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药品质量检测技术,第六章 仪器分析,教学目标 1.掌握紫外分光光度法及可见分光光度法的 基本原理 2.掌握色谱法基本理论 3.了解分光光度法和色谱法在工业生产和科学研究 中的应用 知识要点 1.吸收光谱与物质结构的关系和光吸收基本定律 2.色谱法基本理论 技能要点 1.紫外-可见分光光度计的应用 2.GC、HPLC、TLC的基本应用,学习目标,第一节 分光光度法,一、概述 二、紫外-可见分光光度法 三、红外分光光度法,一、概述,分光光度法： 测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析的方法称为分光光度法。 主要包括:,紫外分光光度（电子光谱）法：吸收光波长范围200400nm，可用于物质的定性和定量分析。 可见分光光度（电子光谱）法：吸收光波长范围400760nm，主要用于有色物质的定性和定量分析。 二者合称为紫外-可见分光光度法即UV-ViS,红外分光光度法（IR，分子振-转光谱）：利用红外吸收光谱对物质进行分析的方 法，吸收光波长范围2.51000m，主要用于已知结构的有机化合物鉴别（定性）,二、紫外-可见分光光度法,光的基本特性 物质对光的选择性吸收 吸收定律 紫外吸收光谱的应用 紫外-可见分光光度计,光的基本特性,光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述： = c ； 波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常数：h=6.626 10 -34 J S ),光的波长越短（频率越高），其能量越大。,单色光：单波长的光（由具有相同能量的光子组成） 白光（太阳光）：由各种单色光组成的复合光,如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可成为白光，这两种颜色的光称为互补色光。,白光,绿 500-580,橙 600-650,黄 580-600,红 650-780,紫 400-450,蓝 450-480,青蓝 480-490,青 490-500,光的互补色示意图,物质对光的选择性吸收,物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果 而物质呈现的颜色则是被物质吸收光的互补色。,物质的吸收光谱曲线：,将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线）,吸收定律,吸光度：单色光通过溶液时被吸收的程度，用A表示。,朗伯（Lambert）和比耳（beer）分别于1760年 和1852年研究了光的吸收与有色溶液按液层的厚 度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析 法的理论基础。,如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为朗伯-比耳定律，得到：A=Kbc 此式为光吸收定律的数学表达式。,式中A称为吸光度； K是比例常数，与入射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因素有关。,吸收系数 A=Kbc中比例常数K称为吸收系数； 物理意义：单位浓度的溶液液层厚度为1 cm 时，在一定波长下测得的吸光度。 在药品检验的实际工作中，通常有两种表示方法：,质量吸收系数a 当c的单位为g/L，b的单位为cm时，K用a表 示，称为质量吸收系数这时朗伯-比耳定律为： Aabc。,在药品检验中经常使用的是百分吸收系数，用（E1%1cm）表示。 物理意义:当吸光物质溶液浓度为1%(1g/100mL) ，液层厚度为1cm时，在一定条件下的吸收度。,摩尔吸收系数 当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位为cm时，则用另一符号表示，称为摩尔吸收系数，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。其单位为L/molcm。这时朗伯-比耳定律就变为： Abc,紫外吸收光谱的应用,鉴别：同一物质在相同条件下，测得的紫外-可见吸收光谱应具有完全相同的特征。 对比吸收光谱特征参数 比较吸收度比值的一致性 对比吸收光谱的一致性 杂质检查：药物与杂质的吸收光谱有明显差别 含量测定：朗伯-比耳定律 对照品比较法 吸收系数法 计算分光光度法,紫外-可见分光光度计,仪器的基本组成部件,单色器,吸收池,检测器,显示,光源,一般由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示器（数据处理系统）五部分组成。