临床医学检验新技术.doc

荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得CT值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。 临床应用：各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。检测种类涉及多种病原体，从细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体、螺旋体到寄生虫。流式细胞术流式细胞术（FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。技术原理：将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统（透镜、光阑、滤片和检测器等）收集荧光、光散射、光吸收或细胞电组抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。临床应用：可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和艾滋病感染者T4、T8细胞的记数。FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种，可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。一、 在血液病诊断和治疗中的应用FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。二、 在血栓与出血性疾病中的应用FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白b/a,CD62，CD63等)监测血小板功能及活化情况，有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。而用FCM测定钙离子浓度，可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。FCM可以测定血小板相关抗体含量，用于诊断及治疗监测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。酶联免疫分析技术酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术自20 世纪70年代初问世以来，发展非常迅速，目前被广泛应用于免疫学、医学、生物学等许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。技术原理：酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。根据检测目的和操作步骤不同，有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。临床应用：ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。1、病原体及其抗体的检测病毒感染如肝炎病毒，巨细胞病毒，风疹病毒，疱疹病毒，轮状病毒，艾滋病病毒（HIV）等。细菌感染如链球菌，布氏杆菌等。寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 2、蛋白质如各种免疫球蛋白，肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶，激素如hCG, FSH, TSH, hGH, 酶如肌酸激酶-MB，其他蛋白质如铁蛋白等。 3、非肽类激素如T3, T4，雌二醇，皮质醇等。 4、药物治疗心脏病药物如地高辛，抗哮喘药物如茶碱，抗生素如庆大霉素等。免疫印迹技术免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术基本原理：免疫印迹与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blot所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。临床应用：免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。用免疫印迹技术可定性、定量地检测出待检样品中含量很低的特定病原体的抗原成分，对于一些能感染细胞而细胞病变不易观察的病原体的检测也很有用。用单克隆抗体做为第一抗体进行免疫印迹，还可以对毒株做分型研究。时间分辨荧光分析法时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最先进的免疫检测技术。技术原理：使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。临床应用：时间分辨荧光免疫分析可用来检测生物活性物质。在内分泌激素的检测，肿瘤标志物的检测，抗体检测，病毒抗原分析，药物代谢分析以及各种体内或外源性超微量物质的分析中，应用TRFIA法越来越普遍。近年来，已将这项技术应用于核酸探针分析和细胞活性分析、生物大分子分析，发展十分迅速。一、TRFIA法在内分泌学中的应用内分泌激素是一些活性小分子，它们能与适当的抗体反应，具有免疫反应性，但不能产生抗体，不具有免疫原性，它们属于半抗原。对这些半抗原的测定，一般多用竞争性时间分辨荧光免疫法测定。这方面的测定主要有血清中孕酮、雌二醇、睾酮、甲状腺激素、前列腺素的测定等等。二、TRFIA在肿瘤学中的应用对一些完全抗原，它们大多是既有免疫反应性又有免疫原性的蛋白质类，主要包括促甲状腺激素、血清胰岛素、血清癌胚抗原、血清甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等，主要采用非竞争性TRFIA法进行测定。