杀虫微生物学课件

,杀虫微生物学 （昆虫病理学）,一、杀虫微生物学 杀虫微生物学是研究利用细菌、真菌、病毒、原生动物以及线虫等病原物（Pathogen）对害虫（以及螨类）的致病作用造成害虫的大量死亡来抑制害虫虫口的科学（内容包括病原物的分类、致病作用、生物学、生态学、杀虫机理、防治方法等）。由于昆虫的病原线虫通常都很小，因此习惯上将他们连同细菌、真菌、病毒及原生动物等一起视为昆虫的病原“微生物”。,第一章 绪论,二、昆虫病理学的概念 昆虫病理学是研究昆虫的各种疾病及其起因的科学，也是研究昆虫疾病的发生、发展和转归的学科。 主要内容：研究引起昆虫疾病的各种病原生物-病原学(Etiology)、症状学(Symptomatology)、大体病理学(Gross Pathology)、组织病理学(Histopathology)、生理病理学(Physiopathology)以及流行病学(Epizootiology)等。为防治益虫的疾病和利用昆虫病原体防治害虫提供基础理论依据。 主要任务：查明各种病原体的种类、分类地位、生物学及生态特性；研究病原作用于虫体后的致病机理及流行因素、揭示病虫虫体出现的一系列结构、功能、和代谢方面的变化，找出它们之间的内在联系，从而阐明疾病的起源、发生、发展的规律，并从这些特殊规律中探索一般规律和它们之间的共同本质。,三昆虫病理学与杀虫微生物学与其它学科的关系 昆虫形态学 昆虫生物学 昆虫生态学 昆虫生理学 昆虫分类学 昆虫毒理学 昆虫生物化学 昆虫病理学（杀虫微生物学） 细 真 病 原 线 免 菌 菌 毒 生 虫 疫 学 学 学 动 学 学 物 学,植物病理学,脊椎动物 病理学,无脊椎动 物病理学,病理学,昆虫学,四、昆虫病理学（杀虫微生物学）的发展史 分为四个时期： 1、1860年以前-奠定基础时期。 公元前330-320年，希腊的科学家亚里士多德在动物的历史一书中记载了各种各样蜜蜂的疾病，我国春秋早期的政治家管仲就主张用黄金和粮食奖励防治蚕病有经验的人。十二世纪中叶出版的陈甫的农书，在世界上首次描述了家蚕的白僵病、脓病、空头软化病等症状。我国的神农本草经、本草纲木都有僵蚕、冬虫夏草、蝉茸入药的记载。 把昆虫病理学作为一种实验科学的是意大利的巴希(Bassi)。19世纪初，白僵病在意大利和法国的养蚕业中频繁发现，巴希第一次通过实验证明了这种病不是在蚕体中自然发生的，成为疾病的寄生物是从外面侵入的，并在活体内发育，导致宿主死亡，病虫因寄生物的存在而成为感染源。传染可由注射、接触、食下而引起。而白僵菌是引起白僵病的主要病原。首创了动物疾病的微生物病原学说。同时，他在1916年确定了白僵病在昆虫体内不会自然产生，而是要由一种外来物进入虫体而致病，从而建立了昆虫病理学的基础。1856年意大利科学家Cornalia观察到患黄疸病的家蚕血球中有多角体，并注意它们位于细胞核内。,2、反复实验、应用时期。1860-1930年 19世纪后期，法国的蚕丝业受蚕病危害而频临破产，蚕茧产量十年内减少到原产量的1/5，1865年法国各州的养蚕家联合向政府请求减税，要求推进蚕业科学的研究。当时正在化学道路上迈进的巴斯德受命着手于蚕病的研究，通过5 年的试验，证明了微粒子虫是疾病的病原，并能通过卵传递到次代。同时查明不含微粒子虫的雌蛾所产的卵，用于蚕业生产，可防止这种疾病的流行，从而拯救了几乎毁灭的法国养蚕业。由于这种疾病是传染性的，而且害虫中也有类似的疾病，所以产生了将昆虫病原体利用来防治害虫的想法。 俄国的梅契尼柯夫于1856年在调查了奥州金龟子危害谷物的调查，注意了害虫种群在不同年份有很大的波动，他判断这种波动是由三种不同病害引起的，其中有一种是绿僵菌，他提倡生产这种真菌用于害虫防治。1888年柯拉塞尔斯契柯在基辅建立了一座生产绿僵菌的小型工厂来防治甘蔗上的甜菜点腹象甲，取得了鼓 人心的效果。1887-1898年美国Forbes和Snow在美国大规模地试用白僵菌防治麦长蝽，但未能持续。到1902年，这种用真菌防治害虫这一方法几乎被放弃，虽然在早期作过一些尝试，但均未获确切的成功。,这一时期，人们注意到蜜蜂的腐臭病，1885年,Cheshire和Cheyne从蜜蜂中分离出一种芽孢杆菌并证明其为该病的病原体，当时对蜜蜂疾病的研究多是阐明病原细菌的分类帮助减轻其危害。也注意到自然流行病的发生。 对病毒病的研究主要是由德国Vor prowazek认为是原生动物所造成的疾病，由于除去多角体后仍能保存致病力，且经过滤器后仍不能免除感染力，因此认为是一种过滤性病原。Escherich和Miyajima(1911)相信这种病是由一种病毒引起的，而多角体便是携带者。以后有两种昆虫病毒即毒蛾和模毒蛾多角体病毒被先后报道。至1920年前后，报道有30种昆虫感染核型多角体病毒。 3、引用近代仪器及接受新理论的发展时期-实践上升为理论。(1930-1970年) 第二次世界大战后，昆虫病理学以微生物学为基础，得到了飞跃发展。美国于1945年在加利福尼亚大学建立了第一个昆虫病理学实验室，设立了这方面的课程并进行昆虫病理学专业训练。1946年加拿大也建立了相应机构，研究森林昆虫疾病。