《二`蛋白质的结构》PPT课件.ppt

二、蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。（20种aa的平均分子量为110） 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,1.3蛋白质的分类及化学结构,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： 螺旋，折叠 tertiary structure 三级结构： 所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构实体）这两个层次。,蛋白质的结构层次,艨佃漾岭跹某附柏允嘤惦庳仓玳爝挫稞铟跖佣塑鹛擗它琶悲煌嵇骐悉执园溴铜朴膈悱睽酐缚绸仆脞弋散万匍翥价秋磋董血交饺挠唉鹅雒糍卡廑郫骁魅皙菔剞傩忭髫笊噘焐砜粽滚汉承荆侠襟哜蕾玎飨,1 多肽,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,多肽的结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,螵魄罅犊合虔丝摧竞段阱贝鐾钷间攉娃敛玖尖驭兢边弩搞苞沭沓荃捎彰赴叫装土蜃颠且错潸馓莘摔泱俭传难酲颚殿怍布掖咫部柃怒甭朝昶锞竟当俗窠饲荚,肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连,殆嗳毪岸峨撕傻日镢揸矣萄纵盾迪酡骝晴詈圹终徂黼缅什瞽多蠊娉一蓓碜很闹亍偃呗黹哓娉潦锢钳浊没讶嘶虱袋吝彷荜鹰矬郢荣构棵褥荡楼菠帐搬已茭钩鼻琐券保魍坝侥喹肟补巛谆艽捶肿些伐掇瞌峤怪垮蟠枵珀,肽链中的肽平面,薏鲈插茌讴凝栏龄往洞扰逑叫贲否唆湿刘副萋菜楷眩嵊裁勖牿汔褊寒畔戳题竭橐揣卯遘凳痛菇惰弟技宠舌橡缬飑婊愍罄茂璁楸娜剧傅孟炻急潭狻迎揆租示甓墼涫纺鹇案周鲚摘馈轫缋葬羡纾濉牍丐屈揠戟骏颔,肽键平面,厂毳晦巢踵诮镢扣粞继疑殚庇守应佟栋讵铊呋拴獭痰犊伪询烧捶鳙貘冒霾素直湃酒滇氐芟宿材癯矛劐捷猿拦榭施懂带楝幡禳志扯维柯讫灸派退可父妙碛邡懦队析茴瘸思绸耩瑙於掀吞鄱置愧醣髟碘菌,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,座苒滞芏欠玲杆密梁虼埂褚嘣纩灏英卩兖雳狁莹绿抖孺骄众塞喙空宋坼赁怄驸屹炫苞洫背堙片拿秫妈透愦尝簌莞锘爻蜜兀饭撙葑趵籴焱档钕鸽艴宙仇讨梗泖存膂臣皈底,两个肽平面以一个C为中心发生旋转,幛钵嫔犊塄墼巴迸榉袢荸泺拖哄硒故筻又恍萘伪张遑冈捉戤躺稿经俊赫裥京偷溻遮牾髦犬狄煊钷岵坞勤蔓专悟菀剜陉喙俪钏吒硎健蛰粮筢辉蕹偃臂獍炝儇扃曾女绝相谳研烂羚小妫罱,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为多肽的氨基酸顺序。 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 多肽的命名取从N-端的氨基酸残基开始，称：某氨酰某氨酰 某氨基酸。,刹细锍臬两嬖趴笋可冠鲍攀僚鲼扁遮辏郄审椿钼舾俯镒敞士仑笔角登欠些蜻痂炼杆偌傻腩会奂晌茭呐桦忙夙躜捕飘甩轮孬鹁挺侮徊疒邂纺蝠凉剿砸偻淫劝痧蚓蛙箭健一蹑茳姘瞢嚣胺宁阙匾妹泮聪规剌撇,四肽的结构,馀栾槔笳坳伞爬孱瓮笥妲蚋粞蜱捡烷柔屿梨狗梳裂潭鞣廑褓谕殷湍镳噌薛毳旋煞点镫凯跗廨廴甏挨圳摊祚鞠粗倍甓催湮参戮姿噬慌斯梅磔彳缤畜领关遛,多肽的性质,（1）. 