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第十四章 维生素类药物的分析,概 述,维生素维持正常生理功能所必需的、微量营养物质,人体不能合成维生素。必须从外界食物中摄取。,维生素的发现是20世纪的伟大发现之一。1897年,C.艾克曼在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病,未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取,当时称这种物质为“水溶性B”。,Christiaan Eijkman 1929 诺贝尔生物医学奖,The Discovery of Vitamin,发现简史,必需维生素 13种,维生素A,维生素B,维生素C,维生素D,维生素E,维生素K,维生素H(生物素),维生素P,维生素PP,维生素M,维生素T,维生素U,水溶性维生素。,分类,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,维生素A的简介,是鱼类肝脏中提取的一种不饱和脂肪醇,又称鱼肝油。目前主要采用人工合成。,在体内以视黄醇的形式储存,缺乏会影响视色素的合成,导致夜盲症,视力减退。,第一节 维生素A的分析,全反式,第一节 维生素A的分析,结构,共轭多烯醇侧链的环己烯,黄色棱形,62-64 ,淡黄色棱形,57-58,无定型,28-29,去氢维生素 VitA2,去水维生素 VitA3,易发生脱氢、脱水、聚合反应,第一节 维生素A的分析,溶解性:与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合,在乙醇中微溶,在水中不溶。 不稳定性:含有多个不饱和键,性质不稳定,易被空气中氧或氧化剂氧化,易被紫外光裂解,特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。,第一节 维生素A的分析,性质,紫外吸收:共轭多烯醇侧链结构,在325-328nm之间有最大吸收,可用于鉴别。,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,天然维生素A主要是反式,CHCl3,可用于鉴别和含量测定,与三氯化锑呈色:三氯甲烷+三氯化锑=不稳定的蓝色,与三氯化锑呈色反应,第一节 维生素A的分析,鉴别实验,(一)Carr-Price反应,蓝色,紫红,第一节 维生素A的分析,条件: 无水、无醇,SbCl3,水,SbOCl,乙醇可使碳正离子的正电荷消失,第一节 维生素A的分析,要求仪器和试剂必须干燥无水, 三氯甲烷必须无醇,第一节 维生素A的分析,max为326nm 一个吸收峰,max为350390nm 三个吸收峰,五个共轭双键,六个共轭双键,最大吸收峰红移,(二)UV法,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,维生素A在无水乙醇溶液中溶解,立即进行UV扫描,在360nm处有一最大吸收峰. 当盐酸水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰,USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值,BP 对照品法 显色剂 三氯化锑,(三)TLC法,第一节 维生素A的分析,展开剂: 环己烷-乙醚(80:20),均显蓝色斑点,维生素醇( Rf= 0.1) 维生素醋酸酯( Rf= 0.45) 维生素棕榈酸酯( Rf= 0.7),酸值,取乙醇与乙醚各15ml,置锥形瓶中,加酚酞指示剂5滴,滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)至显粉红色,再加本品2.0g,振摇使溶解,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定,酸值应不大于2.0(附录VIIH),杂质检查,过氧化值,取本品1.0g,加冰醋酸-三氯甲烷(6:4)30ml,振摇使溶解,加碘化钾的饱和溶液1ml,振摇1分钟,加水100ml与淀粉指示液1ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定至紫蓝色消失,并将滴定的结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)不得过1.5ml。