1949年史泰奥斯(Steinhaus)积累了大量的昆虫病理学各方面的研究文献和生物防治实例，出版了(Principles of Insect Pathology)，,从而第一次建立 了昆虫病理学体系。1959年他创办了昆虫病理学杂志(后改为无脊椎动物病理学杂志)。1963年他又出版了，从病理生物学角度建立起完整的科学的昆虫病理学体系。以后各国纷纷成立了相应机构，陆续培养出一批昆虫病理学工作者。在生物防治的理论研究方面，由于引用先进的近代仪器和接受新科学的成就，取得了不少的重大成果。 但这一时期，由于处于化学农药合成的全盛时期，DDT的问世使生物防治工作受到较大的影响。一些少数生物防治计划还在进行。我国东北进行了利用白僵菌防治大豆食心虫和松毛虫的工作。同时我国还从国外引进苏芸金杆菌，于1964年在长沙投产，产量仅次于美国和前苏联。 4、1970年-现在，理论提高时期。 农药的黄金时代很快结束，化学农药的蔽病很快暴露，迫使人们寻找新的防治方法来解决害虫问题。因而加强了昆虫病理学研究。从事昆虫病理学研究的人员和机构，遍及世界各大州的大部分国家，研究分工更细。更深入，并加强了国际间合作。 由于三R问题的出现，也由于农药污染带来的各种不良后果，目前微生物杀虫剂的发展迅猛而不可及。产业化的步伐愈来愈快，昆虫病理学作为其支撑学科也得到迅速发展。研究领域不断深入。特别是在分子生物学上的进展促进了该学科延伸，预计将会有更大发展。,神农本草经（221-220 BC） 将白僵蚕列为“中品”，记载“白僵蚕味咸”,历史上最早的记载,延喜式（927-959 ） （日本的律令施行细则） 规定将白僵蚕作为供品征入皇宫纳税,陈旉 (1149-1189) 农书(1149) 记载了蚕的黑僵、白僵和红僵病,李时珍 （1518-1593）本草纲目（1578） 记载了冬虫夏草、蝉茸和僵蚕的药性,后汉乾佑二年（949年）宋州奏蝗一夕抱草而死。旧五代史五行志 宋淳化三年（992年）七月贝、许、沧、沂、蔡、汝、商、兖、单等州，淮阳、平定、彭城飞蝗，抱草自死。宋史太宗本纪，五行志 宋大中祥符九年（1016年）秋七月丙辰，开封府祥符县蝗抱草死，有数里。宋史真宗本纪 宋天禧元年（1017年）六月江淮大风，多吹蝗入江，或抱草木僵死。宋史真宗本纪 元大德十一年（1307年）诸暨蝗及境，皆抱竹死。元史 真宗本纪 清雍正十年（1732年）泗阳西乡柴林湖夏蝗蝻遍地，厚数寸。官兵惶惧，旋尽抱草僵死。清史稿灾异志 清乾隆五年（1740年）八月河南蝗来境，抱草而死，不为灾。清史稿灾异志,Agostino Bassi(1773-1856) 昆虫病理学之父 证明球孢白僵菌是家蚕白僵病的病因 证明除家蚕外其他昆虫对球孢白僵菌也敏感, (Ilya Ilich Metchnikov ) (18451916) 试验用金龟子绿僵菌防治麦田的奥地利金龟子害虫微生物防治的首次尝试(1873) 在啤酒筛上大量生产金龟子绿僵菌 提出孢子、僵虫以及僵虫周围的土壤都可用于生物防治,S.A.Forbes and F.H.Snow (1882-1898 ) 在美国中西部大规模试验用球孢白僵菌防治麦长蝽,Edward Arthur Steinhaus (1914-1969) 现代昆虫病理学奠基人 发起产业界大量生产微生物杀虫剂并著“昆虫病理学”,第二章 昆虫的疾病 第一节 昆虫疾病的发生和症状 一、昆虫疾病的种类和原因 昆虫在生理上、生态上和组织解剖上出现的不正常现象。 福原敏彦认为：(昆虫)偏离正常状态或健康状态的生命现象的表现。 造成昆虫疾病的主要原因有以下： （1）环境因子（外界因子） A、营养不足；B、物理作用：温湿度及光幅射等； C、有毒的化学物质（包括农药） （2）先天缺陷（内在因子） A、遗传缺陷；B、体质衰弱 （3）病原物（生物因子） A、病毒；B、立克次体；C、细菌；D、真菌； E、原生动物；F、线虫 （4）以上各种病因的综合自发病,非侵染性病害,侵染性病害,二、感病昆虫的症状 （一）外部症状 1、发育不良，虫体萎缩，发育延迟，休眠和脱皮的延迟，头大，群体发育不正 齐，体重较轻等。 2、行动异常。高爬、迴行、倒挂。 3、吐液。 4、粪便异常。下痢、积粪。 5、皮肤异常。变色斑点，节间膜隆起，尸体变黑等。 6、卵的异常。大小、卵色、卵形等异常。 （二）内部症状 组织器官的病变，体内有病原微生物存在。(各部的组织病变在各章中讲述)。,第二节 昆虫感染病的建立 昆虫的疾病是昆虫和病原物在外界环境条件下的对立统一，三者的关系是疾病建立的基础。 (一）病原 1、 感染的概念和类型 病原物侵入寄主后会在寄主组织或血淋巴中生长、繁殖。这一过程在中文里，就病原物讲叫侵染，就寄主讲叫感染；在英文里，皆为infection。当病原物破坏寄主的组织或产生毒素破坏寄主的生理机能时，就发生疾病，导致寄主代谢失调而死。感染的类型可作如下划分： 1) 根据在寄主体内感染的幅度，可分作：局部感染、病灶感染和全身感染。 2) 根据感染所在的部位，可分作肠感染、组织感染、败血感染和全身感染型。 3) 根据疾病的进展程度，可分作急性感染、次急性感染、慢性感染和潜伏期感染。 4) 根据病原的来源，可分作体内感染和体外感染。 5) 根据病原微生物的类型，可分作细菌感染、真菌感染、病毒感染、原生动物感染等。 