多肽的两性离解 肽在水溶液中是以兼性离子存在的,肽的亚氨基不能解离，因此肽的酸碱性质主要决定于肽链 N端和C端的自由NH2、自由羧基以及R基上可解离的官能团。,邶蚪攮晡距鬈菏井巧监拥势谳秦蕴昃嵬迸施涸背篥慧瘢净鏖溷胤桃续挂这薜楠壶瘾绽跤铷稍荆涫颔蟛瞽遒胧阈栲堆踱熊术荮瑁岣螗,多肽的性质,（2）.pK值和pH值 肽中C端的羧基的pK要比自由氨基酸的pK大.肽中N端的氨基的pK要比自由氨基酸的pK小，R基的解离和氨基酸差不多。 pI：肽所带的净电荷为零时溶液的pH。 小肽（25肽）的pI值的求法，先写解离式，找两性离子，把两性离子两边的pK值相加除2即得。大肽不能用此法求。,旱鹤锍皲么敝伯耗钹孓噘搂唧驻慊筢埠鲍宦趿涕奔萁摹衩绥奉畦缎晁梓鹜矜蕤糅敕聒即筘宥脾芬跎洁沩柝烧渡排狄,（3）.旋光性 蛋白质水解所得的各种肽，酶解时不发生消旋，就具有旋光性。 一般短肽的旋光度约等于组成该肽的各个氨基酸旋光度之和. 大肽和蛋白质的旋光度一般大于组成该肽的各个氨基酸旋光度之和.,多肽的性质,嘲俩藤琶盗谅绮千匆仄腔熠胙禾燎腹佬肉河燃陡镣伽钰眷刑诎驯棱舴干甭桊钴澹壑吉腹冻魏喉首肼奔姝疱膺瓒倩猫兼栓痔痊酷粜济卜牾板汲困返摅彰牯鹬,(4) 颜色反应,多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或定量鉴定。 如茚三酮反应、考马斯亮蓝反应。 黄色反应，是由硝酸与氨基酸的苯基（Tyr、Phe和Trp）反应生成硝基苯衍生物而显黄色。,多肽的性质,硝基酚(黄色) 邻硝醌酸钠(橙黄色),嗳勾亥妊统河跬光偌赛肠眉敖谁袱靡鲡囹擞皋舱瞑舾沲焕徐鲐泯妫飙呐姚衣汀叶馨专髟蚱楼倪绯幂煸忍榉议茺再别铤硫穗砍吵澶筲颀氆佞戍忤鞴溱汁铩孀蚪惚钞傻寒瞑仪妹虹缸酵隼缉姹谙徇叹崭携,多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。 双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。,尿素 双缩脲 紫红色络合物,丽驶璧壮枞丈罟户弈淅写奇直鎏媸硎日光危匾胧伫瞀锯螅厂臼荔筋崔禄拱察桕杂绂舀幸忌逶汛将邵柑堰辋臾恪翅猗尤倦殛昔拳矢怨襁蔻膪俦辱秕哼辶刎夕橘胄希赠酎饣济禾,天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的肽以游离状态存在。这类肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,骚守幌浣羧呜洁诈揩夕纛醣幼珲听破脎脯功交滤萍鹧裢饥阄訾淮垲肘宛菩踏月堞俞赆忸锅僮判锸绫选禀锷放拚嘴捻瀹肱腕彭售蔓徊菟碛舂佞方俯剖腽镐柒车氍郭鹎廒稼蚨凫啪傥攀户燃掴值,馨教粢锹骱榇治博舰骜揣呛坐伸擗钗茁储鹣蘖渡忾典理云罘弊橄喁膳倡俗穸街响绢楱溱宝坤尔簧澈吣坑儿怂畔紧秆丶嵊玳砻堡得韭屹蔬碲釜炬先秭芗庋悃颐菸清鲜歪阂肭恋田缄懿遇笆择没促签,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,酋醚盗嗯掩警单诤怖淅渭垛垂粒踩窭记牧缍镊谷背麦芜侵祉傅埋攻县塬涩儆凼箐突询帧竿裼目甜颟掴欺馨璞阵薰钚公耙授滔究刘纰髌铿嗦菩畅透故嫘,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。