植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析.doc

分子生物学实验报告 实验一 植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 g/mL，ssDNA 33 g/mL和ssRNA 40 g/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、试剂1. 2CTAB buffer【1】2. 70%乙醇【2】3. RNaseA (天根)【3】4. 0.5TBE缓冲液(工作浓度) 【4】5. 6loading buffer【5】6. 核酸染料(赛百盛)7. DNA marker DL 2000(Takara)8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】【实验步骤】 1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2. 加入0.6 mL 2CTAB提取液（用前加入0.2的巯基乙醇），混匀，65 水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀。4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。5. 将上清液(约400 L)转移到另一新的1.5 mL离心管中。6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 L)。7. 加入600 L无水乙醇，上下颠倒混匀，-80放置30 min。8. 4，15,800 rpm离心20 min，弃上清。9. 1 mL 70乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。10. 加入30 L无菌水(含20 g/mL RNase A)，37 溶解DNA 30 min。11. 取5 L DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：(1) 制备琼脂糖凝胶称取0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5 TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1琼脂糖凝胶液。(2) 胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 待琼脂糖凝胶液冷却到60 左右时，加入核酸染料1.5 L，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。 加入0.5 TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。(3) 加样在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1。用10 L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 (4) 电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：(1) 用0.1TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。(2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口。(3) 调零。先用0.1TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。(4) 吸70 L已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5-7 L的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 nm和280 nm处的光密度（OD值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA样品的浓度等。(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。(6) DNA纯度：以A260/ A280比值来反映。当A260 /A280比值2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。实验结果与分析1. 1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNAC组电泳结果如图所示1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA 5l样品，电泳结果如图所示有DNA条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组DNA。2.DNA样品的OD检测检测OD值C1：浓度:1061.7 ng/OD260/OD280：1.87表明：C1接种DNA质量良好。（如下图所示）C2：浓度:1017.6ng/ OD260/OD280：1.86表明:C2接种DNA质量良好。（如下图所示）C3：浓度:711.0ng/ OD260/OD280：1.86表明:C3接种DNA质量良好。（如下图所示）注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。实验二 PCR扩增目的片段【实验目的】通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。【实验原理】聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步： 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段； 退火，快速降低温度至50-60 后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段； 延伸，溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按53方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 L）、200 L PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。二、试剂1. 10 缓冲液2. DNA 模板 1 ng/L（以实验一 提取的拟南芥基因组DNA为模板）3. dNTP Mix (Takara)4引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液浓度：2 M 5. rTaq 酶 5 U/L6. 低熔点琼脂糖7. 去离子水或TE（pH7.6）【7】【实验步骤】 1在200 L PCR 管内配制20 L 反应体系：反应物 体积/LddH2O 11.3 10PCR 缓冲液 2.0dNTP 1.6（终浓度20200 M） 引物1 2.0（引物终浓度0.2 M）引物2 2.0（引物终浓度0.2 M）模板DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。3. PCR反应热循环程序设置： 94 预变性 3 min; 94 变性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 10min; 16 pause反应结束后短暂离心，置4 保存备用。4. 配制1的琼脂糖凝胶。5. 取5 L P