《核酸的制备》PPT课件.ppt

核酸的的制备2 核酸样品的分析与检测,一、凝胶电泳-Gel electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳 变性琼脂糖凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,1，琼脂糖凝胶电泳 一般性检测采用琼脂糖凝胶电泳：SAGE-submerged agarose gel electrophoresis 核酸样品从负极向正极移动。 Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction.,在中性pH条件下，核酸带负电荷，主要来自磷酸二酯键骨架上的磷酸基团。 Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due to the phosphate groups on the phosphodiester backbone.,样品的分离效果与凝胶基质的孔隙度有关。随DNA分子增大，凝胶浓度应降低。 琼脂糖凝胶可以分离长度为100bp至60kb的DNA分子。 核酸染料溴乙锭。紫外线观察。 The degree of separation depended on the porosity of the matrix.,影响泳动率的因素： 包括分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。 颗粒带电荷的密度越大，泳动速度越快。 颗粒物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。,对于线性双链DNA分子，在凝胶电泳中，相对分子质量的常用对数与泳动率成反比关系。 利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，可以方便准确地测定DNA片段的分子量。,构型相同、但相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样，在电泳过程中可以彼此分开。 相对分子质量相同的DNA分子如果它们的空间构型不同，其迁移率也不同。 质粒DNA存在闭环（型，CC）、单链开环（型，OC）和线性（型，L）三种构型，三者之间的迁移率一般为型 型 型,以pUC19质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA, 简称cccDNA）、共价闭合环状质粒DNA一条单链断裂的开环质粒DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）、共价闭合环状质粒DNA两条单链断裂的线性质粒DNA（linear DNA, 简称L DNA）三种构型。 电泳时cccDNA移动最快，其次为线性DNA，开环质粒DNA最慢，所以电泳结果为三条分开的带。 限制性酶切的质粒DNA为线性分子。,M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2 3.5 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83,M：DNA相对分子质量标准物（marker）； 1：pUC19质粒DNA经EcoR完全酶切； 2：pUC19质粒DNA经EcoR部分酶切； 3：未酶切的pUC19质粒DNA，提取结果好时，为一条带，以超螺旋质粒DNA为主，有时结果为三条带，从下向上分别为超螺旋质粒、线性质粒和开环质粒。,通常采用的缓冲体系有3种：Tris.乙酸（TAE）、Tris.硼酸（TBE）和Tris.磷酸（TPE）。 TAE缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为碱性，阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。,琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低，但它操作简便、应用范围广、适合于较大分子的分析。 DNA分子在电泳后短时间内位置可以保持不变，该技术已成为DNA、RNA分离和检测的重要手段。 TBE与TPE均有较强的缓冲能力，但从TPE凝胶回收的DNA片段中含有较高的磷酸盐，容易与DNA一起沉淀，进而影响一些酶反应，如限制性酶切反应。,不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNA分子的有效范围 （指能够清楚地分开）,2，变性琼脂糖凝胶电泳 RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可以按大小不同而相互分开。 变性指利用变性剂破坏RNA的二级结构，消除二级结构对电泳迁移率的影响，使RNA分子的泳动由分子大小来决定。 常用的变性剂有甲醛、乙二醛和二甲基亚砜等。,变性凝胶也可以检测DNA分子的碱基变异： 恒定变性凝胶电泳，CDGE 瞬时温度梯度凝胶电泳，TTGE 温度梯度凝胶电泳，TGGE,3，脉冲场琼脂糖凝胶电泳 大分子DNA在电场作用下挤过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行，这样才能通过凝胶。 这时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别，不能达到分离的目的。,当电场方向改变时，电场内的DNA分子构象也发生改变，并重新定向，沿新的方向伸直. 其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖于分子大小。 DNA分子越大，这种构象改变需要的时间越长。,在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在两个不同方向的均一或不均一电场中不断随电场方向改变分子本身的构象，并挤过凝胶。,DNA分子构象改变时间小于脉冲电场周期，DNA分子便可以按其分子大小，得到较好的分离效果； 反之，DNA分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶中DNA分子松弛变形与电场更替时间不相等，达不到分离目的。,Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE Field inversion gel electrophoresis, FIGE, 电场倒转凝胶电泳 Contour-clamped homogeneous eletric field gel electrophoresis, CHEF, 钳位均匀电场电泳 六边形排列的点电极，长而平行的电极对形成匀强电场(夹角120)。