6) 根据感染在昆虫种群中的分布范围，可分作偶发性感染、地方性感染和流行性感染。 7) 根据病原的传播方式，可分为食物感染、水感染、接触感染和传递物感染。,昆虫腹部横切面 模式图,示昆虫体内各组织器管的分布,感染类型的横切面示意图 A.肠感染型，侵入病原体局限于消化道及附近； B.组织感染型，主要是脂肪组织； C.败血感染型，病原体在血腔内增殖； D.全身感染型，侵入的病原体穿进虫体各部,2、病原对寄主的专化性 专化性是指病原对寄主的专门化程度。用不同寄主上分离的杀虫微生物感染不同的寄主，结果致病力有明显的差异。如用家蚕上分离的白僵菌感染家蚕，致病力可达96.3%，而用其感染马尾松毛虫，致病力仅有0.66%。以下是用4株分离自4种蛀干害虫上的白僵菌感染4种害虫的感染情况(LD50)： 由上表可见，分离自原寄主的白僵菌对该寄主的感染力最强。即专化性最强。 由于微生物杀虫剂的专化性，使得其在使用中对益虫是安全的，只要作好菌株的选择就可取得良好的效果。,3、 病原微生物的侵染过程 逸出 escape 增殖 传输(传播) multiplication conveyance 进入 entry 扩散=逸出+传输+进入 1)、逸出的途径 发射：主动逸出 分解作用：由物理力量引起逸出 血液流动：病原物通过寄主而逸出,病原物自感病寄主中逸出的场所及向易感个体转移的可能机制,2）传输 自发运动：病原体自己运动寻找寄主，如鞭毛菌游动孢子具鞭毛，线虫可借水膜运动，虫霉及虫草可弹射等。 直接被动运动：靠感病个体携带到它处 a. 产卵：从母体的卵巢传递到下一代卵内。 b. 交配：交配时由雄虫通过产卵器向雌虫传递。 c. 自残：传递细菌和病毒。 间接被动运动(经介质传递) a. 物理因子(气流、水流)，如白僵菌、绿僵菌孢子、苏芸金杆菌等随气流雨水等传播。 b. 传播媒介。如捕食性昆虫、鸟类、食腐昆虫等可食下病原体，而病原体在其肠道内不变化，但可随之扩散。,3) 侵入口 口器：食进病原体。 表皮：直接穿透。 气门：真菌中的一些种类和线虫进入的孔道。 生殖系统：经卵传递的种类。 4) 增殖(此时疾病发生) 增殖常发生的部位：中肠壁、马氏管等有关器官，脂肪体、上表皮、肌肉、绢丝腺、血细胞、睾丸等口，有时在细胞内(核或质)，有时在细胞间。,病原物进入昆虫的途径,各种病原物入侵的途径 A示病虫，箭头示病原体再传播另一虫体B的途径,4、致病机制 1)、破坏寄主细胞。在寄主细胞中生长，但不涉及毒素。 细胞核NPV 颗粒体病毒GV，细菌、真菌 细胞质CPV 2)、破坏组织器官。 血淋巴。如细菌等产生的败血症等。 固体组织。如虫霉可在昆虫的各组织中生长。 3)、产生毒素 溶组织素。如半知菌类分泌的一些酶可分解寄主的组织。 有毒代谢产物，特别是细菌。 4) 争夺摄食的养分，如肠道中的某些原生动物。 5) 造成机械堵塞 6) 降低寄主抗性，从而易受继发入侵物的侵染或捕食动物的捕食。 7) 诱发组织中的畸形生长物：如肥大；增生组织变形；赘生物等。 8) 1-7混合发生。,5、致病力的提高或降低 1) 影响毒力改变的因素 在人工培养基上反复接种培养,一般表现为产孢量下降、生长速率加快、毒力减退。据唐晓庆试验，白僵菌在继代移殖1-428.9代，会被局变分离子代替，主要集中在5-14代。绿僵菌经继代移殖后，菌落直径由15.88-13.88，产孢量193.6-111.2，LT50由2.72-6.88。 培养条件的改变。在不适宜的培养基上培养，或在不适宜的条件下培养，能发生变异毒力的改变。 通过昆虫移接，一般会提高毒力，但也有会降低毒力以至消失。 2) 杀虫毒力提高的途径 增加病原菌的复壮频率，减少移代次数。 通过微生物育种的各种方法，选育毒性强的变异菌株。 培养好的病原物应立即使用。 针对不同的昆虫采用相应的菌种或菌株。 对病原菌采用增强毒力的最佳培养条件。 通过寄主昆虫移接。 基因移殖,白僵菌菌落局变现象13三种变异（扇形、孤岛形、蘑菇形）， 412局变分离子,（二） 昆虫对病原物的抵抗 昆虫感染病的建立，不仅决定于病原物的致病力和传播力，而且决定于昆虫的易感性(寄主受病原体影响的特性)和抵抗力。 1、昆虫的类群不同，感病性不同。鳞翅目昆虫不仅易感染真菌病、细菌病还易感染病毒病。马尾松毛虫的病原菌的白僵菌、绿僵菌、拟青霉、穗霉、虫霉等，还有BT、非芽孢杆菌中的绿浓杆菌，病毒中有NPV、CPV，有时还会造成病害的流行。而鞘翅目昆虫中病原物较少见。 2、昆虫的不同变态期，感病性不同。一般来讲，幼虫期易感病，而卵期、蛹期虫期较少感病。这种现象可用不同变态期昆虫体上的复盖物差异及取食性不同来解释。 3、不同令期的昆虫感病性不同。一般幼令较老令易感，特别是真菌。因为老熟幼虫外表皮组织紧密，几丁质和骨蛋白含量高，蜡质层厚的缘故。但对于细菌来讲，不同令期差异不大，幼令时抵抗力弱，但取食量小。 4、昆虫抗病性不同，感病性亦不同。 抗性是指昆虫抵抗疾病的能力。免疫性是指昆虫抵抗侵染性疾病能力，而免疫性是由昆虫的保卫机制决定的。