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文档简介

学习心得一、实验室质量管理1、质量法规 对产品质量法、标准化法、种子法、农作物种子标签和使用说明管理办法等的学习有待进一步学习。2、质量与检验 (1)从过程管理的角度来看,质量绝对不是检验出来的,预防产生质量,检验不能产生质量; (2)合格产品不是检验出来的,而是干出来的; (3)检验可以发现不合格产品。3、种子检验室质量管理 应建立相适应的有效的管理体系,形成文件,将抽样到结果报告各环节检验活动标准化、制度化。管理体系文件一般包括四个层次:质量手册、程序文件、作业指导书、记录格式。4、试验要求(1)若发现试验结果异常,试验人员不要轻易下结论,应认真查记录、查计算、查操作、查试剂、查方法、查样品,找出原因后有针对性地进行复验。(2)要认真及时做好原始记录,要求所有的实验内容都要有原始记录,不得漏记。5、记录控制要求(1)试验数据应用中性笔或钢笔在实验同时记录在原始记载表上,不应事后抄录,也不应漏记。试验中出现的异常情况也应及时记录。书写要求工整、清楚、真实、准确、完整。不准用铅笔记录,不得随意涂改、乱写、乱画和折叠。当发生笔误时,用“”注销,并在“”上方由本人更正,加盖改正章。(2)试验原始记录要按年编目成册,做好标识,归档保管。(每年做一次整理归档)。6、检测数据修约规则(1)称重规定:1g以下保留四位小数,110g保留三位小数,10100g保留二位小数,1001 000g保留一位小数。(2)在净度分析中,各成分之和是999或1001,从最大值(通常是净种子成分)增减01。(3)数字修约规则:“四舍六入五成双”法则。(4)检测室报出数值最右的非零数字为5时,应在数值后面加“( + )”或“( -)”或不加符号,以分别表明已进行过舍进或未舍未进。7、发芽用沙: 0.05-0.08mm;160度烘干2小时杀菌。水:PH:6.0-7.0(必须验证)二、玉米品种鉴定技术-SSR标记法(1) 不同点:1、提取DNA用96孔深孔板;PCR板。2、将深孔板放入沸水中煮沸15min;PCR煮沸;3、将煮好的深孔板拿出,加入250l的TE,静置至室温即可,TE加入的量应与NaOH提取液加入的量等体积;120l的纯净水。4、DNA提取方法有CTAB提取法、快速碱煮提取法、试剂盒法;PCR碱煮提取法。5、电泳检测有PAGE电泳检测、毛细管电泳检测两种;PAGE电泳检测。6、在干净的凹板上涂上疏水硅烷;剥离硅烷。7、将扩增好的产物加入5l变性剂变性;加样缓冲液。8、累计检测40个核心SSR引物位点;20个。(二)重点知识点1、SSR技术特点多态性丰富,分辨能力强,每个位点最多可含有十多个等位基因;较高重复性,针对于每个位点设计特异性引物,扩增均为特异性目的片段扩增;前期研发基础强,有大量已知染色体位置的共享位点;为共显性标记,能准确区分不同等位变异;为中性变异标记;数据形式为具体片段长度,能够实现数据标准化;技术非常成熟,检测方法简便易行;SSR技术易于推广,不受专利限制。2、DNA提取的原则(1)保证DNA结构的完整性;(2)将蛋白质、多糖、多酚等杂质降低到最低程度;(3)排除有机溶剂和金属离子的污染;(4)纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质;(5)排除其他核酸分子的污染。3、快速碱煮法(1)碱:在碱性环境下裂解细胞,使DNA变性,从而达到提取的目的。碱能够使DNA变性,且不会复性,并缠结成网状物质析出最终加入TE溶液溶解。(2)煮:煮沸的方式能够代替液氮冷冻法,抑制DNA酶的活性,防止煮沸还能够代替研磨,破坏细胞壁和细胞膜,释放出DNA。4、核酸提取注意事项最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量少,纯度低5、 DNA提取量少(1)主要原因实验材料不佳或量少;破壁或裂解不充分;沉淀不完全;洗涤时DNA丢失(2)解决方法尽量选用新鲜(幼嫩)的组织;样品预处理充分;适当延长高温裂解时间;用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒;低温沉淀,延长沉淀时间,加沉淀辅助物6、 PCR扩增 (1)PCR,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 (2)一是被扩增的DNA所需量极小,理论上讲一个分子就可以用于扩增了;二是扩增效率高,几个小时就扩增1000万倍以上。 7、PCR反应体系及循环条件 PCR反应是Taq酶以dNTP为原料,以一对寡核苷酸引物为起点,以被扩增的DNA序列为模板在PCR热循环仪中进行的扩增反应。 标准的PCR过程分为三步:1.DNA变性(90-96):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。2.退火(25-65):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70-75):在Taq酶(在72左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的53 端延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。