,4，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸胺和加速剂TEMED的作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶可分离5-500bp的小片段DNA分子，所以手工测序一般只能读出500个碱基。,聚合时，由丙烯酰胺单体聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成不溶于水的凝胶。 根据待分离物质的分子大小，应选用合适的凝胶浓度。,被分离物质与凝胶浓度之间的关系,最常用的蛋白质分离体系为pH8.9的碱性缓冲液体系. 因为大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中性，在pH8.9的碱性缓冲体系中带负电荷，向正极移动。,在有些情况下，需要在缓冲体系中加入解离剂，将分子内的非共价键破坏，这种体系称为解离体系。 常用的解离剂有SDS、尿素等，它们同时也是某些蛋白质（如膜蛋白）的促溶剂。 解离剂可以减弱分子空间构象的差别，有利于了解分子的大小与迁移率之间的关系。,PAGE分为连续电泳体系和不连续电泳体系。 连续电泳体系指整个电泳体系中的缓冲液、pH值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。,不连续电泳体系中，除了电泳槽中的缓冲体系和pH值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，该体系主要用于蛋白质样品的分离。 不连续电泳体系制胶比较麻烦，但它对样品有高效浓缩效应，可以大大提高分辨能力。,蛋白质分子的分离鉴定采用不连续电泳体系进行，在电泳时除具有电荷效应和分子筛效应外，还有浓缩效应。 浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶pH为6.9。,在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一狭小的中间层，并按其蛋白质所带负电荷量多少依次排列成带。 浓缩的样品进入分离胶后，胶的孔径变小，pH值升高，电场强度恒定，蛋白质的分离取决于它们的电荷性质、分子大小和形状。,SDS-PAGE可用于蛋白质分子量的测定 SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆分成亚单位，变成线状，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应，只有分子筛效应，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量对数呈线性关系。,用于核酸分离的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是连续体系，主要分离较小的核酸（5-500bp），迁移率与分子大小和构型（如线性、缺口环化、超螺旋）有关。 如果样品中所有的DNA分子均为线性分子，可用迁移率比较其大小（以标准核酸片段作标准对照）。,核酸序列测定采用以尿素为解离剂的聚丙烯酰胺凝胶。,二、核酸的序列测定 DNA sequencing 基本原理：将DNA的序列测定转化为DNA片段的长度分析。,1，化学法测序-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing Allan Maxam and Walter Gilbert （1977） 用化学物质在特定碱基位置断裂DNA分子，产生总体上只差一个碱基的一套DNA片段。 chemicals are used to cleave the DNA at certain positions, generating a set of fragments that differ by one nucleotide.,DNA片段的一条链在5端用32P标记。 然后进行特定的化学修饰。 将修饰的碱基从脱氧核糖分子上除去后用哌啶断裂（piperidine）。 The reaction conditions are chosen so that,on average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA molecule.,化学法使用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链； 通过四组不同的特异反应，就可以将末端（3-或5-端）带有放射性标记的DNA分子切成不同长度的寡核苷酸片段。 这些寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的切点到标记末端之间的长度。,用分辨力极高的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些不同长度的寡核苷酸片段分离开来并进行自显影。 在四组反应中，整体上相邻的两条带仅相差一个碱基，由此可读出所测定的DNA的序列。,G反应 用硫酸二甲脂（dimethyl sulfate，简称DMS）使鸟嘌呤上的N7原子甲基化。 甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中性环境中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂。,G+A反应 用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，使糖苷键变得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。,T+C反应 用肼（hydrazine）使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。 C反应 当有NaCl存在时，只有C与肼发生反应，T不发生反应。断裂的C可用哌啶除去。哌啶也可使脱去碱基处的磷酸二酯键断裂。,上述四组反应中，应控制时间只让很小一部分碱基被修饰，这样在一种DNA分子形成的群体中，每个相关位点都有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。 但用哌啶切断链的反应必须是定量的。