,1)、昆虫的外部防御机构 体壁的防御功能 护蜡层 上表皮 蜡 层 多元酚层 表皮层 脂腈层 外表皮- 骨蛋白 内表皮 几丁质、节肢蛋白(甲壳质) 昆虫体壁 皮细胞层 基底膜 消化道的防御功能：主要是围食膜，可以包围外来物，从而保卫肠壁细胞。,2) 昆虫的细胞保卫反应 吞噬作用：昆虫的血细胞相当于动物的白血球，血细胞可通过吞噬作用而将特异物摄入细胞质而消化。吞噬作用的血细胞主要是浆细胞和颗粒细胞，浆细胞在捕捉外来物时，会使自己变成阿米巴状，而颗粒细胞在迂到外来物，吐出絮状物，将其粘附并包入细胞内。吞噬作用分作4个步骤：A认辨与趋化性。B粘附。C摄取。D消化 被囊化作用。侵入的异物大于血细胞或寄生物团聚在一起不便于吞噬时，多数的血细胞包围在寄生物的周围，形成一个厚的包囊，首先是血细胞识别异物并与之粘联，稍后到来的血细胞粘附在来的血细胞外层，被囊化层血细胞分泌含有丝状物质的粘性多糖，随着血细胞附着作用的结束，被囊形成。在被囊形成中往往伴随着黑化反应(在被囊化和血球凝固的过程中，往往有黑色素沉积，这种黑色素的抗生作用，对异物的隔离、创伤的愈合、组织的着色和硬化都有作用)-一种体液免疫作用。 瘤的形成。如寄生物太多，吞噬作用和包囊作用会结合形成较大的团块。,3) 体液保卫反应 高级脊椎动物存在有二价球蛋白作为抗体，以应付抗 原的入侵，而昆虫没有二价球蛋白，其抗性机理主要为： 虫体原有的抗微生物物质：主要存在于血淋巴，主要有： a.酚氧化酶。常以酚氧化酶原的形式贮存，通过蛋白酶裂解形成氧化酶来控制体内酶的活性，同时，酚氧化酶还可对体液的黑素形成起作用。黑素反应是血细胞崩解后释放出的化学物质（酪氨酸类）在酚氧化酶的作用下氧化，聚合形成黑色素，黑化反应往往和被囊化有关（前已述）。 b.凝集素。凝集外来侵入虫体的微生物。微生物被凝集后容易为血细胞噬或团囊 诱导的抗性人工接种菌体或疫苗后产生。 昆虫除有自然抗性外，还有获得性免疫功能。这种抗微生物的活性物质多存在于血淋巴。多是由于抗原入侵诱导昆虫产生的。这种诱导往往有一定的特异性。,体液的黑化反应,a.抗菌蛋白。昆虫由于微生物的入侵能产生多种抗菌蛋白，能抗御若干种细菌。下面是几类昆虫的抗菌蛋白。 几类昆虫的主要抗菌蛋白,b.溶菌酶。具有抗菌性能，是一种获得性免疫。通常未免疫的昆虫血细胞中有低水平的溶菌酶，一些昆虫感染后含量可上升若干倍，已分离出该物质是小分子的碱性蛋白。 .病毒抑制因子。通过干扰素试验发现，昆虫具体液免疫功能。但患多角体病毒的家蚕血淋巴中有抑制病毒细胞对离体细胞感染的活性物质VIF，可纯化表面强的免疫活性。如纯化后加到病毒体细胞中，显示强的免疫活性。因为它使细胞内的病毒也失活了。VIF为什么不在昆虫体内起免疫作用，认为可能是病毒诱发了昆虫体内产生抑制病毒的抑制因子的物质，称之为IVIF。,5、种群的易感性 种群的健康水平与个体的健康状况不同。往往全体感病反而对群体有利。种群是个体的集合，是个体的基因型所组成的种群遗传物质的总体。在环境因素作用下共同构成种群质。种群具有按环境条件调节自身密度的能力。典型的种群中有6种昆虫个体：典型的感病昆虫；不典型的感病昆虫；未受感染的免疫昆虫；未受感染的易感昆虫；受潜伏感染的昆虫；健康的代菌者。,决定种群质的因素： 1）种群密度和聚集度。 个体越多，食料缺乏，相互间接触加多，越适宜疾病传播。种群分布型也有关系，聚集度越大，越易受感染。 2）年令组配和性比结构。 幼年种群抵抗力弱，但密度低，发病少，中年种群有较高的增长趋势，种群质水平高，群体免疫力强。老年种群处于猖獗期，密度高，食料缺乏，自身代谢产物多，种群质水平低，易感性最强。而且性比过大时，不利于种群增殖，但使其易感性增强。 3）运动及其它习性。 迁入和迁出可改变种群结构，从而改变种群易感性。易感个体的迁入必将加剧流行病并使之持续发展，而易感个体的迁出，将使疾病得到传播。 昆虫的另一些习性可改变密度和空间分布型，而使种群增加易感性，如高爬、网幕、等。,（三）环境条件与感染 1、非生物因子 主要是温度，因为昆虫是变温动物，随温度变化而影响疾病的进程。一般情况下高温使寄主体内致病过程加快。感染后的昆虫在不同温度下饲养，温度越高，死亡越快。 阳光对病原物的孢子有一定影响，大部分散射光对真菌孢子萌发有促进作用，但紫外光又影响其活力，阳光直射90小时，活力钝化。BT孢子在阳光下30分钟有50%失活。在阳光直射的森林中传染病难形成流行状态，而在一定郁闭的森林中往往发生病毒病的流行病。 湿度在真菌病中起重要作用，因为：多数真菌孢子的萌发入侵需要高湿；在自然界传播所需的新孢子，只有在高湿条件下才能从尸体上产生；有利于扩散。在虫生线虫中，它的自然侵染常常局限在潮湿地区。,气流和雨水：昆虫病原体随风飘散，污染昆虫、食物，使更多的昆虫感病，甚而可造成流行。一般来说随雨水扩散有利于土壤的病原微生物，而不利于空中的病原微生物。 土壤是特殊的生物栖息地，土壤湿度如能足以供养植物，则其中的湿度是接近饱和的。在干燥地区应用真菌防治地下害虫往往能获得成功。同时土壤对真菌的孢子和多角体往往有吸附作用，有利于其在土壤中定殖。土壤有机质含量高时有利于病原的宿存、流行、延续。 昆虫病原细菌和病毒对昆虫的感染不象真菌那样对气象因子要求苛刻，只要环境中温度适宜就可造成对昆虫感染而形成流行病。因为它的感染主要是通过食下而进行的。