,杂质检查,第一节 维生素A的分析,含量测定,(一)UV法(三点校正法),第一节 维生素A的分析,维生素A在325328nm的波长范围内有最大吸收,可用紫外法进行含量测定但维生素A原料常混有杂质如:,第一节 维生素A的分析,维生素A的氧化产物,第一节 维生素A的分析,维生素A在光照下产生的无活性的聚合物,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,测定对象:VitA醋酸酯时,ChP2015规定,第一法 等波长差法,第一节 维生素A的分析,第二法 等吸收比法,测定对象: VitA醇时,ChP2015规定,第一节 维生素A的分析,合成的或天然的维生素A 均为酯式维生素A,根据供试品中干扰杂质的多少,可采用: (1)直接测定法 (2)皂化法,第一节 维生素A的分析,求,求效价,(1)基本步骤,4. 测定方法,A选择,A328测定或A328校正,求标示百分含量,(1)第一法(直接测定法,适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定) 1)方法 取样品适量,精密称定,加环己烷溶解 在300、316、328、340、360nm测吸收度,以确定最大吸收波长( A328或A328校正)。,第一节 维生素A的分析,b.判断法 最大吸收波长在326-329nm之间,且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时,可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。,a.计算吸收度比值(Ai/A328):与中国药典的吸收度比值相比较,判断每个差值的绝对值是否超过0.02。,第一节 维生素A的分析,最大吸收波长在326-329nm之间,计算5个波长下的绝对差值,如果有一个或几个超过0.02,应按以下的方法进行判断:,A328校正=3.52(2 A328 A316-A340),第一节 维生素A的分析,(1)第一法(直接测定法,适用于纯度高的维生素A醋酸酯的测定) 1)方法 取样品适量,精密称定,加环己烷溶解 在300、316、328、340、 360nm测吸收度, 确定A 2)计算 a.吸光系数E1%1cm,第一节 维生素A的分析,b.求效价(IU/g):效价指每g供试品所含维生素的A的国际单位数。,第一节 维生素A的分析,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯,IU/g=,第一节 维生素A的分析,每克纯品相当多少个单位(IU)?,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,c.求维生素A占标示量的百分含量,AA328或A328校正 D供试品的稀释倍数 换算因子维生素A醋酸酯在环己烷中1900; 维生素A醇在异丙醇中1830 W为平均内容物重量;W为称取内容物重量(供试品取用量) L 比色池厚度 标示量为处方中规定的每粒中所含的国际单位数,第一节 维生素A的分析,VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下(平均装量0.08262g/丸)的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀;精密量取2.0ml,置另一20 ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀。以环己烷为空白,测定最大吸收波长为328nm,并在下列波长处测得吸收度为,第一节 维生素A的分析,A300 :0.354 A316 :0.561 A328 :0.628 A340 :0.523 A360 :0.216,A300 /A328 :0.555 A316/A328 :0.907 A328/A328 :1.000 A340/A328 :0.811 A360/A328 :0.299,求本品中维生素A的含量?,第一节 维生素A的分析,A300 /A328 :0.564 A316/A328 :0.893 A328/A328 :1.000 A340/A328 :0.833 A360/A328 :0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.01 0 + 0.02 + 0.04, ,= = = = =,第一节 维生素A的分析,第一节 维生素A的分析,适用于维生素A醇,(等吸收比法),第一法无法消除杂质干扰时用此法, 皂化法、6/7A法 ,(2)第二法,第一节 维生素A的分析,水溶性,脂溶性,第一节 维生素A的分析,判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,第一节 维生素A的分析,判断 