族性低-脂蛋白血症,第二节 血清胆固醇测定,简介,胆固醇是人体内重要的脂类成分，具有重要的生理功能。 游离胆固醇 30% 血清总胆固醇（TC） 胆固醇酯 70% 血浆胆固醇 引起动脉粥样硬化，形成堵塞性血管疾病。,血清（浆）总胆固醇测定,一、比色法 二、酶法 三、气相色谱法 四、高效液相色谱法 五、同位素-稀释质谱法,酶测定法,特点：,常规测定中现已广泛应用酶法，酶法具有特异性好，精密度和灵敏度。由于操作简便，试剂无腐蚀性，特别适用于自动生化分析，目前已成为测定胆固醇的主要方法。,原理,胆固醇酯H2O 胆固醇游离脂肪酸 胆固醇O2 胆烷-4-烯-3-酮H2O2 H2O24氨基安替比林酚 醌亚胺4H2O,试剂与器材,1、酶应用液 2、参考血清 3、器材 试管、刻度吸管、微量加样器、分光光度计、 恒温水浴箱,实验操作,取3支试管，按下表操作,混匀，置于37水浴箱，放置15分钟，以空白管调零点，在 510nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算 测定管吸光度 血清胆固醇（mmol/L）= - 参考胆固醇浓度（mmol/L） 标准管吸光度 参考范围 3.105.70 mmol/L,评价：,主要缺点是：,优点：本法灵敏度高、准确度高、精密度好，线性范围宽。,本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。,影响TC水平的因素,年龄与性别； 长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高； 遗传因素； 其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。,【临床意义】,病理性高TC血症：见于脂肪肝、肝脏肿瘤、甲状腺功能亢进 严重糖尿病、动脉粥样硬化等。,病理性低TC血症：见于肝脏疾病如急性肝坏死、肝硬化， 甲状腺功能亢进，恶性贫血、溶血性贫血 营养不良等,第三节 血清三脂酰甘油测定,简介,三酰酯甘油（TG）是由一分子甘油和三分子脂肪酸组成。 每一分子三酰酯甘油含有23种不同的脂肪酸。,血清（浆）甘油三酯的测定方法,气相层析 高效液相层析 红外分光光度法 散射比浊法 化学法 酶法,基本操作：,（一）化学法 分溶抽提-乙酰丙酮显色法,1、抽提：关键是选用合适的抽提剂，既要使甘油三酯提取完全，又要消除磷 脂、游离甘油和葡萄糖等干扰物质的影响。 2、皂化：甘油三酯水解生成甘油，这一步大都采用KOH作皂化剂 3、氧化：过碘酸在酸性溶液中将甘油氧化成甲醛和甲酸 4、显色：甲醛的定量主要有两种方法：,甲醛与变色酸(4，5-二羟-2，7-萘二磺酸)在硫酸溶液中加热生成紫色化合物,甲醛与乙酰丙酮在铵离子(NH4+)存在下生成黄色的二乙酰二氢二甲基吡啶,实践步骤,加入物（ml） 测定管 对照管 空白管 血清 0.02 - - 标准液 - 0.02 - 蒸馏水 - - 0.02 抽提液 2.5 2.5 2.5 0.04mol/L H2SO4 0.5 0.5 0.5 加H2SO4时边加边摇，使其充分混匀，静置分层后分别准确吸取上清液于另外3支试管中 上清液 0.3 0.3 0.3 造化剂 1.0 1.0 1.0 混匀，在56恒温水浴箱中保温5min 氧化剂 1.0 1.0 1.0 显色剂 1.0 1.0 1.0,混匀后，置60 水浴20min，取出冷却。用分光光度计在波长 415nm处，空白管调零，读取各管吸光度。 计算 测定管吸光度 血清三酰酯甘油（mmol/L）= - 标准液浓度（mmol/L） 标准管吸光度 参考范围 0.561.70mmol/L,注意事项,1.每加一次试剂需摇匀。 2.皂化、氧化与显色的温度和时间对吸光度均有影响，因此，每批标本都需要做标准管。 3.以血浆作标本时，应注意抗凝剂的影响，通常用EDTA-Na2. 4.标本应及时分离，无论血清、血浆。