复制主要是在昆虫体内进行的，对环境要求不高。,2、生物因素 1) 病原物的多重感染。一般昆虫大多只受一种昆虫感染，少数受两种以上病原物侵染。同一种群中的不同个体，感染病原物的种类有不同。一般只要两种病原物间无拮抗作用，都会加快昆虫死亡速率。有增效作用。 2) 媒介物的增效作用。 昆虫：曾将少量的白僵菌撒在出入蚁巢的白蚁上，2个月后正巢白蚁全都感染了白僵菌。用天敌昆虫也可增加病原物接触机会。将污染了NPV的黑腿绒茧蜂放置于午毒蛾发生区，试验区NPV发病率提高了39%。 捕食者及食腐动物(传播并移动病原体)。如鸟类、哺乳动物及天敌昆虫能将病原物扩散到最远的区域，有时可将感病个体吃下，随粪便传播。 线虫。大多线虫体内有共生菌，而传播细菌，引起败血症。 3) 生态环境。纯林破坏了害虫和天敌的生态平衡，不利于病害发生。 4) 食物的抗菌性。植物不仅是昆虫食料的直接供给者，其是许多是昆虫的抑制者和杀伤者，不少能分泌抗菌素和杀生素。,3、化学因素 1) 外部影响的化学因素。用化学药剂消毒可造成不利于病原物发生的环境条件。微生物杀虫剂中常加有化学农药以增效。土壤的pH可影响昆虫病害的发生。 2) 内部影响的化学因素。昆虫细胞内含物，酸性有利于真菌，硷性有利于BT。鳞翅目幼虫体内肠液呈硷性，可溶解伴孢晶体，释放出有毒物质。造成昆虫中毒死亡。 4、人为因素 人类的社会活动可将病原物由一地带往另一地，并有意识的进行生产，造成病害流行。,第三节 微生物杀虫剂 利用能引起昆虫疾病的微生物防治有害生物-微生物防治。 1、微生物杀虫剂应具备的条件： 病原物对目标昆虫应有强且较稳定的致病力；病原物必须具有较好的毒理和环境安全性，不仅对其它生物无害，而且不明显干扰生态平衡；病原物应能低成本地大量生产，产品纯度较高，效价稳定，至少有一年的贮藏期。 2、不同杀虫微生物的主要特点：,3、微生物杀虫剂防治害虫的优点：害虫不易产生抗药性，在与害虫长期共同生活的过程中适应了昆虫的防卫体系，昆虫对病原微生物的免疫力长期保持低水平；有较强的选择性，一般对脊椎动物无害；病原体可通过病虫或虫尸蔓延，昆虫是各类昆虫病原体最理想的培养基，特别是专性病原；通过病原体的选择可获得致病力强的品系，通过多代移接也可得到较强的品系；病原体不仅能抑制目标害虫，而且能深刻的影响目标昆虫的种群。因为不仅保护了天敌，而且由于病原体在昆虫体内的增殖，可继续扩散传播。容易进行工业化生产 4、微生物农药市场的大小取决于：寄主范围；作物的经济价值；目标有害生物的经济重要性；与其它生物防治产品或与化学农药的竞争力；市场需求。 5、杀虫微生物的发展方向 1）从生态学角度，向生态系中引入天敌微生物 病毒、真菌等微生物杀虫速度较慢，在害虫已经发生并造成危害之后再使用这类杀虫剂往往达不到应有的效果。所以虽然真菌应用历史较长，但发展最快的却是细菌中的苏云金杆菌。但从生态学角度出发，近来却出现了相反的趋势，作为在复杂的生态系中以长期控制害虫为目的，新的微生物防治方法再次活跃起来。如用核型多角体病毒防治,棉铃虫，用质型多角体防治松毛虫等。真菌方面，用莱氏野村菌防治大豆害虫，用白僵菌防治松毛虫等。病毒、真菌和细菌中的金龟子芽孢杆菌虽然杀虫速度慢，但可在施用后相当长时间内在生态系中定殖下来，并能在数年内控制某些害虫的数量。最经典的例子是：1909年美国Clinton从日本引回少数午毒蛾噬虫霉，放菌后其中有两条发病死亡并产生休眠孢子，经逐步活体扩大后收集到一定数量的孢子于1910年和1911年两次在波士顿的6 个点施放，1910年放菌点虽有少数幼虫感病，但总的认为放菌失败了。在79年后，1989年美国东北部7个洲首次发现一种虫霉的大规模流行病，形态学和病理学研究均表明其为午毒蛾噬虫霉，进一步的生化鉴定（等位基因酶分析和限制性片断多形性分析RCEF）证明了这种病原就是日本的午毒蛾噬虫霉。该菌在引种79年后已成功定殖。 1989年是一个多雨的年份，在更大面积上造成了广乏的流行病，1990年，该菌的流行规模扩大到10个州。通过病原、寄主、环境等的控制，以达到长期控制害虫的目的。,2）从化学角度，从微生物代谢产物中筛选高效低毒的杀虫物质 从微生物代谢产物中寻找高效低毒同时以容易被分解的杀虫物质，是日益引起注意的研究课题。日本生产的6种杀螨剂其中就有2种是微生物的代谢产物。1973年从南非土壤中分离到一株链霉菌能能产生杀虫抗生普拉克隆A、B，对铜色绿蝇有高度防治效果。此外还有杀蚜素、杀蝶素等均由放线菌产生。已知的一些真菌能产生杀虫毒素，如白僵菌素、绿僵菌素。细菌中的苏云金杆菌的晶体毒素等。 3）利用生物工程技术增强和提高微生物杀虫剂的杀虫效果 采用生物生物工程技术改造微生物杀虫剂是杀虫微生物有光辉前景的领域。各种微生物尽管有各自的长处，也各有不足之处。如杀虫谱太窄，杀虫速度慢等。这都是这些微生物固有的特性决定的。只有通过生物技术改造，才会有更好的前途。分子遗传学的发展，为开展杀虫微生物的基因工程创造了良好的条件。研究最多的是苏云金杆菌，该菌的晶体毒素蛋白质基因及分子遗传学的进展为遗传操纵晶体蛋白基因奠定了良好的基础，已成为生物技术领域中一个非常活跃的领域。目前已应用基因工程构建了“杀虫工程菌“和“杀虫工程植物“。