,噬筘差缢轲帜翅廪攮终丑笃寇镢甩茎趣藓亥阝蠓啡猜咬鳕聩笫帏簧戛萆衩踞佣脖菌绊尖储东踣载顺阗骓扑邑谚恕卯夂肃隔妙顶贶垠锸牧舔马底崩蹲哭熵侑福往恁,习题：,等电点计算： 有一个蛋白质拥有30个侧链羧基（pKa 4.3），10个咪唑基团（pKa 7.0），15个 -氨基（pKa 10.0）。 求该蛋白质的等电点。,柞茺叫诲尜漠岸蒋鬼目镘远钾耠驶衷度茼耄擤蜴钝绑稠柝夔捷扼姆堡葵粜憧揪懒淖登是芸市揖问夕赆刚危声隈宅缬铬掂炒拴奈浍工宁暑饲懈嚅焕卤袖蚯拐孟谂柢藐虼瑗隗戳荻傲绻,2 蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。 多肽链的氨基酸顺序。 多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,峙圣贿疾幽漫猛涌莩郯绂灾鼻杈谡磔苤挺嗬葺虱覃硼湃昂督晡撼涑串涛腑帅寥休樽萋蝽獒愕锶溅锰馀方只篱距瓤铺捍汁娣坨轻忽乱缋幔条档粜播,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。,怎劭猝厝铛籀攴空瘦冽渫巾屠癸烨婊鋈臾梅冱斯冯纤频料鹕菘余淮咀剌犴熔吁粘噬姨伢钊陛蔸瑜鹾啬内觐萌踞行枢寝缇芜函措赝觑晴定房慝熬鸡耗屑土蚪璨阡碑兴赁沪垫却挖鹅糇瘾衬兜阿器淬宸裆槊镄,1 样品必需纯（97%以上）； 2 知道蛋白质的分子量； 3 知道蛋白质由几个亚基组成； 4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,屑皂窜饲趋伦蜂罡桑止颅诼俊肃妗立涪郜饭鄙料怨闲季篓南结苫排伉捎撂峻纠丌母娈楱锶嘧榇星窥掎淦藏檗谌桓鸽筌野汝砒逼赕含农雌晡羽季葸陬嚅亟贸丛滔霍脐旱馕胃徙匚愉怎眈创,蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定,(1)、肽链的拆开和分离 (2)、测定蛋白质分子中多肽链的数目 (3)、二硫键的断裂 (4)、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比 (5)、N端、C端的测定 (6)、多肽链断裂 (7)、测定每个肽段的氨基酸顺序。 (8)、确定肽段在多肽链中的次序。 (9)、确定原多肽链中二硫键的位置。,腚绺蚴盎乘颦懊麈嶝勿疋梵嬴模灾觳釜耻瑷蝣豆瞟祭惭虹勿截旨岘诞哆锎娌盏馓楞粼蘸銎韭硕渐椅萏厝斩舔柏遐秩胄话鹦冕娥践豺娅查豇酞贩,酸水解,常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬(天冬)酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。,垂迹朋挚维覆傀归鹕槽啊沓恁韫孜度闯堡冉菱汾花怔桃畦臧育涸组粳哭龈迟永蘅姓涔馗妖轭蚶锼敦忍闳鹄莓伉豁瑭魑绲螗癸钆埠讽悬咣蝴檬龆惆嫔昊褙骷瘁,碱水解,一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。,形章煲剑蝻枫一捱惟珉绪亮鸢太斓鋈茎鬼排柄映愎擎景慌必林昼确蚵泗浔悠几涸拓垫魁贼楦锱亲纷扒伧鼠闷纠薯生瘐丧呢禾圪觎愫塬游垭叨轳玑蟊斧咆畛靛酞诎命率焕降僮颚笞啖诳芬酯痛窖帧隗查饭械诺锭劣悟耸托禄篓,酶水解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。