,(二)酶法,磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法） 原理 TG + 3H2O LPL 甘油 + 3脂肪酸 甘油 + ATP GK 磷酸甘油 + ADP 磷酸甘油 + O2 GPO 磷酸二羟丙酮 + H2O2 2 H2O2 + 4-AAP+4-氯酚 POD 红色醌类化合物 + 4H2O GOP、4-AAP、4-氯酚三者合称PAP，故本法称GPO-PAP法,试剂与器材 1、三酰酯甘油测定酶试剂 2、三酰酯甘油水溶性标准液 3、器材 试管、刻度吸管、微量加样器、分光光度计、 37 恒温水浴箱。,实验操作,取3支试管，按下表操作,混匀后，置37 水浴15min，用分光光度计在波长500nm处， 空白管调零，读取各管吸光度。 计算 测定管吸光度 血清三酰酯甘油（mmol/L）= - 标准液浓度（mmol/L） 标准管吸光度 参考范围 0.561.70mmol/L,注意事项,1、标本必须新鲜，4 放置不宜超过3天，时间过长，游离 甘油升高。 2、需用空腹血清作标本。 3、11.1mmol/L,需做稀释。,2019/4/19,49,可编辑,临床意义,TG随年龄增长而上升趋势，体重超标往往偏高。 正常成人空腹脂肪餐（脂肪1g/kg体重）后，24h内血清 混浊程度及TG值高峰，8h后恢复正常。脂肪清除率较差者， 清除时间延长。 病理性升高 见于原发性高脂血症、动脉粥样硬化、脂肪 肝、其他肝病、糖尿病、肾病综合症、胰腺炎、甲功能减退、 妊娠等。 病理性降低 见于原发性b脂蛋白缺乏症，肝功能严重低下、 甲功能亢进、肾上腺皮质功能减退等。,第四节 血清高密度脂蛋白胆固醇测定,概述,血清高密度脂蛋白（HDL）是密度最大的脂蛋白，由蛋白质、磷脂、胆固醇及其酯、三酯酰甘油组成。 HDL中主要脂类是磷脂，以磷脂酰胆碱最多，胆固醇是HDL中含量占第二位的脂类，酯化和游离的胆固醇之比约3：1 HDL所含的蛋白质主要是ApoA和ApoA，其中以ApoA更重要。 注意： 虽然磷脂部分比胆固醇含量多，但测定胆固醇比测定磷脂更 容易，故常以测定HDL-C含量代表HDL水平。,高密度脂蛋白测定,超速离心法 凝胶过滤层析法 免疫化学法 电泳法 沉淀法 临床实验室常用：沉淀法中的林钨酸-镁法,林钨酸-镁法,原理 用磷钨酸与镁离子作沉淀剂，选择性沉淀LDL和VLDL （主要含ApoB），上清液中只含HDL，测定上清液中 胆固醇含量。,试剂与器材 1、沉淀剂 2、酶试剂 3、参考血清 4、器材 试管、刻度吸管、微量加样器、分光光度计、 37 恒温水浴箱。,实验操作,HDL的提取 于小离心管中加血清200uI和沉淀剂200uI，混匀， 室温（20 ，不得高于30 ）放置15min，然后3000rpm离心 15min。 取3支试管，按下表操作,混匀，置于37水浴箱，放置15min，以空白管调零点，在 500nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算 测定管吸光度 HDL-C（mmol/L）= - 定值血清胆固醇浓度（mmol/L） 标准管吸光度 参考范围 成人男性 1.161.42 mmol/L 成人女性 1.291.55 mmol/L,注意事项,血清严重混浊时IDL和VLDL沉淀不完全，此时用生理盐水将血清做1：1稀释后再行沉淀，测定结果乘以2。 血清中高胆红素、维生素C、溶血都会有影响。,【临床意义】,HDL-C与冠心病发病呈负相关 HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素 HDL-C大于1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素 HDL-C下降 多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。 HDL-C增高 往往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。