A300 /A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,f,第一节 维生素A的分析,高效液相色谱法,流动相:正己烷异丙醇(9973) 检测波长:325nm 系统适用性实验考察分离度 是否能将维生素A醋酸酯顺式和反式分开,第一节 维生素A的分析,三氯化锑比色法,max 618nm620nm,标准曲线法,第一节 维生素A的分析,优点: 简便 快速,第一节 维生素A的分析,小结,维生素A共轭多烯醇侧链的环乙烯 性质:脂溶性;不稳定,可与三氯化锑呈色 鉴别:三氯化锑反应;UV;TLC 含量测定: 紫外-分光光度法(三点校正) 三氯化锑比色法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,维生素B1广泛分布于米糠、麦麸和酵母中,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能。主要用于治疗维生素B1缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。,第一节 维生素B1的分析,氨基嘧啶环,噻唑环,亚甲基,氯化4-甲基-3(2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基)甲基-5-(2-羟基乙基)噻唑鎓盐酸盐,结构与性质,维生素B1(盐酸硫胺),第二节 维生素B1的分析,结构与性质,维生素B1为白色结晶或结晶性粉末 易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚 水溶液呈酸性,1. 溶解性,性质,噻唑环、嘧啶环共轭双键 12.5g/ml盐酸溶液(9 1000),max = 246nm,2.硫色素荧光反应,3.UV,杂原子的反应,能与某些生物碱沉淀试剂反应,生成组成恒定的沉淀,可用于鉴别和含量测定。,4.与生物碱沉淀试剂反应,5.氯化物的特性,与NaOH共热,形成硫化钠,硝酸铅生成黑色沉淀;,6.硫元素反应,7.红外光谱特征,二、鉴别试验,(一)硫色素荧光反应为维生素B1所特有,H2O,溶于丁醇,显蓝色荧光,维生素B1,VitB1,H+,H+,H+,沉淀反应,H+,S元素反应,Cl-反应,硫元素反应和氯化物反应,H+,,Company Logo,三、含量测定,高氯酸滴定液(0.1mol/L)的滴定度(T)为16.86mg/ml。 喹那啶红亚甲蓝 (紫红天蓝),非水溶液滴定法,紫外分光光度法,维生素B1分子中具有共轭双键,在紫外区有吸收,注意,维生素B1片的测定,片剂、注射剂,= 421,(每片)相当于标示量的%=,A = ECL,ChP,1,1,(每ml)相当于标示量的,NaOH,硫色素荧光法:维生素B1的专属性反应,2. 方法,小结,维生素B1(盐酸硫胺)氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成季铵盐。 性质:水溶性;硫色素反应;可与生物碱沉淀剂反应 鉴别:硫色素反应;沉淀反应;Cl、S反应 含量测定:非水滴定;紫外分光光度法; 硫色素荧光法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,第三节 维生素C的分析,维生素C是胶原蛋白形成所必需的,有助于保持间质的完整,维生素C 缺乏可导致齿龈肿胀,出血,皮下瘀点,关节及肌肉疼痛,毛囊角化,严重缺乏可引起坏血病。所以维生素C又称为抗坏血酸。,L-抗坏血酸,(有生物活性),L-二酮古罗糖酸,L-去氢抗坏血酸,无生物活性,第三节 维生素C的分析,结构与性质,C3OH的 pKa = 4.17,C2OH的 pKa = 11.57,2.酸性,一元酸,性质,1. 溶解性,易溶于水,水中呈酸性;略溶于乙醇,不溶于三氯甲烷或乙醚,L(+)抗坏血酸 活性最强 比旋度+20.5+21.5,手性C(C4、C5),3. 旋光性,*,*,含有四个光学异构体,有活性,有活性,无活性,4.还原性,二烯醇结构,与碱反应,5. 水解反应,弱碱中生成单钠盐, 强碱中水解,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,6. 