《体内药物分析》PPT课件.ppt

第五章 体内药物分析,体内药物分析是指体内样品中药物、代谢物、内源性物质的定量分析。,其中血样是体内药物分析的主要样品 体内药物分析是测定以上样品中： 1. 原型药物 2. 代谢产物 3. 内源性活性物质 4. 结合物（缀合物） 5. 结合药物,体内药物分析,体内样品：生物体液、头发、脏器和组织。,体内药物分析经常用于： 1. 药代动力学研究（PK） C-t曲线 2. 代谢组学研究 3. 临床治疗药物检测（TDM） 4. 新药研究中药理、药效、毒性试验（临床前试验研究）,对体内样品（生物样品）进行检验,研究生物体内药物浓度、存在状态、生物利用度.,涉及到药物体内作用机制探讨、药物质量、安全性、有效性评价及临床合理用药。,体内样品性质特点： 1. 采样量少 数ml 数十 l 2. 待测浓度低 10-9 10-6 g/ml,甚至10-12 g/ml 3. 干扰物之多 内源性物质,体内药物分析的特点： 1. 样品需经分离和浓集或化学衍生化 2. 要求分析方法灵敏度高、专属性强 3. 分析工作量大，结果数据处理繁杂,主要常用测定方法：色谱法、免疫学法、生物学法,如：GC、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、 LC-TOF-MS,建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行体内样品分析的基础，为保证方法的可行性、可靠性，建立的分析方法在用于实际样品分析前，必须进行充分地方法学验证,生物样本：生物体的任何脏器组织、体液均可作为生物样本. 常用样本:血液（血浆、血清或全血）、尿液、唾液、毛发,一.体内样品种类,第一节 常用体内样品的制备与贮藏,二、体内样品的采集和制备 （一）血样 适用药物药动学研究、生物利用度、治疗药物检测等研究与实际工作。,血药浓度通常指血浆、血清中的浓度。其中的血药浓度能够反映药物在体内（靶器官）的状况。是体内药物分析最常用的样本,1.血样采集,动物(采血不得超过总量的1/10） 人：静脉采血1-5ml,2.血浆的制备：将采取的全血置含有抗凝剂（肝素）的试管中，混匀1000g离心力5-10min，使血细胞分离，分取上清液为血浆,3.血清的制备：采血后在室温下至少放置30min-1h，凝结出血饼，剥去血饼， 1000g离心力离心5-10min，分取上清液为血清。,血浆和血清中药物浓度值通常是相同的，血浆比血清分离快，且制取量多（全血的50%60%）,4.全血的制备：加抗凝剂采血不离心，放置室温后可分层，上层血浆下层血细胞。 测定血细胞内、外药物浓度，血浆药物浓度波动大、浓度低时应考虑用全血。,贮藏,采血后及时分离。 短期保存：4 长期保存： -20或-70-80 全血未经分离不宜冷冻,适用药物剂量回收、肾清除率和生物利用度测定、药代动力学研究等.,体内药物的清除主要通过尿液的排出。药物可以原型或代谢产物及缀合物等形式排出。,(二) 尿液,尿液中药物浓度高，收集量大、方便。但尿液浓度通常变化较大。,采样后应立即测定。否则应加入防腐剂或冷藏,尿液中药物浓度与血药浓度相关性差；不宜采样的人群：肾功能不良者、儿童,(三) 唾液,唾液pH值在6.2-7.4；含有粘蛋白约为血浆的1/10、电解质含量同细胞外液，粘度是水的1.9倍。 采样后经放置后除去泡沫后， 以3000r/min离心10min分离，分取上清液作为药物浓度测定的样品。,唾液作为样品测定药物浓度优点：采样容易；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。但与血浆药物浓度相比易变动；浓度低需高灵敏度监测仪器。,一些药物的唾液浓度S与血浆浓度P呈密切相关，因此在TDM中测S替代 P。,(四) 组织 常用的脏器组织：胃、肝、肾、心、脑等 1. 样品的制备 先制成匀浆液萃取药物 2.样品处理 沉淀蛋白法 酸水解或碱水解法 酶水解法,(五) 毛发（头发）,适用：微量元素测定 方法：有机破坏法 湿法破坏 干法破坏 氧瓶燃烧法,测定方法为原子吸收分光光度法和电感耦合等离子体发射光谱法。,第二节、体内样品分析的前处理技术,1. 使药物游离，使蛋白结合型的药物中释出来测定,2. 满足测定方法的要求 分离与浓集,3. 改善分析环境 保护仪器性能，如HPLC色谱柱,方法：（1）去蛋白质 （2）分离、纯化、浓集 （3）缀合物水解 （4）化学衍生化,一、体内样品预处理的目的,二、常用体内样品处理方法,一般在测定前预处理:分离、浓集或改性,（一）蛋白质的去除, 溶剂沉淀法 加入与水混溶的有机溶剂（1:23） 溶液D 、蛋白质分子间静电引力 而聚集；与蛋白质氢键变化而凝聚；亲水性溶剂的水和作用使蛋白质脱水而析出，使药物释放。 