,反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（7mol/L尿素，8%胶）进行分析。 电泳时电压在4000V左右，凝胶的温度保持在65，以保证DNA在变性状态下进行电泳。 电泳完毕后，将胶抽干，进行放射自显影，从胶片上可读出DNA序列。,图 化学法测定DNA序列时的G反应（A）和化学法测定DNA序列图解（B）,2，酶法测序 Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing Frederick Sanger and Alan Coulson Klenow fragment, single-stranded DNA, a primer ddNTPs-dideoxynucleoside triphosphates dNTPs,-35SATP,用M13噬菌体载体制备单链DNA。 DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophage M13 to produce single-stranded DNA.,测序胶-6-20% polyacrylamide 7M urea which acts as a denaturant to reduce the effects of DNA secondary structure.,英国生物化学家F. Sanger（1918）第一个完成了胰岛素的氨基酸序列测定。 19世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基酸。 到了20世纪初，科学家发现蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的长链，1940时基本弄清了组成蛋白质的20种不同氨基酸，但对于这些氨基酸在蛋白质中如何排列一无所知。 Sanger从1945年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了牛胰岛素所含的51个氨基酸的排列顺序，于1958年获得第一个诺贝尔奖。,双脱氧法（dideoxy method），也称酶法（enzyme method）或链终止法（the chain termination method），由Sanger于1977年建立。 以35P、35S替代32P作为标记物。 该方法的原理是利用2,3-双脱氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP，dideoxynucleotide ）来终止DNA的复制反应。,DNA聚合酶（如Klenow片段）在DNA复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸被连接在延伸链的3-OH上； 如果掺入一个2,3-ddNTP，延伸反应就会停止。,根据这一原理设计四组反应，每组反应中都含有: 正常的四种脱氧核苷酸dNTP（其中一种带有32P标记） 单链DNA模板（即待测DNA，一般通过M13丝状噬菌体制备） DNA聚合酶I 引物（可以根据载体序列人工合成） 另外每一组反应还加入一种2,3-ddNTP。 也可以标记引物或ddNTP.,以A管为例，凡聚合反应进行到模板的T碱基时，2-dATP和2,3-ddATP都有可能掺入. 如果掺入2-dATP，聚合反应可以继续进行。 如果掺入2,3-ddATP，链延伸反应即告终止，这样在反应产物中就会产生末端为A的单链DNA片段群体。,将四组反应产物用凝胶电泳进行分析，在整体上四个泳道中自显影产生的相邻条带只有一个碱基的差异，由此可读出DNA的序列。 应用35S标记的dNTP替代32P标记的dNTP，电泳图谱更加清晰，分辨力更高，每次实验可以读出更多的碱基序列。,目前双脱氧测序反应一般利用双链DNA模板通过聚合酶链式反应进行，并采用四种不同颜色的荧光素分别标记四种双脱氧核苷酸。 这使得四组测序反应可以在一个Eppendorf管进行，分析时通过毛细管电泳在DNA自动测序仪即可读出相应的DNA序列。,基本的原理为DNA聚合酶不能区分dNTP和ddNTP，一旦ddNTP被作为底物连接至新生链，DNA的延伸合成会终止，从而产生单链的DNA片段； 由于存在很多模板分子，以及dNTP和ddNTP连接的随机性，DNA合成反应可以在任一碱基位置终止。 经过一段时间后可得到一个不同长度的单链DNA群体，电泳时它们可以按大小分开，并且相邻条带之间仅差一个碱基。 从胶的下面开始向上可以读出DNA分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置产生的片段越小。,链终止法中用于测序的DNA聚合酶必须满足3个条件： 高酶活性，即与模板结合能力强，可合成足够长的DNA单链； 无53外切核酸酶活性，53核酸酶活性可将新合成的DNA链的5端除去，改变合成产物的长度，给顺序的阅读造成误差；,无35外切酶活性，原因与相同。 所以用于测序的DNA聚合酶都经过了人工的修饰。 第一个用于测序的DNA聚合酶为Klenow片段，不具有53外切酶活性，但仅能合成长约250个核苷酸的DNA分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会形成一些阴影条带，说明有许多终止反应由酶活性造成。 现在广泛采用的DNA聚合酶由T7噬菌体编码，又称sequenase，即测序酶。Sequenase工作效率高，无外切酶活性。,链终止法测序时可通过以下几种方法制备模板： 插入质粒载体的双链DNA，可以采用碱变性或热变性使双链DNA变为单链，能够进行双向测序； 用M13载体制备单链DNAM13载体是根据复制型M13基因组改进的双链DNA，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链模板，但只能制备小片段DNA；,用噬菌粒（phagemid）制备单链DNA噬菌粒含有两个复制起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自M13、fd等单链DNA噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同时含有噬菌粒和辅助噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制酶及外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒DNA复制，产生单链模板。 PCR产生单链模板两个引物中一个连接有很小的磁珠，可用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称PCR。