具糖的性质,五碳糖,维生素C,7. UV特征,维生素C具有共轭双键,利用还原性:与氧化剂的反应,鉴别试验,(一)与AgNO3反应,去氢抗坏血酸,黑色,(二)与2,6 - 二氯靛酚反应,氧化型,玫瑰红色 (酸性),蓝色(碱性),无色,与碱性酒石酸铜反应,与KMnO4反应,(三)与其他氧化剂反应,砖红色沉淀,试剂褪色,磷钼酸 钼蓝,与磷钼酸反应,(四)薄层色谱法,(五)糖类反应,H2O,维生素C可在三氯醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖,再失水,转化为糠醛,加入吡咯,加热至50 产生蓝色,0.01mol/L HCl,(五)紫外光谱法,BP2010,杂质检查,(一)溶液的澄清度与颜色检查,内酯环水解,糠醛缩合呈色,高于或低于pH.0-6.0,空气、光线、温度,维生素C,脱羧,控制有色杂质,维生素C,(二)铁、铜离子,(三)草酸的检查,草酸与金属离子作用形成沉淀;所以对Vc的原料,尤其是注射液,要进行草酸检查; 加入CaCl2,比浊法;,原子吸收分光光度法,(二)铁、铜离子,原子吸收分光光度法,四、含量测定,维生素C,维生素C制剂,碘量法,二氯靛酚法,紫外分光光度法,高效液相色谱法,指示剂 淀粉指示液,(一)碘量法,原理:利用Vc强的还原性,HAc,取本品约0.2g,精密称定,加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液显蓝色,在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。,2、方法,原料药,(2)酸性环境 稀醋酸,(1)新沸冷H2O,减慢VitC被O2氧化速度,(3)立即滴定,赶走水中O2,,减少O2的干扰,3、注意事项,(4)附加剂干扰的排除,片剂 过滤,(二)2,6 - 二氯靛酚滴定法,快速滴定,专属性强,用于含Vit C的制剂与食品分析,自身指示终点,1. 原理,2. 方法,(2)快速滴定 2min内,(1)酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,(3)亦可剩余比色测定,(定量过量),(测剩余染料),3.注意事项,(4)二氯靛酚不稳定,须临用前配制并标定,专属性强,多用于含 Vc的制剂和食品的分析,配制方法:NaHCO3 42mg+水50 ml,加二氯靛酚钠二水合物0.5g +水200 ml,过滤,即得。 标定方法:用干燥的维生素C对照品进行标定,(三)高效液相色谱法,人血浆中VitC浓度的HPLC法测定,小结,维生素C(L抗坏血酸) 烯二醇结构 性质:水溶性;酸性;旋光性;还原性;水解性 糖类性质;紫外吸收特性 鉴别:硝酸银反应;二氯靛酚钠反应; 氧化反应;TLC;糖类反应;紫外 杂质检查:澄清度与颜色检查 铁、铜离子检查 草酸检查 含量测定:碘量法;二氯靛酚滴定法; 高效液相色谱,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,Sources,Sunlight Foods Fortified Milk Fish Oils,Deficiency,佝偻病 牙齿松动 鸡胸 骨质疏松 脚成弓形,Function,促进钙、磷的吸收; 促进骨骼和牙齿的正常生长; 调节柠檬酸的代谢,第四节 维生素D的分析,维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称,目前有10多种,都是甾醇衍生物。,维生素D2 维生素D3,第四节 维生素D的分析,维生素D2、D3无色针状结晶或白色结晶性粉末;无臭,无味;遇光或空气均易变质。,溶解性:维生素D2在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶;维生素D3在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解;二者均在植物油中略溶,在水中不溶。 不稳定性:毒性增强.含有多个烯键,所以极不稳定,宜氧化变质,效价降低,毒性增强。,第四节 维生素D的分析,旋光性:有五到六个手性碳原子,均具有旋光性. 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子,第四节 维生素D的分析,显色反应 甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 紫外吸收特性 无水乙醇 265nm 维生素D2 为460490 维生素D3 为465495,醋酐 硫酸,E,1cm,1%,E,1%,1cm,二、鉴别试验,(一)显色反应,1与醋酐-浓硫酸反应,氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色,醋酐 硫酸,2与三氯化锑反应,本品,1,2-二氯乙烷,三氯化锑试液,橙红色,粉红色,3其它显色反应,维生素D,三氯化铁,橙黄色,二氯丙醇 