常用溶剂乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等离心分离，高速离心机（ 15000g ，5min） 上清液偏碱（pH8.5 9.5）, 中性盐析法 加入中性盐（1:2混合） “盐析”沉淀蛋白质，使蛋白质脱水而沉淀；离子强度发生变化使蛋白质分子间电排斥作用减弱而凝集。 常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 高速离心机离心约2min分离 上清液近中性pH7.0 7.7, 加入强酸（1:0.6混合） 与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀常用的强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等。（高速离心机离心约2min ）上清液近呈酸性pH 0 4。不适宜在酸性中分解的药物。, 热凝固法 要求药物热稳定好，通常加热至90 ，使热变性蛋白沉淀，高速离心或过滤法除去。 方法最简单，只能除去热变性蛋白。,（二）分离纯化与浓集,液相萃取法（LLE) 新方法新技术： 固相萃取（SPE) 超滤法,一般浓集方法： 使被测组分提取体积小 挥去提取溶剂（使用尖锥形试管）残渣复溶于小体积 通入氮气（氮吹仪）；减压挥干溶剂,1.液-液萃取法（LLE）,对有机溶剂的要求:对药物分子未电离的可溶、电离的不溶 沸点低易挥发与水不相溶无毒、不乳化。较高稳定性、惰性不影响紫外检测 常用：乙醚、三氯甲烷、异丙醇,多数药物：弱极性、亲脂性强。多为碱性 内源性杂质：强极性、水溶性强。酸性 根据溶剂、药物、内源性杂质的极性、酸碱性，选择合适的溶剂分离杂质、纯化样品。,注意的问题,pH值影响：多数药物是亲脂性的碱性物质。内源性杂质多为酸性，故在碱性条件（pH高于pKa12 pH单位)下乙醚提取 ；酸性药物则在酸性条件 （pH低于pKa12 pH单位)下提取，可使90%的药物以非电离形式存在。但一般多在碱性条件下提取，减少内源性物质干扰。,有机相与水相样品溶剂比（1:12）,一般只提一次。若杂质不易除去，可将有机相再用碱水（酸性药物）或酸水（碱性药物）反提。再用有机溶剂提取。,对碱性中不稳定的药物或中性药物，在中性pH处用三氯甲烷和异丙醇提取。,选择性和低廉的运行成本（有机溶剂选择性高，本法的选择性亦高） 可对样品净化和浓集（能与多数内源性杂质分离） 易乳化,LLE法的特点：,2. 固相萃取（SPE）规模缩小的柱色谱,将具有吸附、分配、交换性质的担体作为萃取剂填入小柱制成,体内样品处理。,微型柱的使用：溶剂淋洗 生物样品上柱 （药物及内源性物质同时被保留到固定相上）,洗脱杂质 洗脱药物,（1）固相萃取法的原理,常用于SPE填充柱填料大致分为两类： 第一类为亲脂型：大型吸附树脂、亲脂性键合硅胶,第二类为亲水性型：硅胶、硅藻土、棉纤维。,第三类为离子交换型,例如：Bond Elut微型柱极性、非极性硅胶 Sep-pak系列微型柱C18等填料,微型柱使用的一般步骤： 步骤：用有机溶剂如甲醇，预先湿润微型柱，使增加填料与待测物相互作用的表面积，并可除去可能干扰分析的填料残留物。 步骤：用色谱纯的水或合适的溶剂冲洗，除去过多的甲醇，并为样品提供表面积。 步骤：进样，通过微型柱废液弃去。 步骤：用水或合适溶剂洗柱，选择性地除去将会干扰后面色谱分析的内源性杂质 步骤5:用合适的溶剂洗脱样品，收集，洗脱液用于后面的分析测定或进一步研究。,SPE优点： （与LLE相比） 引入杂质少；消除乳化现象；提取效率高；样品用量小(50 100 l)；处理样品快速；适宜处理挥发性及不稳定性的药品；溶剂安全。,3.超滤法 以多孔半透膜（超滤膜）为分离介质的一种膜分离技术。 血清中的游离药物测定可采用分子量截留值在5万左右的超滤膜，以加压过滤或高速离心法将游离药物和血浆蛋白分离。 简便快捷，结果稳定可靠，已成为首选方法。 优点：不引入化学试剂、无相态变化、对待测药物破坏小。,（三）缀合物的水解,尿中药物多数呈缀合状态. 含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸 葡萄糖醛酸甙缀合物。 含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸 缀 硫酸酯缀合物。 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为测定尿液中药物总量,需将缀合物中药物释出.,1. 酸水解 HCl 2. 