,光源,单色器（分光系统） 包括狭缝、透镜系统（准直镜）和色散元件,吸收池（比色皿） 玻璃能吸收紫外光，仅适用于可见光区； 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和 可见光区； 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致） 为了消除误差提高测量的准确度，两只比色 皿应配套使用,检测器（又叫接受器、光电转化器）,信号显示器 早期使用的是检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等。 现代的分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及自动记录型装置和数据处理台（称为工作站）。,紫外-可见分光光度计的类型 单光束分光光度计: 常用的有751G型、752型、721型、722型。 双光束分光光度计 ： 常用的有710型、730型、UV-210型等。 双波长分光光度计 ： 与单波长分光光度计的主要区别在于采用双单色器。,T6新世纪紫外-可见分光光度计,红外吸收产生的原理与条件 红外光谱法的应用 红外光谱仪,三、红外分光光度法,红外吸收产生的原理与条件 原理：当分子中某个基团的振动频率和红外光的频率一致时，分子就吸收红外光的能量，从原来的基态振动能级跃迁到能量较高的振动能级。物质对红外光的吸收曲线称为红外吸收光谱。 根据试样的红外吸收光谱进行定性、定量分析和确定分子结构等分析的方法，称为红外分光光度法。,红外光谱产生的条件 红外光的能量应恰好能满足振动能级跃迁所需要的能量，当红外光的频率与分子中某基团的振动频率相同时，红外光的能量才能被吸收。 红外光与物质之间有耦合作用。分子必须有偶极矩的变化。,红外光谱法的应用 定性分析 研究分子结构：如确定分子的空间构型，求化学键 的力常数、键长和键角及未知化合物的结构鉴定等。,定性分析 官能团的定性分析、已知化合物的鉴定 官能团的定性分析,肯定法：根据红外光谱的特征吸收峰，确认某基团的存在。 如某化合物的IR谱，在官能团区1740cm-1有吸收C=O，在指纹区1300cm-11150cm-1范围内有两个强吸收峰CO，根据官能团区及指纹区的这三个相关峰：,否定法：基于某个波数区间内的吸收峰对某个基团是 特征的，在谱图中若无此吸收峰出现，则说明此基团 在分子中不存在。,已知化合物的鉴定 用标准试样对照 将试样的谱图与标准样品的谱图进行对照。 与标准谱图对照 在没有纯净的标准物质时，可用标准谱图比较。,未知物结构分析 未知物结构分析的一般步骤如下：,了解与试样性质有关的其他资料 了解来源 元素分析的结果 相对分子质量 熔点、沸点等物理性质和有关的化学性质 由元素分析结果和相对分子质量推算出分子式 计算不饱和度：,n11价原子数目 n33价原子数目 n44价原子数目,规定：双键(C=C、C=O)、饱和环状结构：=1；叁键(CC)：=2；苯环： =4。,分子结构式中达到饱和时所缺一价元素的对数，每缺两个一价元素时，不饱和度为一个单位,试样的制备和红外光谱的制作 被分析的试样应该是纯物质 纯物质可以通过对试祥进行分离和精制的方法(如分馏、萃取、重结晶、层析等)得到 根据试样的性质，按照试验条件制作红外光谱图,谱图的解析 首先观察官能团区，解析第一强吸收峰属于何种基团的特征吸收峰。 如，羰基(C=O)在1820cm-11600cm-1有强吸收峰，其中：,找出该基团的全部或主要相关蜂，包括该基团在指纹区的吸收峰，进一步确认该基团的存在。然后解析第二强峰及其相关峰。,确定分子中各个基团或化学键所连接的原子或原子团，以及与其他基团的结合方式，并结合相对分子质量、不饱和度以及其他仪器分析结果等有关资料，推测分子的结构。,与标准谱图进行对照 在相同的实验条件下操作，将得到的红外光谱图与标准谱图进行比较，若两张谱图吸收峰的位置和形状完全相同，峰的相对强度一样，可以认为样品与该种已知物是同一物质。,例 某未知物分子式为C8H8O，其IR谱如图所示，试推测未知物的分子结构。 解：(1)根据分子式计算不饱和度： 1+8+(0-8)/25,苯环及CH3的 CH伸缩振动,苯环的骨架振动,单取代苯,C=O的伸缩振动。因分子式中只有一个氧原子，不可能是酸或酯，只可能是酮，而且分子中有苯环，很可能是芳香酮。,CH3的CH对称弯曲振动s(CH),CH3的CH反对称弯曲振动as(CH),(2)图谱解析,综上所述，该化合物中有一个单取代的苯环、一个羰基(估计是芳香酮羰基)、一个甲基，根据分子式，推测未知物的结构式可能是:,总结：,3000cm-1 、1600cm-11500cm-1苯环的骨架振动、指纹区760cm-1，692cm-1单取代苯,1681cm-1强峰为C=O的伸缩振动,1363cm-1 CH3的CH 1430cm-1CH3的CH,定量分析 红外光谱定量分析是通过对特征吸收谱带强度的测量来求出组份含量。