1984年首次将晶体毒素蛋白基因通过土壤的枯草杆菌的T1质粒成功的转移到烟草中，使晶体毒素基因在高等植物中得到了高度表达，据报道每克植物可产生5mg的毒素蛋白，已建成杀虫植株，而且这种特性可通过种子遗传下去。 当前生物农药商业化的困难：应用效果的不稳定性；申报专利的可能性；登记注册的复杂性；降低成本的困难性；成果转让的艰巨性；农民接受的保守性。,生物五界：根据生命进化历史的主要阶段分为：无细胞阶段原核单孢生物 真核（单胞 多胞）生物。包括：原核生物界、原生生物界、 植物界、真菌界、 动物界阶段、 原核生物界 非有丝分裂，无核模核仁（不具有真正细胞核），有呼吸和光和作用，由脱氧 核糖核酸形成环状，无蛋白质，无中心粒，无性细胞二分裂 包括：细菌、立克次体、放线菌、光合细菌（厌氧细胞细菌和好氧兰细菌） 原生生物界 有核模和细胞器，细胞壁十分复杂，行有丝分裂，包括：褐藻、红藻、绿藻、 原生动物粘菌,摄取体外周围已分解的生物残体，无叶绿素，不能进行光合作用，细胞壁的 组成大多为甲壳质 植物界 能靠叶绿素光合作用合成碳水化合物包括：苔藓植物和维管束植物 动物界 吞食死的或活的生物来加以消灭而摄取营养,菌物界（真菌界）,细胞型生物,真核生物,病毒：非细胞型而赋有生物特性的实体（有遗传物质核酸，有遗传特异性，能杂交、复制，但不能独立进行代谢作用，是其它生物细胞内的共生或寄生体）（无具体的细胞，不形成细胞。不能离开寄主细胞而自发的复制）。包括病毒、类病毒、噬菌体等。 八界分类系统：细菌总界（1、真细菌界；2、古细菌界） 真核总界（3、古菌界；4、原生动物界卵菌；5、植物 界；6、动物界；7、真菌界；8、藻界粘菌） 真菌界主要包括：壶菌、接合菌、子囊菌、担子菌、半知菌。,非细胞型生物,第三章 杀虫真菌 真菌（fungi）是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，原因是它们生长在宿主的表面，明显可见。真菌也是首先被研制成杀虫剂的微生物，并以其特殊的营养方式、独特的入侵方式和可靠的宿存机制在害虫的综合治理中表现出强大的生命力。 第一节 概 述 真菌是微生物的一个重要类群，约有10万余种，杀虫真菌目前世界上已记载的约有100属，800多种，并且数量还在不断地增加。杀虫真菌大部分是兼性或专性病原体，它们的生长和繁殖在很大程度上受外界条件的限制。近20年来，真菌的生理学和生态学方面的研究取得了新的进展，使得杀虫真菌防治害虫的效果显著提高，成为微生物杀虫剂的重要组成部分。 一、基本特征和分类 杀虫真菌具有一般真菌的共同特征，由单细胞或者多细胞组成，缺少光合作用所必需的叶绿素，其营养方式是依靠分解有机物而吸收有机物供给的能量和营养物质。真菌具有细胞壁，是真核生物(eucaryote)，除少数真菌存在的游动孢子可以运动之外，是典型的不运动生物。大多数杀虫真菌由分枝状菌丝(hypha)组成，菌丝由发芽的孢子(spore)发育而来，许多菌丝在一起组成菌丝体(mycelium)。真菌主要依靠孢子繁殖，孢子既有可能是无性孢子，又有可能是有性孢子。,真菌因为有细胞壁，在延续200多年的两界分类系统中，一直把它归于植物界。近来生物的界级分类经历了多次修改，目前虽无定论，由于真菌非常独特，把它们作为一个独立的界已无争议。Ainsworth(1973)提出把真菌分为两个门:一个是粘菌门(Myxomycota)，其特点是菌体为原生质型(plasmodialforms)，另一个是真菌门(Eumycota)，为非原生质型，主要是菌丝。杀虫真菌分属于真菌门的五个亚门(表5一1)。这五个亚门是:鞭毛菌亚门(Mastgomycotina)、接合菌亚门(Zygomycotina)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和半知菌亚门(Deuteromycotina)。杀虫真菌绝大多数是属于半知菌亚门和接合菌亚门。接合菌亚门的杀虫真菌主要存在于接合菌纲(Zygomycetes)的虫霉目(EntomophoraIes)，子囊菌亚门的杀虫真菌主要在核菌纲(Pyrenomycetes)的球壳目(Sphaeriales)、虫囊菌纲(Laboulbeniomycetes)的虫囊菌目(Laboulbeniales)，半知菌亚门的杀虫真菌则主要在丝孢菌纲(Hyphomycetes)的丛梗孢目(Mon山ales)。在粘菌门中没有发现杀虫真菌。 二、生殖方式 真菌有多种多样的生殖方式，包括无性生殖(asexual)、有性生殖(sexuaI)和准性生殖(parasexual)。无性生殖通常是由菌丝产生不动的经常脱落的分生孢子(conidium)，或由菌丝直接出芽产生芽生孢子。在产生分生孢子的时候，菌丝或特化成分生孢子梗(conidiophore)，或在分生孢子盘(sporange)或分生孢子器(pycnidia)中产生分生孢子。分生孢子不动，但比较轻，很容易被风或其它媒介传播出去，接合菌亚门的真菌产生的分生孢子还可以被弹射出去。有更多的机会接触到宿主。无性生殖在半知菌亚门中是常见的生殖方式，但在担子菌亚门中不普遍。,半知菌的孢子类型 bl。