8、模板DNA对PCR反应的影响(1)模板纯度:蛋白、酚类、多糖等杂质会抑制PCR反应;(2)模板完整性:模板DNA降解会导致PCR无扩增产物;(3)模板浓度:实验表明:在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。模板的量与循环数要匹配,如果循环数一定,模板的量太少,会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多,则会出现条带弥散,模糊不清。(4)PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度(5)PCR反应体系中引物的浓度一般为0.10.5umol/L,在此范围内,PCR的产物量基本相同。(6)若引物量过低会导致PCR产物量降低,而如果引物量过高,则会引起碱基的错配和非特异性扩增、生成引物二聚体,从而使目的DNA片断的扩增量下降。(7)通常引物量应当10倍于靶序列。此外,引物的Tm值与退火温度相关,故引物的Tm值最好在5580的范围。(8)高浓度dNTP易产生错误掺入,过高则可能不扩增;但浓度过低,将降低反应产物的产量。(9)PCR中常用终浓度为50-400M的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。(10)此外,dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。因此,dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。(11)耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子。(12)反应体系中Mg2浓度过低,会显著降低酶的活性;而Mg2浓度过高时,又使酶催化非特异性扩增增强。(13)Mg2浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度,从而影响扩增片度的产率。(14)由于在PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2结合从而降低反应体系中的Mg2的浓度,而耐热DNA聚合酶需要的是游离的Mg2,因此,一般Mg2的加入量应比dNTP的总浓度高0.22.5mmol/L。(15)在不同的反应体系中模板DNA、引物以及dNTP的量各不相同,因此应根据具体的情况来确定特定PCR反应体系中Mg2的最适浓度。9、PCR循环条件模板DNA的变性:模板DNA经加热至95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至60左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。在最后一个循环后,反应在72维持5-15分钟。使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。10、 无扩增产物(1) 原因 模板含有抑制物,模板含量低;该Buffer对样品不合适;引物设计不当或者引物发生降解;反应条件不适,退火温度太高,延伸时间太短。(2) 对策纯化模板;更换Buffer或者调整浓度;重新设.引物;降低退火温度,延长延伸时间。11、PAGE电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是由丙烯酰胺(简称Acr)单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)通过化学催化剂AP(过硫酸铵)和加速剂TEMED(四甲基乙二胺)形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。聚丙烯酰胺凝胶具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分离效果好。12、 注意事项(1)在配制胶时,过硫酸铵最好现配现用,不要先配AP(过硫酸铵)溶液,因为AP很容易变质。而且过硫酸铵固体时间过久也会失效的。(2)电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。(3)丙烯酰胺为神经剧毒和可疑致癌物,实验过程中应穿工作衣,戴手套并加倍小心。13、SSR技术在品种真实性鉴定中的应用(1)成对比较 a)与来自农业部品种权保护的标准样品比较; b)与已审定品种标准样品比较; c)与模仿对象进行比较。 (2)数据库比较 a)在品种权保护中,辅助筛查申请品种的最近似品种,代替原来由申请者自行提供。 b)在国家和各省区试中,鉴定区试品种是否与已知品种雷同,并作为品种能否推荐审定的必要条件。 c)在种子市场打假中,鉴定市场抽检的品种仿冒了什么已知品种。14、 纯度鉴定流程(1)引物筛选 利用至少10个核心引物进行筛选和评估(杂交种取20粒),一方面确定该纯度问题是以自交苗、回交苗、其它类型杂株还是遗传不稳定造成的,一方面挑选出合适的双亲互补型引物进行下一步鉴定。(2)样品鉴定 从待测样品中随机取样至少100粒种子,利用确定下的若干引物进行进一步鉴定,并利用这些引物综合判定待测杂交种的纯度。m 如果是自交苗造成的,采用其中1个互补型引物即可;m 如果是回交苗造成的,则应采用2-4个能够综合判定出回交苗的互补型引物;m 如果是其它杂株,则根据实际情况选择1-2

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