PCR技术在食品安全检测上的应用.docx

PCR技术在食品安全检测上的应用陈倩仪（广东第二师范学院 生物系，广东 广州 510310）摘要：介绍聚合酶链式反应（PCR）技术的原理、特点及其在食品微生物检测、转基因食品检验等食品工程领域的应用情况。关键词：PCR技术；检测；微生物；成分；转基因食品PCR（Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应，由美国PECetus公司人类遗传研究室的科学家K.B. Mullis，在1985年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法1，又称为多聚酶链反应、无细胞克隆技术等2。PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复循环而完成，是一个在特异耐热酶Taq DNA聚合酶的催化下完成的反应2。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。通过PCR技术可在数小时内将一分子的DNA成百万倍甚至上亿倍的复制，因而该技术在食品安全检测中具有很大的应用潜力3,4。本文将重点介绍PCR技术的基本原理，及PCR技术在食品微生物检测、转基因食品检验等食品安全检测领域的应用情况。1 PCR技术的基本原理PCR技术的反应原理与生物细胞内的DNA复制相似，但其反应体系更为简单。PCR是以需要扩增的目的DNA双链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶进行酶促反应，快速扩增特异DNA序列5。基本的过程6为: 以需扩增的DNA分子为模板，先高温变性，将混合物加热到94维持l530s，使模板DNA双链解旋成单链，然后逐渐降温退火，温度降到55，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，最后在引物、DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍。对于不同的扩增对象，如扩增DNA片断序列全知、半知或未知，相应的PCR参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别。将RFL P、Sequence、反转录PCR等技术与PCR技术相结合，就形成了众多的衍生技术，如：多重PCR、定量 PCR、竞争PCR单链构型多态性PCR、巢式PCR等7。这些技术的产生使PCR在食品安全检测方面的应用潜力更加广泛。一般PCR技术检测的主要步骤8为：运用化学手段对目标 DNA 提取；设计并合成引物；进行PCR 扩增；克隆并筛选鉴定PCR产物；DNA序列分析。2 PCR技术检测食品中微生物的应用2.1 利用PCR快速检测奶粉中阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌 ( Enterobacter sakazakii)是一种可寄生在动物肠道的食源性致病菌，相对于成人，新生儿更容易感染阪崎肠杆菌。该菌能引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎以及菌血症，甚至引起神经功能紊乱，死亡率高，并伴有严重的后遗症，因此在世界范围内受广泛的关注。在对新生儿感染阪崎肠杆菌事件的调查中可以发现婴儿奶粉是主要的感染渠道9，所以对婴儿奶粉中阪崎肠杆菌的检测十分重要。但国内外传统的检测方法都存在时间长、检测结果假阳性等突出问题。针对上述问题，陈珊珊9利用FTA滤膜与PCR技术相结合的方法建立了一套从婴儿配方奶粉中快速检测阪崎肠杆菌的方法，缩短了检测的时间，并提高了灵敏度，达到了7101 cfu/mL。而且此法可高效从样品中提取阪崎肠杆菌DNA，可有效消除PCR反应的抑制因子。研究中采用FTA滤膜制备模板，利用PCR技术检测配方奶粉中的阪崎肠杆菌，以确定检出限。结果表明：经过4h增菌后婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检出限为7 cfu/100g。可在6h内完成对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测，比传统检测方法缩短了1222h。叶应旺10等人针对时间长、检测结果假阳性的问题建立了阪崎肠杆菌快速检测法。研究根据阪崎肠杆菌中寡-1,6-葡萄糖苷酶基因设计引物建立PCR方法，并进行PCR反应的灵敏度、特异性实验以及模拟实际样品的最低检出限测定。结果为：纯菌检测灵敏度达102 cfu/mL，阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均为阳性，阴性对照菌株未扩增出特异性条带；单独接种阪崎肠杆菌和混合接种大肠杆菌（Escherichia coli）或沙门氏菌（Salmonella）的人工模拟污染奶粉样品中分别在增菌26h和28h时，阪崎肠杆菌均可以检出。2.2 利用PCR技术检测肉中食源性病原茵食源性疾病是通过摄食而进入人体的有毒有害物质所造成的疾病。近年来，食源性病原菌污染食品引起的食源性疾病逐年呈上升趋势，引起了人们的广泛关注。快速准确灵敏检测肉中食源性病原菌是保障肉类安全，防止食源性疾病爆发的重要手段。2.2.1 利用PCR技术检测肉中的大肠杆菌肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E. Coli）O157:H7是引发食物中毒的重要病原菌。据证实，编码O157:H7特异性O抗原的rfbE基因和编码H7抗原的fliC基因，它们的序列与其它细菌没有同源性，是它的特异性基因。Jay L.E. Ellingson11等人建立了快速检测牛肉制品中致病性大肠杆菌O157：H7的方法，检测限达10cf u/g。