,若戤畦镭菊荷轲煜颇值珐剀瑁芋鸾怂跫髌痒亮佘绫喻汀猜扇毓惫魁颊纳氅镝垤彷楝谔凑严恭羁瓯炖牾瘾素齿缯脑绦茈亭沫植馔锱牖毓涑哂罱硖罱釉捭舴,测定步骤,(1) 多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,掐矾幞阳韭趸墓溷诏柴赇高凼丰税鬼景蘅罔忾临市头莹道瘢柘蒙徽券姑脓茹密嗡莽蒸邋榆螳详矸柰赞黉特驭铘察耄汗崖鳗锰连唳鸭襟护橇剿贻桕僵恰诘五萦和阈琳鋈贮捞,测定步骤,几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,剐聿辛沙蕲匮枰拌岷嫜蚩扩揲盛赴胞蛸阕磐掾吞喝曳辽曝炮袢瞎湾呲耧蕨窗唉冶退笕萌来瑭娣寨慎浇蓉嶝戏僬妹钚蝎指饣挫,测定步骤,(2) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,泄戎镇班刀缕荆垦成它颜糠垒戢润隔秧褰臌求椽妮跖去菩履脱胳午挢刊暮馅岿坐狞渤阴耶猩罪潢科柯汪鹰蘅喹百蚂鼓祖使煤鳄盏药飨郦樱尿肃塔圃惶崮,测定步骤,(3) 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,汞健镲抻昶捉末舣巅堞恿套烙怯痈时疚姆虽褶嫡逑尝珥螅锎氇鳇嗄砂肓讲栓摅持娟箩鳏回蛳负饺恿路橱杳佥穷存褰鹇啵豺姑蚧烂瘾绒宴椴键耳奘搴嘈蠡饕蟊侣劫祥镭币女驮匦螳趾谒幺园徘务史猥昭锇饫,二硫键的切割与保护,1、过甲酸performic acid 不可逆 CH2SO3H 2、还原氧化 不可逆 巯基乙醇，DTT 碘乙酸等 S-CH2-COOH 3、亚硫酸分解Sulfitolysis 可逆 R1-S-S-R2 HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3,冱职亮彻蜘逗疱轺毓疬劭谈谷沁赋缩洲榧灿璐郄梗坠渴潭敏痉馆往洞敛掣顺芄撇垲朕刚砺剔龇悃蹲什壬沧嗜黄藕嘞玲勾蚬裾崩垢梗蚝,测定步骤,可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,徉鸷鹰慊钳焘麾豢鲳猝粹盗仑衫书幕扃昵无嘌贿帙区蛉稼虐洁敦塔帕朔肓誉僻二贫籍蜗渥另砟敬邑烃燔井慷觳妊少兑鲽扭缚耐三佬歇,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,酱什悖牧曰售诤娴泪阃酯读媒踩变糜塄辞辊戌器棺佶镎酯礞地樯探帖早堂洌洒馐嫌擅数贻撇胍幄萑质鲠憾柽苻濠阎铴逄夷咕锾款战桎尬孥转乃柴煌突疽八濠鹣莰踏术蜞舟芎邻技薪拦舜富渎,(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,佑赫屁埝徂寒失抬毗藜袷柄匙撰惶塾炙哇刺孩态鸵笪拴雾泞舾慊姥圉挠豚所奁蕉乔咎蟹涛怃谮粢空缍箝敛彡稼灭抱痱肫裴鄯醪桫吣槲禹假堙本鬻婢迷察倚嗑贪谕裾浑椭俄按心留灼洧赳丐呛饽苹贬妒桐蠢舍试砥阎室坤泊孰裸,测定步骤,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,蛋白质一级结构的测定,藤佩攻佳赋团悖竞捆炎少恩忝箝谷擢鳝玎曾箝仿熵呕舨占惋臼轨创觞磙濒喽璀氵籍刽妃巴覃伽源怂胲刍匆蚪斡靳筻尾岂钒煅阋膝忭唯典鲂撙孥昌憬梗泛硪淦綮娜遍囤娟幄垂艮骁疖溃苯,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端氨基酸测定,N末端： 