,DNA聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有3核苷酸配对正确才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引物时不能起始复制的原因。 因为在缺少引物的情况下，聚合酶不能确定3核苷酸配对正确与否，无法确定下一步反应。 大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长1000-2000核苷酸，约需4000个引物。,3，光点测序（pyrosequencing） 焦磷酸测序涉及四种酶： DNA聚合酶（DNA polymerase） 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 荧光素酶(luciferase) 双磷酸酶(apyrase).,反应体系: DNA单链 测序引物。 dNTP 反应底物: APS (adenosine 5 phosphosulfate) 荧光素(luciferin),在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一; 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。,掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是dATP的替代物; 因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。,硫酸化酶 催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。 ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin) 的转化; 氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。,光信号由CCD摄像机检测。 每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。,ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 然后就可以加入下一种dNTP。,每次只加入一种dNTP。当反应液中发出亮点时，可知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。 如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会出现记录。 连续快速地依次加入，周而复始，随着链的不断延伸，相应的顺序也被阅读。,4，DNA芯片测序 将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的芯片上，每个点的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。 将待测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序进行对比组装，拼接成完整DNA顺序。,根据统计，可测DNA片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度为8个碱基，则其可能的排列顺序为48=65536，而可读的片段长度仅为65536的平方根，等于256bp。 即使一个芯片可容纳1048576个不同的10碱基寡聚核苷酸，可读片段长也仅为1kb。 如果要完成1Mb的测序，以20个寡聚核苷酸的数目计算，芯片需携带的组合数目将达1012，只有采用极微量的电子操作才能完成。,5，自动化测序 荧光标记物：用四种不同的荧光染料分别标记ddATP、ddCTP、ddTTP和ddGTP-四色荧光标记。 这4种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T、G标记的DNA单链。电泳分离的单链DNA条带通过监测仪时，发出不同颜色的荧光信号，由计算机读出碱基顺序。 自动测序的原理仍然为链终止法，但将4个反应合并为一个，在一个泳道中进行电泳。 最早文献：Smith LM et al., Nature, 1986, 321(674-679) 标记测序引物，FITC-A反应、Texas Red-C反应、TM-G反应、NBD-T反应，然后将四个反应体系混合，进行电泳分析。,ABI Big Dye使用的四种荧光标记 28162822 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 14,ABI Big Dye使用的四种荧光标记 28162822 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 14,ABI Big Dye四种荧光标记的荧光发射光谱 28162822 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 14,45004504 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 22,Structure of one of the four BigDye terminators, ddT-EO-6CFB-dTMR. The moieties from left to right are: 5-carboxy-dichloro-rhodamine (FRET acceptor), 4-aminomethyl benzoate linker, 6-carboxy-40 -aminomethyluorescein (FRET donor), propargyl ethoxyamino linker, dUTP.,毛细管电泳：用毛细管电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，可大大提高测序的速度。 人类基因组测序中使用的电泳装置有96个泳道（一束并列的充满凝胶的毛细管），每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，一天可完成近千次反应。 序列读取采用共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基顺序。 Fluorographic detection-荧光检测,6，RNA序列测定 尽管DNA序列分析技术已相当成熟，但有的时候也需要直接测定RNA的序列，尤其是对tRNA和rRNA分子中存在的被修饰的核苷酸位置的确定。 