三、TRFIA法在免疫学中的应用某些免疫细胞（如NK、LAK、T杀伤细胞等）的活性，可以用TRFIA法来检测。四、TRFIA法在微生物学中的应用目前TRFIA已广泛应用于乙型肝炎病毒、脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞体病毒（RSV）、副粘病毒、风疹病毒、马铃薯病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、出血热病毒和梅毒螺旋体的抗原抗体以及某些细菌和寄生虫抗体的检测。最近,潘利华等用TRFIA法进行了人血清中丙型肝炎病毒抗体(Anti-HCV)的检测，效果明显高于酶联免疫法。飞行时间质谱技术飞行时间质谱技术的发展，给临床肿瘤早期标志物的发现带来了划时代的革命，它将传统的通常一次只能测定一个蛋白标志物革命性地发展到一次可测定数十个，甚至数百个蛋白，同时极大的提高了诊断的灵敏度和特异性。技术原理：质谱仪需要在真空情况下运转，用以保护检测器，同时提高测量精度。在实际使用中，一个微孔需要被使用。仪器中气体样本首先通过微孔取样，然后到达离子源，有脉冲电场送入飞行时间模块。然后使用垂直于送入方向的脉冲电场对离子进行加速。这样做的主要目的是确定所有离子在水平方向没有初速度。在U型飞行之后，达到传感器。不同离子到达传感器的时间不同，借此来选择m/z。通常的假设认为离子只能带一个电荷，如此，得到的信号，直接对应检测到离子的相对原子质量。临床应用：在肿瘤早期诊断中的研究进展液体芯片-飞行时间质谱技术利用磁珠俘获肿瘤患者与健康对照体液中低丰度特异蛋白或多肽，经飞行时间质谱测定和软件分析，建立由两者差异表达蛋白或多肽组成的质谱图模型，可对潜在的生物标记物进行鉴定。化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性。技术原理：化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。临床应用：用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物肿瘤标记物、内分泌功能、传染性疾病等多种检测项目。生物芯片生物芯片技术起源于核酸分子杂交。所谓生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等）的微阵列杂交型芯片，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。技术原理：生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。临床应用：从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。免疫浊度法免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。技术原理：当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。临床应用：1、免疫功能监测：免疫球蛋白G、A、M，免疫球蛋白轻链、，补体C3、C4测定。 2、心血管疾病监测:载脂蛋白A、B，脂蛋白(a)，C-反应蛋白等。 3、炎症状况监测:C-反应蛋白，a-酸性糖蛋白，触珠蛋白，铜蓝蛋白等。 4、风湿性疾病检测：ASO、RF、CRP 5、肾脏功能检测：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，-微球蛋白，转铁蛋白，免疫球蛋白G等。 6、营养状态监测：白蛋白，前白蛋白，转铁蛋白等。 7、凝血及出血性疾病的检测：抗凝血酶，转铁蛋白，触珠蛋白等。 8、血脑屏障监测：脑脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、M。免疫荧光标记技术技术原理：利用物质吸收光能后，产生激发态而发光的特性。将具有这种特性的荧光素（异硫氰荧光黄或罗丹明B200)用化学方法结合在特异的抗体或抗原上，又不损害其抗体或抗原活性的一种荧光显微镜下的示踪技术。抗体与抗原的结合是高度特异的，所以只要知道其中的一种因子，也就知道了另一种因子。技术特点：1、特异的抗原抗体反应，并与形态学相结合，增加试验的特异性和敏感性。2、利用了物理、化学、组织学、细胞学、生物学等综合性技术，使免疫荧光技术成为一种独立完整的一门方法学。3、一种荧光抗体可以检查多种抗原抗体复合物。4、只要知道一种抗体或抗原，就可以知道其对应的抗原或抗体。临床应用：1、在细菌诊断中的应用：主要用于鉴定细菌和对抗原结构的研究。如对甲型链球菌的快速诊断和分型鉴定，脑膜炎双球菌的快速诊断等。2、在寄生虫学诊断中的应用：可用已知的寄生虫抗原，检查血清中的抗体，用于寄生虫病的诊断和流行病学调查。也可用于寄生虫感染的免疫学和发病机理等方面的研究。3、在病毒学诊断中的应用：快速诊断中对流感病毒、乙脑、狂犬病、脊髓灰白质炎、恙虫病等的快速检出；也可用来检查血清中的抗病毒抗体。4、在免疫病理方面的应用：检查球蛋白的沉积，特别是对于复合物病如：肾小球肾火、类风湿性关节炎、红斑狼疮等利用补体荧光法测定复合物沉着的位置，以了解病变侵犯部位和病变基础。5、血液中B及T细胞的鉴定。6、激素和酶的局部组织定位。7、一些器官移植抗原鉴定。8、组织中免疫球蛋及补体组分的检测。9、在诊断自身免疫病方面的应用：(1)抗核抗体（ANA)：是自身免疫性疾病最常出现的一种抗体，特别是系统性红斑狼疮，阳性率更高。其它如类风湿性关节炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦可出现较高效价的抗体。（2）抗线粒体抗体：在慢性活动性肝炎患者中，如抗体效价在1：256以上可以认为是自身免疫性肝炎。原发性胆汁性肝硬化约有98出现线粒体抗体，慢性活动性肝炎在31左右。线粒体抗体在胶原性疾病中可见（2-8）且效价远较自身免疫性肝炎低。（3）抗平滑肌抗体：这是对平滑肌组织的特异性抗体，没有器官和种属特异性。其临床意义对于自身免疫性肝炎约82，急性肝炎早期也可出