《体内药物分析》PPT课件.ppt

第五章 体内药物分析,生物样品内药物分析的任务,1.在药物浓度监测中的应用 2.在药代动力学研究中的应用 3.分析方法学的研究,1.干扰杂质多 2.样品量少 3.要求较快提供结果。,生物样品内药物分析的特点,第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存 第二节 生物样品的预处理与制备 第三节 体内样品分析方法与验证,内容提要,一、生物样品的种类、采集和制备,血液(血浆、血清)体现药物浓度和治疗作用之间的关系 最常用的生物样本,（一）血液（blood）,因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品分为全血、血浆和血清,（一）血液 1. 血样的采集 供测定的血样应能代表整个血药浓度，因而应待药物在血液中分布均匀后取样。 动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。 对于病人，通常采取静脉血。,一、常用样品的种类、采集和贮藏,（1）血浆(plasma)的制备： 血液置含有抗凝剂（如：肝素、草酸盐等）的试管中，混合后，离心，分离血细胞，淡黄色上清液即为血浆。 一般1ml的全血需加0.10.2mg的肝素。加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。,(2)血清的制备 采集的静脉血液置试管中，放置30 min到1 h，由于激活了一系列凝血因子，血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白，血液逐渐凝固，离心后上层澄清的淡黄色液体即为血清。,（3）全血的制备 采集的血液置于含有抗凝剂的试管中，轻轻混匀，不离心，防止凝血，保持血浆和血细胞混合在一起。,血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%60%（血清为全血的20%40%），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品,血浆与血清的区别,全血的制备,血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测,（二）尿液(urine),尿液用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、相及相代谢物等多种形式排出,（二）尿液(urine),性状淡黄色或黄褐色，相对密度 1.105-1.020，pH4.8-8.0 成分水、含氮化合物、盐类等 微生物防腐剂,尿液的采集,样本来源自然排尿，成人一日排尿量为15L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿）,样本采集一般采集时间尿（规定时间内）采集尿液体积和排入尿中的药物总量,动物试验中用代谢笼收集尿、粪，只能以时间段采集，有时会有收集不到的情况。,尿样 优点： 容易获得，属非损伤性取样，且样品量大；尿中药物浓度高，含有缀合物或代谢物，是研究代谢物结构的首选样品；蛋白含量极低，不需去蛋白处理。 缺点： 与血药浓度不相关，难以反映药物作用过程；受肾功能、pH影响；难以定时定量取样，易污染；所含成分复杂，已知其中有紫外吸收的化合物就达数十种。 尿样测定多用于药物排泄、生物转化研究。,（三）唾液 （saliva）,唾液无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此： TDM中利用对S的测定代替对P的监测 药代动力学的研究,唾液采集,在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰),唾液采集,物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或 纱布球等 化学法：将柠檬酸或维生素C等置于舌 尖，弃去初始部分后采集 化学法的优点：缩短采样时间减小唾液pH波动（pH7.0），S/P个体差异小,唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存,唾液样品的制备,非伤害性方法，病人易接受 采集不受时间、地点限制，易收集 一些药物的唾液药物浓度(S)与血浆游离药物浓度(P)密切相关，可使用唾液样品,唾液样品的特点,TDM如苯妥英钠的Cs/Cp比值恒定、个体差异小，可用于癫痫病人的TDM 药代动力学参数测定用GC-MS分析测定可卡因，血浆和唾液中的t1/2 分别为3.8h和7.9h,唾液样品的应用,（四）器官组织（tissue）,1匀浆化法 加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用 方法简单、但回收率低,组织处理的一般方法有：,用于动物试验药物动力学研究 临床服用药物引起中毒死亡,2沉淀蛋白法 在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用,3酸水解或碱水解 组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用 适用对热稳定的药物，应用较少。,组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶枯草菌溶素（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.011.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力）,返回 去除蛋白质方法,4酶水解法,优点酶解法操作简便 避免药物在酸及高温下降解 对与蛋白结合紧密的药物，可显 著改善回收率 可用有机溶剂直接萃取酶解液 而无乳化现象生成 缺点不适用于在碱性下易水解的药物,返回 去除蛋白质方法,4酶水解法,（五）头发（hair）,应用 体内微量元素含量测定 用药史的估计 临床用药和药物非法滥用 的区别、毒性药物检测,优点取样方便、可重复采样 通过测定某些特定的代谢物将 药物滥用和临床用药相区别 能获数月数年的长期用药信息 缺点预处理繁杂、干扰多 分析对象的含量低、需精密仪器,采集代表性和同一性 采集枕部发样 微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高 洗涤除去外源性污染物,头发的采集与洗涤,毛发样品的制备,1毛发中药物的提取常用方法： 直接用甲醇提取 酸水解(0.1mol/L盐酸) 碱水解(1mol/L氢氧化钠) 酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶) 2有机破坏法,二、生物样品的贮存与处理,冷藏冰箱(4)中短期保存(1-2d) 冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80) 中长期保存 冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定,生物样品的贮存,血样 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后再贮存 若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离 置硬质玻璃试管中完全密塞后保存,尿样 采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24-36h(4)或长期(-20),生物样品的贮存,唾液 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以下保存 保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好 冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差,生物样品的贮存,注意事项： 1冷冻的样品测定时，需临时解冻。