芽孢子 bo 簇生芽孢子 sy 合轴孢子 al 粉孢子 an 环痕孢子 ph 瓶梗孢子 mb分生芽孢子 ar 节孢子 ma 分生节孢子 po 孔出孢子,有性生殖产生有性孢子，有性孢子的形式复杂，常常是鉴定一个亚门的重要特征。鞭毛菌亚门的真菌产生能运动的游动孢子(zoospore)，其有性生殖过程是:两性游动的配子(ametes)融合后发生核联合，或者是运动的雄性配子与大的不动的雌性配子融合，即卵式生殖(oogamy)。在许多其它真菌中，有性生殖是通过分化的菌丝分枝融合而发生的，这种菌丝的分枝又称为配子囊(gametangia)，雌性配子囊叫卵囊(oogonia)，雄性的叫精子囊(antheridia)，雌雄配子囊在大小上可能差别很大，卵囊中包含一个到几个卵，在受精之后变成厚壁的卵孢子(zygospore)。在接合菌中这种厚壁的卵孢子是通过形态上难以区别的配子囊融合而产生的。子囊菌亚门和担子菌亚门的真菌通过把不运动的小分生孢子(microconidium)或不动的精子(spermatium)转移给受体菌丝而发生有性的融合，但是在许多其它真菌中有性融合发生在没有分化的菌丝之间。子囊菌亚门在核融合之后，通过减数分裂和常规的有丝分裂形成8个单倍核，在囊中或子囊中发育成孢子。在担子菌亚门中，核融合发生在一个特优的细胞-担子(basidium)中，每个单倍体核进入担子的突出部分产生担孢子。许多真菌在有性生殖时，由一个孢子产生的菌丝或菌丝段(thallus)同宗配合进行有性生殖，有些则为异宗配合。总之，在有性生殖中需要两个不同的菌丝相互配合。,有性孢子 A一种雕蚀菌的游动孢子 B游动孢子与藏卵器配合 C精子配合 D-H虫霉的接合孢子及假接合孢子,A虫草的子囊及子囊孢子；B球囊菌的子囊孢子球； C多腔菌的子囊和子囊孢子；D粉剌座壳孢的子囊和子囊孢子；Enectra flammea的子囊和子囊孢子,准性生殖在半知菌中较为普遍，这种生殖方式是以与有性生殖不同的形式获得有性生殖的利益。不同的是准性生殖不在生活史的同一阶段发生核配和质配。 准性生殖和有性生殖一样，进行基因重组，发生遗传变异产生新的菌株，两者的过程一样，即质配、核配和单倍化。两者根本区别在于准性生殖是在体细胞内进行核融合，而不是在特定的细胞(如担子、子囊、配子囊等)和器官内进行，细胞内既可有单倍体核，也有二倍体核，还可能有非整倍体核。准性生殖二倍体的单倍化不是通过减数分裂，而是在普通有丝分裂过程中通过染色体逐步丢失行为来实现的。,两个具有异型核的分生孢子产生接合管，相通后，一个细胞核进入另一个孢子内和其中的一个核结合，形成一个二倍体的合子，接合后空腔的孢子壁自溶消解。,三、真菌入侵昆虫的机制 (一)入侵过程 虫生真菌主要通过表皮侵染寄主，致病过程分为10个阶段。分生孢子附着表皮；分生孢子在表皮上萌发；穿透表皮；菌丝在血腔中生长；毒素的产生；寄主死亡；菌丝侵入寄主所有器官；菌丝穿出表皮；产生侵染单元；侵染单元扩散。 真菌对宿主的感染开始于孢子(分生孢子、子囊孢子、游动孢子)，也有例外的，感染性单位可以是芽体(propagules)或菌丝段。从大的方面讲，入侵的全过程主要包括:(1)穿透前感染性单位与宿主表皮的相互作用；(2)穿透；(3)在宿主体内定居。 虫生真菌对宿主的入侵能力，取决于分生孢子在表皮上的萌发能力、芽管的穿透能力和抵御宿主昆虫免疫系统阻止真菌生长能力之间复杂的相互关系。因而入侵涉及到附着、萌发、穿透和在体腔里增殖等过程。试验证明在发生入侵之前就已进行了酶解作用。例如入侵一开始，用组织化学方法可从感染昆虫表皮中提取到蛋白酶，这项研究就证明真菌入侵过程中的酶解作用。根据超微结构观察，在表皮中入侵菌丝周围和前进的方位发生片层(lamellae)结构解体，但旁边依然还有清楚的片层存在，认为酶的降解是广泛的，但一般是局部的，侧向生长的菌丝迫使原表皮的片层发生移位，这说明了入侵时有机械作用，基于此，一般认为虫生真菌对宿主的入侵是酶的降解作用和芽管的机械压力联合完成的。,绿僵菌的入侵过程,绿僵菌和莱氏野村菌的附着孢及入侵钉,附着胞（下方）,附着胞上的入侵钉,附着胞（下方）,入侵钉,(二)穿透前的过程 1粘附(adhesion)。 粘附过程可分为三个连续的阶段:(1)真菌的繁殖体附着到表皮上；(2)萌发前繁殖体与表皮联接或固着；(3)真菌在表皮上萌发和生长直到伸出侵入丝(penetrant pegs)。 附着(attachment)一开始就涉及到真菌繁殖体和宿主表面的电荷和疏水力，这种非特异性的反应能坚持足够长的时间，允许特异性联结反应的发生。特异性联结被认为是小范围的立体化学反应。表面抗体、糖蛋白、几丁质酶、蔗糖等，以及表面营养物质的存在，可以使真菌的附着由被动变主动，进入固着阶段。 一些虫生真菌如：虫霉、蜡蚧轮枝孢及被毛孢等的孢子外被粘液层，可粘附在昆虫体壁上，白僵菌、绿僵菌、莱氏野村菌等孢子都有一个干燥的疏水表面，但孢子表面和体壁均具有亲脂团，能与寄主极其疏水的体壁表面相互作用。 Fargues（1984）认为，吸附一开始就与孢子与寄主表面的电荷有关，由于表面的电荷不一致，因之粘附和侵染都只发生在体壁的某些部位。 有人提出宿主外表皮的一些化学物质能被动地刺激分生孢子活化。