,第五节 血清低密度脂蛋白胆固醇测定,概述,低密度脂蛋白（LDL）由极低密度脂蛋白（VLDL）在血浆 中转变而来，是空腹血浆中含量最多的脂蛋白，约占脂蛋白 总量的1/2以上。 LDL中的胆固醇占血浆胆固醇总量的60%70%,其中胆固醇 酯占4/5，故有血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）之称。,测定方法,LDL-C测定没有决定性方法。 目前多采用聚乙烯硫酸（PVS）沉淀法,聚乙烯硫酸（PVS）沉淀法,空腹血清中主要含有HDL、LDL、VLDL。 用聚乙烯硫酸盐-聚乙二醇甲醚选择性地沉淀LDL，离心后上清 液中韩HDL、VLD测定出上清液HDL-C和VLDL-C总和。同时测定 血清总胆固醇含量。 LDL-C = TC -（HDL-C + VLDL-C）,实验操作,LDL分离 于小离心管中加血清200uI和沉淀剂100uI，混匀， 室温（20 ，不得高于30 ）放置15min，然后3000rpm离心 15min，取上清液与血清同时测定胆固醇。 取3支试管，按下表操作,混匀，置于37水浴箱，放置5分钟，以空白管调零点，在 500nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算 测定管1吸光度 上清血清胆固醇浓度= - 胆固醇标准液浓度 标准管吸光度 测定管2吸光度 总胆固醇浓度= - 胆固醇标准液浓度 标准管吸光度 上清LDL-C = TC - 上清液胆固醇浓度 参考范围 40岁以上成人 2.703.10 mmol/L 合适水平 4.41 mmol/L,【临床意义】,LDL-C水平与冠心病的发病率呈正相关 LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要脂类危险因素 由于TC水平同时也受HDL-C水平的影响，所以最好以LDL-C代替TC作为冠心病危险因素指标。 临床上以LDL-C水平作高脂蛋白血症的治疗决策及其需要达到的治疗目标。,第六节 血清载脂蛋白A1和B测定,简介,ApoA 是HDL的主要结构蛋白 约占HDL蛋白总量的64% ApoB100 是LDL的主要结构蛋白 约占LDL蛋白总量的95% 因此， ApoA和 ApoB100 可以直接反映HDL和LDL的含量。,血清载脂蛋白测定,免疫化学法：,单向免疫扩散（RID） 电免疫分析（如火箭电泳法） 放射免疫分析（RIA） 酶联免疫吸附分析（ELISA） 免疫浊度法等,早期,目前：,目前比较适合于临床实验室的是免疫浊度法，包括 免疫散射比浊法（INA）和免疫透射比浊法（ITA）。,免疫透射比浊法,原理 光线通过特异性抗原抗体复合物溶液时被吸收和散射， 使透射光减弱，其减弱程度与免疫复合物含量成正比，即与 抗原含量成正比。,试剂与器材,1、磷酸盐氯化钠缓冲液 2、200g/L 聚乙二醇磷酸盐缓冲液 3、40g/L 聚乙二醇磷酸盐缓冲液 4、8mol/L 尿素溶液 5、抗血清 6、器材 试管、刻度吸管、微量加样器、分光光度计、 离心机,ApoA测定实验操作,1、稀释抗血清 2、稀释血清标本 用尿素做1：40稀释 取3支试管，按下表操作,混匀，置于室温，放置1h，以 40g/L 聚乙二醇磷酸盐缓冲液 零点，在340nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算 吸光度差值 = 测定管吸光度 空白管吸光度 - 抗体空白管吸光度 用吸光度差值在标准曲线上查得结果。 【标准曲线】 参考血清用8g/L尿素作1：120、1：60、1:40、1：30、 1：20稀释，按上述操作测得各管吸光度，以ApoA浓度为横坐 标，以吸光度差值制作标准曲线。,ApoB 测定实验操作,1、稀释抗血清 用40g/L PEG-PBS 1：80稀释 2、稀释血清标本 用聚乙二醇磷酸盐溶液做1：10稀释 取3支试管，按下表操作,混匀，置于室温，放置30min，以 40g/L聚乙二醇磷酸盐缓冲 液零点，在340nm波长处进行比色，分别读取各管的吸光度。 