解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻融 2如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定,生物样品的贮存,第二节 生物样品的预处理,样品预处理技术 分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件,样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作 对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术,一、生物样品预处理的目的,使药物从缀合物及结合物中释放 测定药物的总浓度 使样品纯化消除生物基质中内源性物 质的干扰 提高检测灵敏度适应和符合测定方法 要求的灵敏度 防止分析仪器的污染和劣化提高分 析仪器的耐受程度、改善分析结果,二、生物样品的预处理与制备技术,生物样品的预处理大致分为以下五类 1有机破坏法 2去除蛋白法 3溶剂萃取法 4缀合物的水解 5化学衍生化法,（一）有机破坏法,应用微量元素测定 方法 1湿法破坏 2干法破坏 3氧瓶燃烧法,（二）去除蛋白质,非破坏性生物样品预处理的第一步 可使结合型药物释放 1.去除蛋白后取上清液直接分析测定 2.去除蛋白后取上清液经进一步分离 纯化、浓集后分析测定,去除蛋白质的方法,1. 加入与水混溶的有机溶剂蛋白质 脱水沉淀 2. 加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质 3. 加入强酸与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性盐沉淀 4.热凝固法,1. 加入与水相混溶的有机溶剂,常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 血样与溶剂体积比1(1-3)可除去90%以上蛋白质,乙腈块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大，上清液pH为8.59.5 甲醇细小颗粒沉淀、不易分离；成分损 失可能性小，上清液pH为8.59.5 超速离心分离（12000r/min)离心5min,2. 加入中性盐,常用中性盐饱和硫酸铵、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等 试剂用量血清与饱和硫酸铵比例为12时除去90%以上的蛋白质 分离高速(12000r/min)离心 上清液液性pH7.07.7,3. 加入强酸,常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等 试剂用量血清与强酸比例为10.6时，除 去90%以上的蛋白质 分离高速(12000r/min)离心12min 上清液液性pH 04 过量三氯醋酸煮沸分解为氯仿和二氧化碳 高氯酸碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和 后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀,4. 加热法,测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀 加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去 优点方法最简单 缺点只能除去热变性蛋白,（三）分离、纯化与浓集,在生物样品的制备过程中，进行选择性分离、纯化与浓集 分离消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰 纯化与浓集提高被测药物的灵敏度 样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达到专属性强、灵敏度高、准确性好,生物样品的分离、纯化方法,1.液液萃取法(传统的方法) 2.固相萃取法 液-固萃取法 自动化固相萃取技术 固相微萃取 3.超滤法,1. 液液萃取法 （liquid-liquid extraction, LLE）,大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于水中 大多数内源性杂质是强级性的水溶性物质 采用有机溶剂萃取法,溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条件 了解药物与溶剂的化学结构及其性质 相似相溶的原则 对药物未电离分子可溶，电离形式 分子不溶 沸点低、易挥散，毒性小与水不相 混溶 不影响紫外检测 具有较高的化学稳定性和惰性,液-液萃取法 有机溶剂萃取次数 通常为1次，必要时23次 有机溶剂每次用量 与水相体积比通常为1:1或25:1 通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量,由药物的pKa确定 碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位 酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个 pH单位 一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取,液-液萃取法水相pH值:,生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13缓冲液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)测定，碱性药物在pH13下提取液杂质峰少,液-液萃取法水相pH值:,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,返回 液-液萃取(续),pH13,pH7,pH2,液相微萃取,2. 