其理论依据是朗伯-比耳定律。 由于红外光谱的谱带较多，选择的余地大，所以能方便地对单一组份和多组份进行定量分析。 此外，该法不受样品状态的限制，能定量测定气体、液体和固体样品。因此，红外光谱定量分析应用广泛。但红外光谱法定量灵敏度较低，尚不适用于微量组份的测定。,红外光谱仪,色散型IR谱仪：利用单色器作为色散元件 傅立叶IR谱仪：利用光的干涉作用进行测定，没有色散元件,第二节 色谱法,一、色谱法概述 二、薄层色谱法 三、气相色谱法 四、高效液相色谱法,一、色谱法概述,色谱法的来源 色谱法(chromatography)早在1903年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。他称之为色谱。这种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,色谱分离过程,色谱分离的原理,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,色谱法分类,二、薄层色谱法(TLC)(thin layer chromatography),TLC的概念、分类、特点,概念： TLC法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。,分类：,吸附薄层色谱：固定相为吸附剂，适于异构体的分离 原理：产生差速迁移而得到分离 分配薄层色谱：固定相为液体，适于同系物的分离 原理：利用样品中各组分在固定相与流动相之间的分配系数差别而实现分离 胶束薄层色谱：以表面活性剂胶束溶液为展开剂的薄层色谱 原理：被分离组分在水、胶束和固定相三者之间形成分配平衡,特点,方法简便易行，容易掌握； 不需考虑杂质的污染问题，对样品净化程度的要求低； 在一块薄层板上可以同时展开多个样品，分析时间短； 展开后的薄层可以用不同的扫描条件反复扫描比较，只 要所测的斑点稳定，还可存放到需要时再测定； 可选用各种不同显色剂喷雾显色，有助于定性鉴别。,载板： 具有一定机械强度、化学惰性、耐一定温度、表面平整、厚度均匀，价格合理，常用为玻璃板。 玻璃板的常用规格：520cm、1020cm、2020cm，要求光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥。,TLC的基本材料,固定相或载体： 硅胶：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带酸性 氧化铝：常用极性吸附剂，具表面活性中心，略带碱性 硅藻土：中性吸附剂 纤维素：液-液分配色谱担体（水为固定液），具一定粘性 聚酰胺：特殊有机薄层材料,硅胶G(含粘合剂煅石膏)，GF254(含254nm荧光剂)，硅胶H(不含粘合剂)，硅胶HF254,点样器： 常用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器。,展开容器： 上行展开可用适合薄层板大小的专用平底或双槽 展开缸，展开时须能密闭； 水平展开用专用的水平展开缸。,显色装置： 喷雾显色用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器； 浸渍显色用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用； 蒸气熏蒸显色用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。 检视装置： 为装有可见光、254nm及365nm紫外光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。,TLC的基本操作,除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合 剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除 表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移 动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下 涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在 110烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。 使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视， 表面应均匀、平整、光滑、无麻点、无气泡、无破 损及污染。