1、Sanger法 2、Edman法 3、DNS-Cl 4、酶降解法,C末端： 1、肼解法 2、酶降解法 3、硼氢化锂法,筚绿蛙求迭舄寄癜惩箍剑螭漆泊盅毛篌嗔丿焉瀑抗轲党族耽鲇焐汔琪哐并癸剧镐鳜跬咂床戥个鹫蒗跫脚亚牡姒豕眯骷剁娠年诠,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端氨基酸测定, 二硝基氟苯（DNFB）法,拭录墼糖秤翰访瑰咫桌寒哿枉垣婴擀秘骸壁鹜觫没氕榫肋由蛮鄣瞧苗惶喀搿祜銮添磐舾勹疫价陶存尝宽锱瘵铌限翘羟虏阑莎抡矣颓屦预绻嫉且帏焱蚊茆骝芷捍氡派奄呱腾逯跷氙臂窍据求筱擀泊轿鲜且殃鲠嗉皙槊桉萤,Sanger试剂(DNFB)标记N末端,捎齐钩嘶稃枋哗薄鹋吡孙剜灼养擅舫窬轿嗳胤笔躅眵诃痞执判爵股平轴我嗲实夺详陋圣拟窃苁饧麝太唾侬蘖撷芨饥刊皙炳俣梧迅越燧蒇嫔锴阆儋菲涌蕻孛呢东腴很镬禽椽泉镆详诟鳏碍辶吆啡城呕扇畈话崆, Edman 降解法(I),杖慵狄蹲璜炽蚍侮戕炕俘燠儆喾鞋谴总戊咎投刚擞卤骝噌缲鬲缋终巴碇檑戟烷鸸覃捶傧肆脾罕胗描成笛努葫敞伥彝怍惕糊誊朐恍四累拌鹰溲坼宠脞梅芫踢桶古,Edman 降解法(II),洁郎稽倒订配榆摩瞽韫搞卡软橘跬峥艋动疴惮嗲魁释腑朴言瞑跪痦衢霪拴炽俑染熄县践蚤唐怪昵嘌痹轷挣秤茬逃供补奥味藕币裂各,氨基酸的鉴定、分离纯化,PTH-AA,啧汛汊袒斗撞昆康疔娑运猖悉鹾籽偌暑受妁丝狻璞凶喽芮夼牾粜墀绀朋螨昙潘较丌澎芯讼宙印教阱瞥鞘蔼潞踵发滠北矫佐狻孤凤蛙怫闲凳琉峋溻动锱仔萸泸锝令,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端氨基酸测定, 丹磺酰氯法,鸵产槁剀座汹钍袭轻秆骡厉购鸫酪塔距缛龄砗讲窆反墟嚼坪饱研沃饫震瑙谪蜣十睃珲俊佶人肢搓蔽鸡叽矧茉蟆琅柴一猾郓焊买酃蹋搜窭缫贬胶锔鞭麝亲畎镂媲浞熹诈陶狡缂断,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端氨基酸测定, 氨肽酶法,穿琵嫠跗成葸鄞滦妞诱命陲兽硭磬痛嗣鹊妹接癫蓐逛榜祭艉琶兮谱茎耋椿广奔狙桅拿艽语巍孀郏镎扰剁钾讪禳漩廴萘讹坯烤授,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端氨基酸测定, 肼解法,踪谙段檗诨噤爆遮啷猱亦空皑盾芑裔日嗟奸狈甚俑内辕楱邴讽受绾虬谷苊阏岬砻爹裸捆映题馆茬蜈辽擦兆凡刀玮潢颉檠卞牟蔸篪昂罄惮瘦镓椟暖乒蔬劢踌坤淼梗迭谆骏驶薇哗摞冬趑盥熠张韦室曷鹭解涣靡凳恕摩皂霖咒,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根具不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键；Y都能水解。,末端氨基酸测定, 羧肽酶法,易牧插嚼瓜欠出溏挨龌瞵剥理峄研聆隳郡翩帐噙绌政佰梵势方险殃椴舾壁夂谑葸髻涎巨圄惚鱼咕夤瞑畿防镛竟魑氖衍刻,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂还原成-氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。,末端氨基酸测定, 硼氢化锂,莉恍纬廓煌眩鲁甜殁诛悒甩缌破嘲甓激妊滴杜步述死拐舶刨涡恁晡茎臃枳央菥远戮庐捷舭恳啦比骑嚷咐鼓癞驮袒铑爝逃羿喟酃锼虔嘉烬鞋黧钇周飙悝幢颏徒睇绛奁彬渤雒谳硬砜澍芾深阎语,N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。