蓝白斑实验汇总.doc

什么是蓝/白斑筛选，怎么进行蓝/白斑筛选载体pGEMZ在-半乳糖苷酶（lacZ）的-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的-肽互补细菌，具有-半乳糖苷酶的片段，所得功能-半乳糖苷酶（-肽加片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ的多克隆区域，克隆上插入片段导致-肽编码区的破坏，使-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因-半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109， DH5），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物； b-半乳糖苷酶与Xgal显色反应是通过b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝； lacZ的a肽互补：a-肽（ lacZ ）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ突变（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。如受体菌株JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a等。而pUC质粒载体上的lacZ 编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体的a-肽，故能分解Xgal。产生蓝色物质。 a互补的插入失活：pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。 IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZa肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生a肽。 IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑，MCS有插入时，不互补，白菌斑（见下图）。异丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物 X-gal 还可充作生色剂，被 -半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色你的空载提转进去的话，IPTG诱导lacZ 表达肽，互补体内缺陷的酶，然后可降解底物X-gal，产生蓝斑；如果你则载体的多克隆位点插入了片段，导致编码的肽错误，或者不能编码肽，也就不能产生正常功能的酶，无法分解X-gal，所以长白斑。互补人们发现lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做互补（-complementation）。 -互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷 -半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ） ，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。 在 lacZ 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZM15 放在 F 质粒上, 随宿主传代； lacZ 放在载体上, 作为筛选标记。相应的受体菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均带有 D （lac - proAB）F proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 为 lac 阻抑物的编码基因，lacIq 突变使阻抑物产量增加，防止 lacZ 基因渗漏表达。 lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。 乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。异丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作