,制备,点样： 一般为圆点状或窄细的条带状， 点样基线距底边1015mm，圆点 状直径一般不大于3mm，条带状宽 度一般为510mm；点间距一般不 少于8mm。,展开： 准备：在展开缸中加入适量的展开剂，密闭保持1530分钟。 展开方式：上行、下行、近水平、双向展开等，多采用上行展开。,（b）直立式展开 1色谱缸 2薄层板 3展开剂 4展开剂蒸气,（a）倾斜上行法展开 1色谱缸 2薄层板 3展开,展开：将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。一般展开815cm。溶剂前沿达到规定 展距，取出薄层板，晾干，待检测。,显色与检视： 对有色物质，展开后可直接检视； 对无色物质可在紫外灯(254nm或365nm)下，观察有无暗斑或荧光斑点，记录其颜色、位置及强弱。适用于有荧光的物质或少数有紫外吸收的物质； 荧光薄层板(如硅胶GF254板)检测，在 254nm紫外光灯下观察荧光板上的荧光 淬灭物质形成的色谱； 既无色，又无紫外吸收的物质可用喷 雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或 加热显色，在日光下检视。,定性鉴别：利用Rf值进行定性鉴别 定量分析,TLC的应用,原点到组分斑点质量中心的距离 Rf值 = 原点到溶剂前沿的距离,三、气相色谱法(GC) (gas chromatography ),GC的概念、分类、特点及应用对象,分类,气相色谱,气液分配色谱,填充柱气相色谱,毛细管柱气相色谱,概念,GC法系采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。,特点,应用范围广,应用对象,具有挥发性或在一定温度下能够汽化的物质,不挥发或热不稳定的物质可衍生化后分析,某些大分子物质和高聚物可用裂解色谱法分析,分离效率高，分析速度快,样品用量少， 灵敏度高,选择性好,气相色谱仪,国产气相色谱仪,气相色谱仪的构成,气路系统,进样系统,分离系统,检测系统,温控系统,气路系统,作用：获得纯净、流速稳定的载气。包括气源、压力计、流量计及气体净化装置等。 常用的载气：H2、He、N2、Ar 载气的要求：化学惰性，不与有关物质反应。载气的选择除了要求考虑对柱效的影响外，还要与分析对象和所用的检测器相匹配。 载气的来源：,气体钢瓶和减压阀：压力表多为两级压力指示 气体发生器：氮气、氢气、空气及一体机,进样系统,构成：进样器、进样口、气化室等,要求： 进样量或体积要适宜、准确； 采用常规色谱柱分离，进样体积几至几十微升； 对毛细管柱分离，体积约为10-210-3L； 体积过大或进样过慢，将导致分离变差（拖尾）； 进样针最大容量与进样量要匹配。,汽化室要求：体积小；热容量大；对样品无催化作用,包括：填充柱和毛细管柱（或开管柱）,分离系统,填充柱：多为U形或螺旋形；内径26mm； 长13m；内填固定相。,毛细管柱：分为涂壁、多孔层和涂载体开 管柱，内径0.10.5mm，长达几十至100m， 通常弯成直径1030cm的螺旋状；其特点 为渗透性好、传质快，分离效率高（n可达 106）、分析速度快、样品量小。,作用对象：气化室、柱箱、检测器 控温方式：恒温和程序升温,温控系统,作用：将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于纪录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量。,常用的检测器： 氢火焰离子化检测器(Flame ionized detector，FID) 热导检测器(Thermal conductivity detector，TCD) 电子捕获检测器(Electron capture detector ，ECD) 质谱检测器(MSD)即气相质谱联用仪(GC-MS),检测系统,主要用于可在H2-Air火焰中燃烧的有机化合物（如烃类物质）的检测。,通用型检测器,主要对含有较大电负性原子的化合物响应。它特别适合于环境样品中卤代农药和多氯联苯等微量污染物的分析。,质谱是唯一可以给出分子量, 确定分子式的方法, 而分子式的确定对化合物的结构鉴定 是至关重要的,四、高效液相液相色谱法(HPLC) (high performance liquid chromatography ),HPLC的概念、分类、特点及应用,HPLC系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。,根据分离机制不同，分为液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱、分 子排阻色谱等,概念,分类,利用保留值作为定性参数； 利用在样品中加入对照品，通过峰值增高来确认； 利用LC-MS联用仪，通过被分离物的质谱图与谱 库的谱图对比来定性；