固相萃取法 （Solid-phase extraction, SPE）,原理 将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,常用洗脱方式 药物与固定相的亲和力比杂质强 而被保留，用一种对药物亲和力更 强的溶剂洗脱 杂质与固定相的亲和力比药物强 药物被直接洗脱,固相萃取法,固相萃取法,固相的选择原则 固相与被测组分应具有相似的极性 亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键 合相硅胶） 亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维） 离子交换型,关于固相萃取小柱： a.常见的固相萃取柱分为三部分：医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板(20m)和填料(多为40-60m，80-100m)。,b.常用规格：100mg/1ml，200mg/3ml，500mg/3ml，1g/6ml等。以100mg/1ml为例： 其中100mg为填料的质量，1ml是空柱管的体积。 c.一次性使用：为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。,固相萃取法,实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 除去残留的甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱， 去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物， 收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接 进行在线分析,固相萃取法,注意： 1.血浆样品可直接上柱 2.样品量0.1-2ml 3. 流速1-2ml/min,固相萃取法,优点 引入杂质少 完全避免乳化的形成 在优化条件下有较高萃取率、重现性较好 使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化,缺点 价格昂贵 技术要求高 批-批之间有差异,SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较,SPE：高提取率及高选择性，快速、简 单，可自动化，应用较多。 LLE：两相间分配平衡时间较长萃取回收率 及选择性随药物及萃取条件而变化沉 淀。 蛋白法：快速简便、回收率高；待测物含 量低时不适用,自动化SPE技术,优点 节约时间，400个/hr，确保了较高的工作效率 减少了操作误差，提高准确度和精密度 安全性好，可避免人对有毒样品的接触 缺点 残留物对测定的影响 在采用连续测定时，要考虑样品理化 性质的稳定性对测定的影响,2.2固相微萃取法（SPME ）,SPME装置简单，类似于气相色谱微量注射器，其基本装置如图,1压杆 2简体 3压杆卡持螺钉 4Z形槽 5简体视窗 6调节针头长度的定位器7拉伸弹簧 8密封隔膜 9注射针管 10熔融石英纤维 11熔融石英纤维,SPME操作方法,固相微萃取方法分为 萃取过程和解吸过程两步 萃取过程具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取 解吸过程将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后序的气相色谱分析,SPME的特点, 集采样、萃取、浓集、进样于一体， 避免引入多步操作误差 无需萃取溶剂，样品量小、空白值小 萃取选择性高 纤维涂层（萃取头）可重复用上百次 适用于分析挥发性和非挥发性物质 与GC及HPLC、MS等联用，自动化分析 目前SPME使用的固相涂层种类限制了它的应用，但该法极具前途,3. 超滤法,性质以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介 质的一种膜分离技术； 特点无需加热；无需添加化学试剂；无相 变化；无破坏性 应用游离药物首选方法，尤其适合TDM 操作分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离,（四）缀合物的水解 （Hydrolysis of Conjugate）,缀合物 药物或其代谢物与体内的内源性物质（葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等）结合生成的产物 测定尿液中药物总量时需先行水解从缀合物中释放药物,缀合物的水解方法, 酸水解使用盐酸，该法比较简便、快速；与酶水解相比专一性较差、有些药物在水解中易分解 酶水解专一性较强、药物无分解；时间长、费用大，异性蛋白对于迂酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法,酶水解常用酶： 葡糖苷酸酶（Glucuronidase） 硫酸酯酶（Sulfatase） 最常用的是葡萄糖苷酸酶与硫酸 酯酶的混合酶 水解条件： 溶液pH值4.55.5， 温度37培育数小时,缀合物的水解方法,加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力, 溶剂解 缀合物（主要是硫酸酯）在萃取过程中可被加入的溶剂分解称作溶剂解 尿中的甾体硫酸脂在pH1时加醋酸乙酯提取，产生溶剂解 目前对缀合物的分析，逐渐趋向于直接测定缀合物的含量，体内以缀合物形式存在的药物的量，排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率,例：血、尿中三唑仑代谢物的GC测定,酸水解： 尿中缀合物用盐酸水解时，使代谢物的七元环断裂、形成相应的二苯甲酮衍生物 酶水解： 用-葡萄糖醛酸苷酶水解酶，尿液1ml、pH4.8缓冲液50l、 -葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1ml、37水浴水解12h，水解后尿样调成pH9乙醚萃取,（五）化学衍生化,药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含一COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。,色谱分析法,光谱分析法,色谱分析是分离分析方法，大部分样品处理后就可上样分析，但某些药物或代谢物极性大、挥发性低、对热不稳定、与其它物质分离不好或对检测器不够灵敏，因此，需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。,与碱反应后, 分子内的过氧桥结构被破坏, 重排形成共轭结构。 产物在289 nm处有最大吸收。,青蒿素,第三节 体内样品定量分析方法的验证,（一）特异性 选择性 指测定信号受被测组分共存物质的影响情况。 必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品