包封率的测定方法.docx

1. 凝胶柱层析法(盐酸小檗碱固体脂质纳米粒的制备)其原理是运用分子筛效应:一个含有各种分子的样品溶液流经色谱柱时,各分子在柱中进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和和无定向的运动。大分子物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布在颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,在向下移动的过程中,从凝胶内扩散到间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断的进入和扩散,小分子物质的下移速度小于大分子物质,从而使样品中分子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子最小的最后流出,这种现象为分子筛效应。固体脂质纳米粒混悬液中的游离药物可以渗透到凝胶孔穴中而晚些被洗脱出来,固体脂质纳米粒由于粒径较大,不易或不能进入凝胶内部,因此优先被洗脱出柱。采用凝胶柱层析法分离 BH-SLN 与游离 BH，RP-HPLC 法测定包封率与载药量。 1.1 BH-SLN 与游离 BH 的分离 纳米粒与游离药物的分离以凝胶层析柱为分离介质，采用梯度洗脱技术进行分离。 1.1.1 分离条件 层析柱: Sephadex-G50 葡聚糖凝胶柱(1cm25cm)；上样量 0.5ml；梯度洗脱条件：pH7.4PBS溶液洗脱，洗脱速度为 1mlmin-1。 1.1.2 分离方法 (1) Sephadex-G50 葡聚糖凝胶预处理 称取4g葡聚糖凝胶G-50于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时。倾泻烧杯除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3-4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。(2) 层析柱制备 a. 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250ml烧杯。向层析柱内灌洗脱剂PBS，打开出口螺旋夹，层析柱无渗漏，出口乳胶管通畅。 b. 排气泡：保持柱内一定的水位，排气完毕，保留柱内1-2cm高水位，关紧螺旋夹。 c. 标记高度：在距顶端8-10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15-17cm）的依据。 (3) 装柱 用50ml烧杯取溶胀的凝胶悬浆25-30ml，静置片刻，凝胶沉淀与水的体积之比为1:1。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内没有气泡和断层，柱床表面平整。 (4) 平衡 取15ml洗脱剂PBS，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，清洗内壁使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，使胶床高度15cm，关闭出水口。 (5)上样与收集 打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.5mlBH-SLN液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集，每管收集洗脱液2ml。采用自动部分收集器每1min分段收集洗脱液,分别测定在345nm处的光密度值,作洗脱曲线。载药纳米粒和药物的洗脱曲线见图1-5。结果显示，载药纳米粒可以和游离药物达到良好分离。 (6) 层析柱再生处理 把凝胶倒出，用 6mol/L 脲浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。 1.2 包封率、载药量测定 采用 RP-HPLC 法测定包封率和载药量。 取0. 5 mlBH-SLN经上述凝胶柱分离,将分离出的游离药部分用0. 2m微孔滤膜过滤,采用RP-HPLC方法,分别测定总BH-SLN和游离BH-SLN的包封率和载药量。按照中国药典(2005版)固体脂质纳米粒包封率的计算公式计算包封率，包封率(ER,%) =W总-W游/W总100 %。式中W总表示总药物含量，W游表示游离药物量。载药量(DL,%)=W总-W游/Wc100 %。式中Wc为混合脂质用量。2. 低温超速离心法(伊曲康唑固体脂质纳米粒的研究) 通过改变g值可以分离各种类型纳米粒混悬液中游离药物。用0.1mol/L盐酸调节固体脂质纳米粒混悬液pH至1.2。使固体脂质纳米粒絮凝,离心,纳米粒在离心管底部,上清中含游离药物,使游离药物和固体脂质纳米粒分开。 量取ITZ-SLN混悬液适量,加0.1mol/L Hcl调至pH约1.2,使纳米粒絮凝,然后于4超速离心(15000r/min)15min,将上清液定量稀释;另精密量取ITZ一SLN适量,加甲醇破坏后,用甲醇定量稀释,然后采用紫外分光光度法于262nm处分别测定上清液和总药的吸收度,计算伊曲康唑的浓度,按下式计算药物包封率:3.透析法该法是将固体脂质纳米粒装入透析袋中,在室温条件下,不断更换外部介质,在10-24h内可除去95%以上的固体脂质纳米粒中的游离药物。此法的优点是不需要复杂昂贵的设备,能除去几乎所有的游离药物。称取一定量的ITZ-SLN冻干粉,以加入等量水溶性赋形剂、调解等渗的20%乙醇溶液为水合介质水合至100ml,即时取样2ml破乳定容至I0ml,UV法测定总药物浓度C总,共取3份测定,取平均值。以此纳米粒混悬液为外相,取3个透析袋,分别移取20%乙醇2ml等渗液,置于其中作为内相。同时以磁力搅拌器搅拌,达到平衡时间(6h)以后,分别取各透析袋内透析液20ml,用20%乙醇等渗液稀释1倍,UV法测定,计算游离药物的浓度,算得各透析袋所测浓度的平均值C游,纳米粒的包封率(EE%)为:EE%=(50