酶水解 葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶 3. 溶剂解法, 使药物变成具有被分离的性质 提高检测灵敏度 增强药物的稳定性 提高对光学异构体分离能力,（四）化学衍生化,含有活泼H如： COOH、 OH、 NH2、 NH、SH等官能团,化学衍生化对GC和HPLC尤为重要。,.中化学衍生化法 衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而使的温度不必很高即可适合的分析要求。 主要的衍生化反应有硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化等。其中以硅烷化用得最广泛。,具有光学异构体的药物。具有不同的药效和药动学特性，因此，异构体的分离也是十分重要的。采用不对称试剂，使其生成非对映异构体衍生物，然后用GC法或HPLC法进行分析测定。,当采用HPLC法时，其衍生化的目的是为了提高药物的检测灵敏度。一些在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的药物，可以使其与衍生成对可见紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物。,按衍生化反应的方式可分为： 色谱柱柱前衍生和柱后衍生两种,.中化学衍生化法,柱后衍生化： 药物经色谱柱分离之后进行的，可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物，从而提高了选择性。常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。,柱前衍生化： 分离前使药物与衍生化试剂反应，故与药物具有相同官能团的杂质也会同样生成衍生，这样就有可能妨碍药物的检测。同时，如果杂质含量多时，药物与衍生化试剂的反应率降低，因此应尽可能将药物进行精制后再衍生化,柱后衍生的例子： 氨基酸分析仪，氨基酸分别从色谱柱分离流出后，与显色剂茚三酮相遇，在一定条件下，发生显色反应，生成有色的衍生物，在440nm和570nm处被检测。,衍生化方法： 1.紫外衍生化 在紫外无吸收或吸收系数很小的化合物与具有紫外吸收基团的衍生化试剂反应 2.荧光衍生化 在紫外无吸收或检测不灵敏的药物与荧光试剂反应成强荧光衍生物 3.手性衍生化 用手性衍生化试剂将药物手性异构体变为非对映异构体，用常规HPLC分离分析,第三节、体内样品分析方法与方法验证,一、分析方法的建立 （一）分析方法的选择 1.色谱分析法 LC-TOF-MS 2.免疫分析法 3.生物学方法 （二）分析方法建立的一般程序 1.色谱条件的筛选 2.色谱条件的优化 3.实际样品的测试,1.色谱条件的筛选 取样：待测药物、代谢物、内标物（内标法）等的对照品 测定：按拟定方法（不包括体内样品预处理）测定 调整色谱条件：色谱柱、流动相、温度、进样量、浓度 满足：良好的色谱参数（n、R、T）；适当的Rt以避开干扰：选择检测器的灵敏度以获得方法的灵敏度（LOQ）,2.色谱条件的优化 （1）试剂与溶剂试验：取待测药物的非生物介质溶液，按拟定的方法进行衍生化反应、萃取分离等预处理。通过改变条件（衍生化、萃取条件、溶剂极性和配比等） 考察反应试剂对测定的干扰（无衍生化、萃取则不作该考察） （2）生物介质试验：取空白生物介质按预处理方法操作。考察生物介质中内源性物质的干扰。在“信号窗”内不应出现内源性物质信号。,（3）质控样品试验（quality control，QC试验） 取空白生物介质，按实际体内预期浓度范围，加入待测药物的标准物制成标准样品和质控（QC）样品，照生物介质试验项下方法试验。 完成以下各项验证及评价： 建立标准曲线；定量范围；准确度；精密度；灵敏度；提取回收率；样品稳定性 色谱峰的n、R、T是否与水溶液一致；色谱峰是否为单一成分；标准曲线的截距是否显著偏离零点等，以说明内源性物质是否干扰。,3.实际样品的测试：方法建立后，需对实际样品进行测试，考察实际干扰情况，进一步验证方法的可行性。,二、分析方法的验证 （一）特异性 （二）标准曲线与定量范围 （三）定量下线（ LLOQ ） （四）准确度与精密度 （五）样品稳定性 （六）提取回收率 （十一）名词解释,（六）提取回收率 指从生物介质中回收得到待测物响应值与标准物质产生的响应值的比值（%）。 用来评价样品处理方法将体内样品中待测物从生物介质中提取出来的能力。,取空白生物介质加入标准溶液，制备高、中、低三个浓度（各5份）的QC样品，依拟定的方法操作测定，测得Ar 。,测定法：,另取空白生物介质