醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验报告.doc

前言血清蛋白：血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70 000，这就是一个数据了。在做PCR的时候会用到它。牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。醋酸纤维薄膜电泳：醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。特点： 1.（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 （3）灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2l血清，甚至加样体积少至0.1l，仅含5g蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出56条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。1、 实验目的 1.掌握电泳法分离血清蛋白质的原理； 2.掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法。2、 实验原理 1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 2.影响电泳迁移率的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.血清中各种蛋白质的等电点在pH4.07.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。 4.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面 5. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。三、实验材料及试剂 1、实验器材 1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm8cm5. 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、镊子等2、实验材料及试剂 材料：牛血清 1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6) 2.0.5% 氨基黑10B染色液 3.漂洗液 4.透明液：临用前配制 甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，。 乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml。 5.保存液：液体石蜡 6.定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）4、 实验步骤1、电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。2、醋酸纤维素薄膜的润湿 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体。3、点样把膜条铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条一端1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。此步是实验的关键。4、电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度电泳时间约为1h。电泳后，关闭电泳仪切断电源。5、染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5-10min。（染色液回收）6、漂洗： 将薄膜从染色液中取出,自来水下冲洗除去多余的染色液后放入盛有漂洗液的培养皿中漂洗，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。7、透明 将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。约2min3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。8、定量 （1）浸泡 将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下，分别置于相应的标有编号的试管内，然后各加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡。浸泡淡色带所加入的0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml，深色带为8ml（此时的稀释倍数是淡色带的2倍）。室温下的浸泡时间为30min60min。若在37水浴中浸泡，则为10min15min。浸泡期间振荡数次，使蛋白质区带浸出。另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氢氧化钠溶液中。 （2）比色 浸泡完毕，将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定。测定波长为620nm，光径为1cm。若浸出液有混浊或沉淀，则以4000r/min的转速离心10min20min除去，然后再取上清液进行比色测定 （3）计算 比色测定结束后，各组分的含量按下式计算： 某蛋白质组分百分含量某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和100 上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2，例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带，浸泡时所加入的0.4mol/L氢氧化钠的量是其它淡色带的2倍，所以应乘以2。 5、 数据记录及处理 1、实验数据蛋白质0清光吸收值00.0020.0080.0100.0262、 数据处理A总=0+0.002+0.008+0.010+0.026=0.046清蛋白=0.002/0.046=4.3蛋白=0.008/0.046=17.4蛋白=0.010/0.046=21.7蛋白=0.026/0.046=56.56 实验分析1、醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白的原理： 蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状的不同，在电场中的迁移速度不同，故可用电泳法将其分离。2、电泳注意事项： 电泳时需要注意电流和电压的控制，以及电泳时间。根据图谱分析可以估算血清中蛋白质的相对含量。图谱中颜色的深浅和面积大小可以反应血清蛋白质的含量，颜色较深者含量高，面积较大者含量高。由于电离时间等因素的影响，实验存在一定的误差。3、生物化学醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中，如果区带的分离效果不好，可能存在的影响因素： 1.电泳时间不足 2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长 3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足 4.点样时薄膜上是否存在多余的水分 4、用醋酸纤维薄膜法可以将血清蛋白质分为哪几个区带可分5条带，分别为：1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、白蛋白。可能分子量越小，带电量越高，运动速度越快。而这五种蛋白的分子量不同，带电量也不同，在电泳时的速度有快有慢。七、思考题 1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？血清变质：条带数会有偏差。巴比妥溶液PH不合适：影响电泳速率。漂洗次数过多或时间过长：看不清楚条带。点样没点好浓度不均或者条带模糊。 2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？ 点样没有点好，盖玻片要直直的压在薄膜上，否则血清不均匀，影响电泳条带形状；血清不宜过多，若过多则条带过宽，分离不完全；也不易过少，