徐晓可12等人以大肠杆菌O157:H7的rfbE、fliC和eaeA基因为靶基因，设计了3对引物，建立并优化了多重 PCR体系 ，特异性扩增出三条片段，并采用3 0株常见的致病菌检测了多重P C R的特异性，能准确鉴别 O157:H7；同时对30份猪肉样品进行了检测，在干扰菌存在情况下，37培养6h即可检测出猪肉中菌量为1.4 cfu/mL的O157:H7。 2.2.2 利用PCR技术检测肉中的金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）是一种重要的病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。刘景武13等人利用FTA滤膜提取金黄色葡萄球菌DNA，并以其耐热核酸酶基因nuc为靶基因，经过PCR扩增得到279bp的产物，可在6h内完成猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉中金黄色葡萄球菌的检测，检出限为10 cfu/mL。Letertre14等人用RTQ-PCR法同时对食品中金黄色葡萄球菌的sea、seb、sec等九种肠毒素基因检测，此方法可以快速准确地鉴定肠毒素基因型。Hein15等以耐热核酸酶(nuc)基因设计引物来检测人工污染干酪中的金黄色葡萄球菌，其灵敏度为0.751023.2102 copies/g，其线性关系在0.9790.998之间。Ikeda16等根据sea和nuc基因设计引物，建立了脱脂奶粉中金黄色葡萄球菌的RTQ-PCR检测方法。2.2.3 利用PCR技术检测肉中的沙门氏菌沙门氏菌（Salmonella）是常见的食源性致病菌，也是食品安全与质量检测的一项重要指标。据报道，在沙门氏菌中用来设计PCR引物的基因主要分为3类，即特异性引物基因、血清群特异性引物基因和血清型特异性引物基因17。 石晓路18采用分子信标技术和TaqMan-MGB技术，建立了两种针对沙门氏菌的RTQ - PCR 检测方法，并初步应用于临床诊断和食品污染调查。两种方法检出限都达到了2 cfu/PCR体系。李光伟19等人采用沙门氏菌fim Y基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门菌的RTQ-PCR方法。其检测灵敏度为180cfu/ml，与国标法检出的阳性样本数基本保持一致，准确率达99.7%。丁孟建20等人对肉鸡源肠炎沙门氏菌进行了分离、鉴定和生物学特性观察，利用SS营养琼脂平板分离，经生化和PCR鉴定出26株肠炎沙门氏菌，分离菌株能将试验鸡鸭及小鼠致死，并能复制出与临床表现一致的病例。2.2.4 利用PCR技术检测肉中的志贺氏菌志贺菌(Shigella)是具有高度传染性的革兰氏阴性肠道致病菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。陈伟21等人以受志贺氏菌污染的猪肉为原料，比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SD法和改良的碱性异硫氰酸胍法四种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果，并以提取的DNA为模板进行PCR检测，结果表明改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好，猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5 c f u/g，检测所需时间少于8 h。胡建华22等人根据Gen Bank公布的志贺氏菌ipa H基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的DNA模板制备方法 ,以 SYBR Green 染料监控荧光变化的RTQ-PCR与常规PCR相结合，对培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌进行检测，敏感度可达到2 cfu/ml，检出时间小于20h，并且在210-1210-6 ng/L范围内具有良好的线性关系。2.2.5 利用PCR技术检测肉中的单核李斯特菌单核李斯特菌(listeria monocytogenes)是李斯特菌属中的一种，属于典型的胞内寄生菌，是一种可引起全世界范围内人畜共患和食源性疾病的致病菌。RTQ - PCR检测方法最常选择的靶基因是溶血素基因 hlyA，其它的靶基因包括iap、Dth-18、inlA及16SrDNA基因等23。翁文川24等人针对hlyA基因，设计特异的引物和TaqMan探针优化体系，建立了RTQ-PCR检测单核李斯特菌的方法，该方法检测底限为1 cfu/g，整个流程只需27h。魏建忠25等人应用PCR技术检测了120份猪肉样品，结果分离出2株产单核李斯特菌，阳性检出率为1.7%，整个检测过程只需2 4 h。Justin O Grady26等针对ssrA基因建立了一种快速检测诸如肉类等食物中李斯特菌的实时PCR方法，此法是一种新颖的快速诊断方法，能在30h内检出李斯特菌的浓度。2.2.6 利用PCR技术检测肉中的副溶血性弧菌副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）是一种嗜盐性细菌。主要来源于海产品，如墨鱼、海虾、海蜇等，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。副溶血性弧菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。该菌可引起急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便等。因此由副溶血性弧菌引发的食物中毒已成为最常见的食源性疾病之一。李晓虹27等针对副溶血性弧菌的不耐热溶血素（tl）、直接热稳定溶血素（tdh）和间接溶血素（trh）三个基因设计引物，特异性地扩增出副溶血性弧菌的450、269和500bp的三条片段，由于tl为副溶血性弧菌种属特异性基因，故此扩增具有高度的特异性，增菌8h后灵敏度达15 cfu/mL。