乙酰氯,绿色,(二)比旋度鉴别,无水乙醇溶液,维生素D2,比旋度为102.5至107.5,维生素D3,比旋度为105至112,(三)其它鉴别方法,薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点,紫外、红外吸收光谱,(四)维生素D2、D3的区别反应,维生素D2,维生素D3,96%乙醇,10ml,取0.1ml,乙醇1ml 和85%硫酸5ml,红色max570nm,黄色 max495nm,三、杂质检查,(一)麦角甾醇的检查,维生素D290%乙醇溶液,洋地黄皂苷溶液,不得发生浑浊或沉淀,(二)前维生素D的光照产物,(三)有关物质检查,Ch.P 2010NP-HPLC,含量测定,USP34-NF29,化学法,色谱法,微生物法,BP2010,化学法,色谱法,光谱法,四、含量测定,正相高效液相色谱法,(一)维生素D测定法,含量以单位表示 每单位相当于维生素D 0.025g,注意:计算的是维生素D及前维生素D经折 算成维生素D的总量,固定相:硅胶 流动相:正己烷正戊醇(997:3) 检测波长:254nm,第一法:用于无维生素A醇及其他干扰的供试品 第二法:(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D,得供试品溶液B;(3)按第一法进行测定。 第三法:当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后,前维生素D峰仍受干扰时,采用此法。,小结,维生素D抗佝偻病维生素的总称 性质:脂溶性;不稳定;旋光性; 显色反应;紫外 鉴别:显色反应;比旋度; VD2、VD3区别 杂质检查:麦角甾醇; 前维生素D光照产物;有关物质 含量测定: 三法,A,B1,C,D,E,Vitamins,Contents,主要讲解,第五节 维生素E的分析,维生素E早在20世纪20年代就被人们发现,Evans和他的同事在研究生殖过程中发现,酸败的猪油可以引起大鼠的不孕症。 是与生育有关的维生素的总称 1936 年分离出结晶体 1938 年被瑞士化学家人工合成,维生素E的显微照片,维生素E胶囊,维生素E类结构与相对活性,维生素E的结构,2R*(4R*,8R*)-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-2H-苯并吡喃-6-醇醋酸酯,-生育酚醋酸酯,生物效价 右旋体 : 消旋体 = 1.4 :10,(天然品),(合成品),维生素E的性质,性状:黄色或金黄色粘稠状透明液体 脂溶性:溶于丙酮、乙醇、乙醚或植物油等有机溶剂中 水溶性:不溶于水 稳定性:无氧时对热、酸稳定,对碱不稳定, 对氧敏感,遇光可被氧化,色渐变深,,UV:乙醇溶液中max284nm,(一),硝酸反应,二、鉴别试验,维生素E在硝酸酸性条件下,水解生成生育酚,水解,三氯化铁联吡啶反应,(二),生育酚,对-生育醌,红色,Fe3+,O,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚(4 :1),显色剂 硫酸(105 5),VitE Rf = 0.7 -生育酚 Rf = 0.5 -生育醌 Rf = 0.9,维生素E合成过程,2,3,5-三甲基对二苯酚,植醇,+,-生育酚,-生育酚醋酸酯,三、杂质检查,三、杂质检查,(一)酸度,游离醋酸,(二)生育酚,硫酸铈滴定液(0.01mol/L) 二苯胺(亮黄灰紫),利用游离生育酚的还原性, 将硫酸铈还原成硫酸亚铈,三、杂质检查,1.原理,2.试剂,问药典中规定的维生素E中所含的游离生育酚的限量是多少?,计算 每ml硫酸铈滴定液(0.01mol/L)相当于0.002154g的游离生育酚,2.15,限量,(三)有关物质的检查,(四)残留溶剂:环己烷的检查,四、含量测定,GC法,(一),GC特点,1、,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化。易受样品蒸气压限制,载气N2 固定液硅酮(OV-17) 担体硅藻土或高分子多孔小球 柱温265 检测器氢火焰离子化检测器(FID) 内标正三十二烷 n 500 R2,内标法加校正因子定量,2、VitE测定的色谱条件,内标法,供试液(样品+内标),内标物,对照液(对照+内标),是样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近,样品 dl生育酚 固定相十八烷基硅烷键合硅胶 流动相甲醇-水(49 :1) 检测波长292nm R2.6 RSD0.8%,(二)HPLC法(外标法),(三)荧光分光光度法,对照品 dl生育酚 在220400nm波长范围内,以发射、激发波长间隔为

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