分生孢子通过产生一些酶和分泌一些粘性物质而附着在表皮上。使粘附由被动转为主动。 最近有人报道白僵菌的分生孢子落到大蜡螟的外表皮时，在其萌发前产生了酯酶、脂肪酶和N-乙酰葡萄糖苷酶的活性。这些酶对附着过程是重要的。也有人研究了分生孢子在宿主外表皮上的粘着强度。将穗霉(Nomuraea rileyi)的分生孢子散在梨豆夜蛾(Anticarsia gematalis)幼虫身上，经过2h3h1SDS沸水处理，仍然维持很强的附着性。但是用非病原性真菌的分生孢子污染幼虫，经同样的处理，其分生孢子则很容易从幼虫表皮上脱落。,2萌发(germination)。 杀虫真菌的毒力与孢子的萌发和生长速率有关，但萌发和生长速率又在较大程度上受外界条件的影响，如营养、水份、氧、pH值和温度等;还受昆虫表皮的一些毒性成分的影响，如酚、短链脂肪酸等。许多杀虫真菌显然需要从宿主表面获得的水溶性外源养分来维持萌发和发育。通常杀虫范围宽的真菌，可以利用多种非特异性碳源和氮源，其中包括表皮里的氨基酸;而有些真菌由于不能利用表皮上含量最多的脂类物质而不表现出致病性。在适应和利用表皮类脂的过程中，有些真菌诱导产生的有关酶能通过-氧化和氧化途径在大多数微生物不能利用的碳水化合物上生长。多数虫生真菌都需要外源性营养供孢子膨大和形成芽管用。宿主范围很窄的真菌要求孢子萌发的条件更苛刻,甚至不同菌株的发芽习性都有区别。 发芽能否成功，不仅决定于菌物利用可用营养的能力，而且也决定于它们对有害物质的耐受力。同时在一些分生孢子的外壁上还存在有可观的表皮分解酶的活性，在孢子发育前这些酶的水解作用可提供营养供孢子膨大用。 宿主表皮成分，不仅对分生孢子的吸附有重要作用，而且对分生孢子的芽管的萌发有刺激作用，并能为其生长提供营养。试验证明N-乙酰氨基酸葡萄糖苷酶、儿丁质、淀粉、长链脂肪酸等都能刺激白僵菌分生孢子的萌发，而简单的碳源和氮源或者两者混合起来都不能刺激分生孢子的萌发。用硅胶柱层析对外表皮的粗提物进行层析分离并作体外测定发现，淄醇，甘油二醋和极性脂类物质所刺激的萌发率与原始提取物类似。,3适应穿透表皮结构的形成。 杀虫真菌对昆虫表皮的穿透常常涉及到一系列器官结构的分化。例如萌发管产生一个附着胞(appressorium)位于表皮的表面，感染栓(peg)的形成，在表皮内面入侵丝(penetran thyphae)以及在原表皮中入侵盘(penetrantplate)的产生等。这些结构是真菌为了克服宿主的防卫屏障而产生的。附着胞能集中机械和化学能于一个很小的区域，从而有效地实现入侵的过程。附着胞是一个以大量粘液分泌物集中的吸附位点，可以为窄小的感染栓提供一个产生机械力的支点。其产生是由于芽管的极性生长受到破坏而在顶端形成的膨大体。由于附着胞产生表皮降解酶，在与宿主建立营养关系中起重要作用。附着胞适应于分泌功能，细胞壁上有孔，有利于酶和粘液在细胞之间通过。附着胞内含有大量的线粒体、高尔基体、内质网和核糖体，穿透表皮正是由此发生。 至今人们还没有系统地研究昆虫病原真菌附着胞分化的分子机制。但是研究了影响入侵的过程，包括对刺激的反应、分化信号的传递、大分子生物合成的激活，以及不同基因的表达等。绿僵菌的幼殖体(gerrmlings)有许多膜结合的细胞受体系统，例如，GPT调节的腺苦酸环化酶、酪氨酸蛋白激酶、丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶、磷蛋白磷酸酶和ATP酶等。这些受体系统可以改变第二信使的水平。或者它们本身被第二信使激活从而引发分化(图)。有人提出可塑性菌丝的顶端变形而产生跨膜电位的变化，扰乱了与细胞壁合成有关的顶端钙离子梯度，随后不同的Ca2+在细胞膨大区域的重新分配,导致芽管扩张，这种扩张过程是均一分散的细胞壁合成产生初级细胞壁，由于初级细胞壁膨大区域内部膨压作用而引起芽管膨大。改变病原体内细胞中的Ca2+和cAMP，研究表明，cAMP可以加强细胞中钙离子的局部变化，在分化过程中cAMP的浓度有了明显增加。cAMP在决定外部分化时起介导作用，例如压迫真菌可以提高cAMP的浓度，由cAMP激发的粘液分泌可以促进吸附。感染结构的形成还需要DNA合成和核分裂，以及阶段性特异性mRNA和蛋白质的合成。 （三）穿透 虫生真菌成功地穿透宿主体壁的过程，是入侵的首要条件，这取决于穿透体壁的芽管的粘附能力和宿主的生理状态。穿透过程要靠芽管机械作用和酶的活性。在金龟子绿僵菌附着胞的下面常可见蜡质层已消失，而在白僵菌的芽管周围有孔洞出现，这些都是酶的作用。然而有时机械作用也很明显，某些虫霉在侵入寄主时，往往在表皮上形成三岔或四岔的缝。,组织学研究显示穿透涉及到体壁层的溶解。化学试验表明昆虫体壁的消化需要蛋白酶和几丁质酶共同作用，但是这些研究所使用的酶都是商品制剂，而不是从芽管中直接抽提出来的。许多病原性半知菌能产生细胞外的蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶。目前这些酶在穿透过程中所起的作用还不太清楚。许多研究中所鉴定的酶都是从营养生长的菌丝中分离出来的，而不是从芽管中分离出来的，而且在酶的活性和病原性之间