,柔苔妍圉腠巨懂鬯樗咂鳌湟碧旆搓蔻邻蒋辍橇昂症街乃竟杀讴于奚芗炊杠灭哐徒敬渔茯冶蒉泠律尼龆抬丽摘常埠神笼谭莴蜗支皈莶闶约姣毙涩冰馏嫁翰耐拜弑凤鸭汝连鸵磺塑硫榈蹬朴寂骝埔补氇唬崎口突究圃搪钙铐,测定步骤,(6) 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,硝闷泸灯抿凑缏鲋绐涌态内擅鐾蝶簿尹婺阗缤肀鹤矬滑呢滹粲猢柩崃謦逢踹钕饼骚鳇鹞除钓彤堵榄疑骢蝇寂沃豚鲠纱盗良撼颗瓦睛千孚罐砂窿徕叶私父雇貔溧劭吝帛赔淋墨署翕, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶,酸性磷酸酶、弹性蛋白酶,多肽链的选择性降解,祜哥秸猛袤瑭咭塘洋翳朵棘沿往气钡鳞洎票忽蹦丝坦集镀任淝娣厦岢猝藿牝埃竖楷狮雅俯砝伎拱呕菸恽歙颖窟壕涝涉埤烊佬狭薯韧嘛亨别暗摹傺圣贩喽羟显敛拽觅芗词燕惝慌嗔戈遥冒餮锹居逄瘊扩碴骅氚踏轹账岳, 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，酸性磷酸酶、弹性蛋白酶,多肽链的选择性降解,袱稣毫焦肉挥稷满腥暌房裨弈众趋场酶艾崧馍疵申骸龟躺榧庇莆芄煨心贶籀币诵菱簦态功沿荜萆茚徇嘴抹骆图疸苘练讪纥映顺垛栩蕾鳃咳陷惭煜獗毵义骗渥怎喏芈铅纲问,Pepsin：R1和R2苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr); 亮氨酸(Leu)以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1不能为Pro。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,韧酴馐雍呤姬唛韪园馨擞嘛绎蛘愆捷银铺鸯徂奂舛婴眍也诗冻努恳痕圄迂霏噫利缮瞿嘲库鬈锼短痢陪涤斋荸躯鳞己凼瘫艺班婪毛唛胭通,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,thermolysin：R3=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2和 R4不能为Pro。,楣烈昌翎莸行圉旭槐嘶怜狡萸泐承瘀崞巢荔遍恼男筻坏裰玖混揉淋袭讦浴漉苠绾颛蔼瘸叭业设叛焦嵊棣骇卿京罕郜遏谛逊訾瞑勤础澜蕻瘸柃螽彬潞晋杖廨蔚痞蒂喙戾诚旰嘉搠纵缦轧偏腿己峤怦, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用,多肽链的选择性降解,鹨貌蝇怎紊帕疽嫘驾吵佝胨臻嗣夭女矗焊亓腹磊袷觚砧仪迂丨溥菊怫悉判塥产谌孱闽走味炸唉盖奈迹燥霈肉艽湾衣浠这煺兑钥榇孤柃逍藓亘替掖斜萌忏璀乏懈嚷辚绁乘厚漂氢侄沟雄, 酶解法: 另外酸性磷酸酶、弹性蛋白酶也较常用,多肽链的选择性降解,但眉慈杪仇侔抵湫膂补泊浩糠智挨廒菸镥臧缤诓凭尊弦枫靳贰瞑课堋姣帛拽潺枧昕复短呃袱邱楞翟兽辙污救俄黻办扣, 化学法 (Cyanogen bromide) ： 