计算 吸光度差值 = 测定管吸光度 空白管吸光度 - 抗体空白管吸光度 用吸光度差值在标准曲线上查得结果。 【标准曲线】 参考血清ApoB为0.70g/L，各标准管稀释度1：30、1：20、 1：10、1：5、1：4，分别相当于ApoB 0.233g/L、 0.35g/L、 0.70g/L、 0.70g/L、 1.40g/L、 1.75g/L.,参考范围 ApoA 1.0101.32g/L ApoB 0.5980.892g/L,注意事项,1、为了准确测定ApoA、 ApoB，必须作标准曲线计算结果。 2、样品最好不超过3天（4保存）。,【临床意义】,ApoAI是HDL的主要结构蛋白，其含量可代表HDL的水平。HDL主要参与胆固醇从外周组织转运到肝脏，故HDL是动脉粥样硬化的保护因素。 ApoAI水平与高脂血症、冠心病危险性呈负相关。 ApoB是LDL的主要结构蛋白，其含量可代表LDL的水平。LDL主要功能是将胆固醇由肝脏转运到外周组织，故血清LDL过高引起动脉粥样硬化。 ApoB水平与高脂血症、动脉粥样硬化呈正相关。,第七节 血清脂蛋白电泳测定,概述,血清脂蛋白电泳分析是利用电泳的原理直接测定血浆脂蛋白的组成和相对含量，对高脂蛋白血症的分型具有十分重要的意义。 电泳支持物可选择用醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，其中琼脂糖凝胶电泳为常见。,血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳原理:,脂类、在血浆中都与蛋白质结合成脂蛋白而粗、存在，根据在电场中的迁移率不同，以琼脂糖凝胶为支持介质，将血浆（血清）脂蛋白分离为-脂蛋白、前-脂蛋白、-脂蛋白和乳糜微粒四个部分。 正常空腹血浆中应不含乳糜微粒。 将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹黑B或油红O等）进行预染，再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离。 通电后，可以看出脂蛋白向正极移动，并分离为几个区带。 脂蛋白易分解，血液样品必须新鲜，分离血清后应在6小时内进行电泳。 室温下放置过久或冷藏过久都会造成分离不好，尤其是前-脂 蛋白带不清楚或消失。,试剂和器材,1、试剂 （1）饱和苏丹黑B染液 （2）电泳缓冲液 （3）巴比妥-盐酸缓冲液（pH8.2） （4）10mmol/L EDTA-Na2 （5）250g/L 蔗糖溶液 （6）5g/L琼脂糖凝胶 2、器材 (1) 试管、滴管 (2) 水浴锅 (3) 载玻片(2.57.5cm) (4) 刀片、X光片 (5) 1ml注射器 电泳仪,操作,1、融化：将分装于试管中的0.35%缓冲琼脂糖置沸水浴中加热融化。 2、制板：称热（约55左右）用吸管吸取缓冲琼脂糖2.5ml，均匀浇于 载玻片上，水平放置于室温中，冷却凝固后（约30分钟），在 距一端约2.5cm处用双刃刀片刻一小槽（约1.515mm），再 用胶片将其中的凝胶挑出，用滤纸条吸干其中的水分，备用。 3、预染血清：取血清0.2ml置于一小试管中，加入预染液0.02ml，混匀。 4、加样：先在上述小试管中加入与预染血清等量的预热至55的缓冲琼 脂糖，混匀。将凝胶板置电泳槽上，加样端靠近负极。然后取 混合物约40l加于凝胶板小槽内。 5、电泳：将上述加好样品的琼脂糖凝胶板两端分别用四层纱布与电泳槽 缓冲液搭桥，再用电压120伏，通电约3040分钟，既可见脂蛋 白各带清晰分离。 6、结果描述：切断电源，取出凝胶板，作图，对电泳图谱作定性或半定 量描述。,正常参考值（百分比）,-脂蛋白 26.837.1% 前-脂蛋白 11.019.2% -脂蛋白 48.058.2% 乳糜微粒 阴性,临床意义,高脂蛋白血症名称 分型 CM LP PreLP L 高乳糜微粒血症 型 正常或 正常或 正常或 高- 脂蛋白血症 a型 无 正常或 正常 高-脂蛋白血症