2.2.7 利用PCR技术检测肉中的空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni, C. jejuni）是一种人畜共患病原菌，以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食源性病原菌，被认为是引起世界人类细菌性腹泻的主要原因。胡哲28等人根据空肠弯曲杆菌旋转酶基因gyrA的保守序列，设计了1对引物，特异性地扩增出此菌的192bp核苷酸片段，能快速检测鸡肉中空肠弯曲杆菌，检出限为8cfu/ml。3 PCR技术检测食品中掺假成分的应用3.1 利用PCR技术检测可可粉中的掺假成分可可粉是可可豆直接加工处理的可可制品，具有浓烈芬芳的独特香味，含有类黄酮等多种营养元素, 营养价值很高, 是制造巧克力的重要原料，也是当今世界3大嗜好性饮料之一。但目前我国的可可粉市场制假售假现象严重，在可可粉中添加外源植物源性成分是目前可可粉市场主要的假冒伪劣现象之一，最为常见的掺假物质有大豆粕、板栗壳、花生壳和芝麻粕，传统的可可粉检验检测方法是不能检出的。金永生29等人根据大豆粕、板栗壳、花生壳和芝麻粕所特有的基因片段设计引物，以高等植物18SrDNA基因为内参照基因，应用改良CTAB法抽提材料DNA，对分离的DNA进行PCR扩增并分析，建立了可可粉中这几种外源植物成分的快速检测方法。结果表明：该方法对大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳 DNA检测的敏感度分别可达82.5 pg/L、 32.5 pg/L、124 pg/L和157 pg/L。模拟样品试验发现，该方法的最低检测限分别达0.5%、0.5%、5%和5%。3.2 利用PCR技术检测肉制品的掺假成分在肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉冒充猪肉，以猪肉冒充牛羊肉等，用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，极大的损坏了消费者的利益和健康。对于肉类的来源，传统的方法是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行鉴别30，对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用。但对于很多熟肉制品（如香肠）来说，加入的肉都经过了粉碎处理，并添加了香料掩盖原有味道，传统的方法难以进行准确的肉类来源鉴定。孙艳华31等人建立了判别肉制品中肉类来源的PCR法，通过查阅国内外的相关文献，同时进行基因序列的对比，确定了市场上常见肉类猪、牛、羊、鸡的特异性线粒体序列的引物。同时对PCR法检测肉类来源的灵敏度进行了研究。结果表明，建立的方法仅需20mg的样品，最低检测限可达210-6g。腊肠是我国的传统食品，它以猪肉为原料，但随着猪肉价格的上涨，为了使制作成本下降，但腊肠中的蛋白质含量达到国家标准，部分不法生产厂家在腊肠的制作过程中掺入植物性蛋白成分。对此，覃芳芳32等人建立了应用PCR技术鉴别腊肠中植物成分的方法。通过前处理与酚仿抽提DNA的方法相结合，建立了一种快速简便的从腊肠中提取DNA的方法，整个DNA提取的过程需时2h左右，提取的DNA浓度和A260/A280均达到了PCR的要求。通过PCR分析，发现从腊肠中提取DNA完全可以进行PCR检测，而且该方法可定性检测腊肠中的植物成分。4 PCR技术对转基因食品检测的应用转基因食品（genetically modified foods, GMF）是利用现代分子生物技术，将某些生物的基因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变的食品。转基因生物直接食用，或者作为加工原料生产的食品，也统称为转基因食品。生活中最常见的几种转基因食品包括：西红柿，大豆，玉米，大米，土豆等。随着全球转基因作物种植面积的增加，随之产生的转基因食品更是琳琅满目，然而在转基因食品安全性尚无明确定论的情况下，转基因食品的检测技术便显得尤为重要。刘光明33等人根据转基因农作物中常用的花椰菜叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了2对不同的引物和相对应的2种荧光双链探针(FDCP)，分别建立了常规PCR、应用 FDCP的新型实时荧光 PCR 检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。试验结果表明，两种 PCR 方法均能有效检测出35S和NOS片段，其中常规PCR方法具有灵敏度高、特异性好的特点，应用FDCP的新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确。曹际娟34等人应用PCR技术对转基因（GM）玉米及其粗加工食品如：爆玉米花、热玉米棒、速溶玉米片中通常转入的基因构建元件35S启动子、NOS终止子和外源抗虫GryLA ( b)目的基因进行检测；对GM玉米的检测低限可达到0.1 %。5 PCR技术在食品检测领域应用的展望PCR技术在食品检测的实际应用中表现出灵敏度高、速度快、特异性强、简便、高效等特点。为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持，在食品致病菌、食品中有效成分、食品成分种类和转基因食品等方面的检测中具有重要的作用。但PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷，如：极少量外源性DN A引起的污染可能导致假阳性出现；实验条件不当引物产生突变；引物设计及靶序列选择不当可能降低灵敏度和特异性等。但相信随着生物技术的飞速发展，各项新技术与PCR技术的有机结合，以及PCR技术的进一步完善和发展，它必将会得到更加普遍的推广和发挥更大的效用，并在食品检测和研究领域开辟一个新的应用时代。参考文献 1 杨 宇, 朱定尔. 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