RNA序列分析的困难是RNA分子极易被RNA酶降解，有关RNA的实验都需要在十分严格的条件下进行。,首先将RNA分子的5末端进行标记，然后用专一性RNase断开特殊核苷酸的3端。 用适当的酶量和消化时间，可产生一个RNA片段梯度，相邻片段之间只有一个碱基的差别，PAGE电泳后即可读出RNA的序列。 RNase T1可在G碱基后断裂RNA分子； RNase U2可在A碱基后断裂RNA分子； RNase Phy M可在A和U碱基后断裂RNA分子； 芽孢杆菌Bacillus cereus RNase可在U和C碱基后断开RNA分子。,三、核酸的保存和定量 microgram-微克 nanogram-纳克 picogram-匹克,核酸定量一般采用260nm的吸收值（absorbance）进行。 Spectrophotometer-分光光度计,A260=1.0-50g/ml 双链DNA。 A260=1.0-40g/ml 单链DNA或RNA。 equivalent to a concentration of 50g/ml for double-stranded DNA, or 40g/ml for single-stranded DNA or RNA.,A260/ A280 ratio should be around 1.8 for pure DNA and 2.0 for pure RNA preparations. 小于以上数值说明有蛋白质污染，DNA样品该值如果大于1.8说明有RNA污染。,溴化乙锭（ethidium bromide）可以嵌入碱基之间，使DNA在紫外光下发出橙色荧光。 binds between the DNA bases (intercalates) and fluoresces orange under ultraviolet light. 通过比较样品DNA与分子量标准中相当条带的亮度可以估计DNA浓度。,在0.2M盐浓度下，加入2倍体积乙醇（ethanol）或异丙醇（isopropanol）可以引起核酸沉淀。 一般在-20进行，但这一过程与温度关系不大。,沉淀用TE（tris-EDTA）buffer溶解。Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸），-20保存。 EDTA：络合 镁离子，抑制DNA酶活性。,核酸的放射性标记（radiolabelling）-跟踪DNA分子和探针制备。 dNTP (deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸) labelled with 3H or 32P. scintillation counter-液体闪烁计数器 radioactive probes-hybridisation experiments,比活度（ specific activity ）：标记后单位质量核酸所具有的放射性活性。 追踪实验采用低比活度，探针制备采用高比活度。 for tracing purposes, a low specific activity will suffice , but for probes a high specific activity is necessary.,探针制备一般用 32P，可以发射高能量射线。 In probe preparation, the radioactive label is usually the high-energy -emitter 32P.,末端标记法-End labelling，-32PATP polynucleotide kinase-多核苷酸激酶：将ATP的末端磷酸基团转移到核酸分子的5羟基末端。 如果ATP被放射性标记，这一过程可以产生比活度相对较低的标记核酸，因为只有末端被标记。,切口平移法-Nick translation，-32PATP DNase DNA polymerase ,通过切口平移法标记DNA分子，可制备高比活的探针。 在镁离子存在下，用低限量的DNA酶处理双链DNA，使之产生切口。 大肠杆菌DNA聚合酶以此作为催化DNA合成的引物，将单核苷酸加到切口处的3羟基端。,由于大肠杆菌DNA聚合酶具有5 3外切酶活性，它可以从切口的5端除去核苷酸。 5端核苷酸去除与3端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，即切口平移。,如果用高放射性活度的核苷酸置换原有的核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数分钟g的32P标记的DNA，这样标记的DNA分子可用作杂交探针（probe）。,引物延伸标记法 Labelling by primer extension，-32PATP Klenow fragment，6核苷酸随机引物。 random oligonucleotide，usually hexadeoxyribo-nucleotide molecules, sequences of six deoxyribonucleotides.,将DNA分子加热变性，然后与随机引物退火。 由Klenow酶催化延伸反应，将放射性标记的核苷酸掺入DNA分子，得到高比活度探针。,用Pasteur pipette柱可将标记探针与剩余底物分开。 非放射性标记 Non-radioactive methods-fluorescent label Digoxin化学发光 生物素、荧光素,大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）： 1956年，Kornberg首先从大肠杆菌细胞中分离出此酶，它是由单一多肽组成的球蛋白，分子量为10.9104 D（道尔顿）。 该酶具有以下三种不同的催化活性。,(1)53 DNA聚合酶活性 以单链DNA为模板，作化单核苷酸结合到DNA引物的3OH末端，沿53的方向按模板顺序合成DNA链。 5-CpCpGOH 3-GpGpCpTpApTpCpGpAp5 dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+大肠杆菌DNA聚会酶 5-CpCpGpApTpApGpCpT3 3-GpGpCpTpApTpCpGpA5,(2) 5 3 DNA外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶能从5端降解双链DNA，使之成为单核苷酸；也可降解RNADNA杂交体中的RNA成分。 5-CpGpCpApTpCpT