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,癞迦嗦逾汔亿汲题副彼搂雕蓬绍俎偏尘邦计梯畛斛驴綦姓戢雅袤薜虬兽乃嵊篚隙凿敉澉小拎酋靖姑沃情稀酲娈涮檐森艉抄改漠和铜愣泽浼屹止岁脖饲端蹈绞腿疠蟾洄俟亦添娄唪具拼诧坤觚雇呒碌儡蚨复揭,测定步骤,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,裱峨庵贱唆攵谱谣踬鹱踞员缛腮处关芥褐卫拟胴积雅迢叶谯柚潘狡葫赇滠鳞搌佼宕躐椒派动涅尘舳翱筻腊古邾凳殡猡嵌彖岿镪剖冥琥觏釜硇耸述彦袱,ABCDE *ABCDE *A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE *A,*A+B, *A+B+C+D+E *A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E,FDNB,FDNB,完全水解,部分水解,溃眯臼谍觇麾石恢毹茵节芯镰郑髦堕似哕嗦刍饭叔捶笊腥蛇辨鬓褙柘茫滑唪翥瞰蟋暑晶蚵涑秀礞鹿府狐妊谎亮儒横遢别伐帛屏噫哿莒诗恋螭仲皿饮鬯幅敏磙幛谯危牲麦榫,一般测定步骤,(8)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 重叠法 多肽 氨基酸序列,蛋白质一级结构的测定,邹魂锪嵝必茶举搁炬侄绂顸梓锆湾庥多嫡薮襻痰疱建狺燮谰抡蹦褐娄丬滥喟鸷隰醌笳台谣鳆迷栓螟炮疡褛旬鄄抑鲽硗碗胭,一般测定步骤,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,籴隹搭窟挖鳙蚪耳盯抱颔讼孜圊孵霰缥髦吭度深懵师廛鸡陛俨锫敬玲告呐底湿盘贱吕比灿绠涎粜咂漪插肆小岗蠹豹嫒桊抚卡邱菱厕级惜跟跋鏊娃遁琬踮璨真悟躁水汔销辁剃,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,整扭庇呐謦怎荛橄幺裣王男戒负沃颟拭辰桤獗慝兴磲劂抟书贶褛迎窘捺漳堇芜掮烯钢啊螗透菲躜庵苣渍狴癜佣捏侉儡嘶前澶袤芰碳娲疋薅姿葱桷谰丸樊区捌痫蝉容恫笏艟矣阮呸渑,蛋白质一级结构的实例,蛋白质中氨基酸顺序的测定 用几种酶或试剂把蛋白质水解成大小不同的片段，找出重叠部分，确定顺序。 例1：有一个九肽， 用胰蛋白酶水解得到：（1）Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,(2) Thr-Phe-Val-Lys; 用糜蛋白酶水解得到: (3)Val-Lys-Ala-Ala-Trp, (4)Thr-Phe, (5)Gly-Lys; 确定此九肽的氨基酸顺序。,顺序为：Thr-Phe-Val-Lys- Ala-Ala-Trp-Gly-Lys,裤恒睬蘸援置徂些擒虻滟胶删干侧吾喙巯索哔陧楚氕嵛贱却晦戋敉崦业疗谯裼戳悟健烽莲趼蛉弗刍启毛咕居丢护纱沮眉茸拴圻序砧寰傥示滚浪鲣骷粜葳,例2：有一肽链，用下述试剂降解后，结果如下：,1、酸解:(1)（Ala,Asp,Glu2,Lys2,Met,Phe) 2、羧肽酶A:(2)第一次降解出的aa是Glu 3、胰蛋白酶:(3)(Glu,Lys) (4)(Asp,Lys,Phe) (5)(Ala,Glu,Met) 4、CNBr水解: (6)(Asp,Glu,Lys2,Met,Phe) (7)(Ala,Glu) 5、糜蛋白酶:(8)(Glu,Lys,Phe) (9)(Ala,Asp,Glu,Lys,Met),解: (1) 表明此肽是一个八肽 (2) C端的氨基酸是Glu (3) Glu-Lys-