《基因药物分析》PPT课件.ppt

第 十 三 章,生 化 药 物,和,基 因 工 程 药 物 分 析 概 念,第一节 概 述,什么是生物药物,利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学合药学的原理与方法制得的药物。,广义的生物药物包括各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。,生化药物 Biochemical drugs,生物技术药物 Bio-technology drugs,生物制品 Biological products,生物提取物 生物-化学半合成现代生物技术,什么是生化药物和基因工程药物？,生物药物,生命基本物质及其衍生物、降解物、结构修饰物等,运用生物技术进行新药研发,如基因工程药物,生物技术,生物材料制备,什么是基因工程药物（Genetic engineering drugs）？,功能蛋白,预防、治疗某种疾病,调控基因的分离、纯化或人工合成,控制蛋白合成,DNA重组技术,可大量生产的受体细胞,导入,细菌、酵母菌、动植物及其细胞,基因的繁殖表达,发 现,生化药物和基因工程药物的种类,生化药物,基因工程药物,氨基酸、多肽、蛋白质,酶类与辅酶类,多糖类,脂质类,核酸及其降解物、衍生物,主要成分为多肽或蛋白质,激素类及神经递质类,细胞因子类,酶类及凝血因子类,生化药物和基因工程药物的特点,来源均为生物体，并都具一定的生物活性和生物功能；,治疗疾病的针对性强、毒副作用小、易为人体吸收；,分子量大，且往往不是定值；,结构确证难；,质量对多种因素敏感，需进行全程质量控制；,需进行生物活性检查、安全性检查、效价检查等；,第二节 质量检验的基本程序与方法,理化鉴别法,生化鉴别法,生物鉴别法,化学鉴别法,UV光谱法,HPLC法,显色、沉淀等,肽图谱,酶法,电泳法,脱盐后等电聚焦法,利用酶的专属性,利用带电荷差异,利用等电点差异,利用生物体进行试验来鉴别药物,1.鉴别,2. 杂质检查,一般杂质检查：,原料药的检查,同化学药物,多糖类：检查低聚糖、核酸、蛋白质等；,特殊杂质检查：,酶类：酶催化反应基本产物分析，相关酶 的检查；,（生化药物）,基因工程药物的生产涉及到生物材料和生物学过程，因此可能会存在很多传统生产方法不可能存在的有害杂质。,生产过程中杂质的检查（尤其是基因工程药物）,基因工程药物质量控制必须结合最终产品、有效的中间测试以及有效的方法来去除可能的杂质。,如：原核细胞中表达的产品可能含有内毒素、致敏原,如：动物细胞中表达的产品可能含有DNA杂质或病毒,3. 安全性检查,热原和细菌内毒素检查法,过敏试验检查异性蛋白： 有可能存在异性蛋白的药物应作过敏试验。,异常毒性试验（异常毒性检查法）： 用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点。,降压物质检查法： 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。,无菌检查法检查药品及敷料是否染有活菌： 无菌检查指示控制制品染菌状况的一种检测手段。要使药品真正达到无菌，首先应严格执行GMP管理制度。,致突变试验,生殖毒性试验,可能的杂质：残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突变体和蛋白裂解物等,基因工程药物中可能的杂质与污染物检查,可能的污染物：微生物、热原和病毒等,4. 含量（效价）测定,含量测定 效价测定 （） (生物效价或酶活力单位）,HPLC法,适用对象：,结构明确的小分子或水解后变成小分子的药物,酶类或蛋白质药物,测定：,以体内或体外法测定参考品的生物学活性,SDS-PAGE法(蛋白质),同时测定蛋白质含量，计算特异比活性，以单位数/毫克蛋白（IU/mg）标示,第三节 常用定量分析方法及其应用,主要包括理化分析法、生化测定法和生物检定法,一. 理化分析法,化学分析法：,光谱分析法：,色谱分析法：,重量法、容量法、电化学分析等,比色法，紫外、荧光分光光度法等,高效液相，灌注色谱等,重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量。,1提取法：用适宜的溶剂提取出样品中的某种成分，再蒸去溶剂进行测定。,2挥发法：利用被测组分具有挥发性，或将它转化为挥发性物质来进行含量测定的方法。,3沉淀法：利用沉淀反应，将被测组分转化成难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，然后经过滤、洗涤、烘干或炽灼，最后称重并计算其含量的方法。,化学分析法：重量法、滴定分析、电化学分析,滴定分析法：根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定,例：用电位滴定法测定L盐酸精氨酸含量；,胰淀粉酶的效价测定：以淀粉为底物，经淀粉酶水解后产生还原糖，在碱性溶液中还原糖又将斐林试剂中的Cu2还原成Cu，多余的Cu在酸性溶液中与KI作用析出碘，然后用硫代硫酸纳滴定所析出的碘，来推算糖的含量，进而标定淀粉酶的效价。,电化学分析法离子选择性电极分析法：,电极借助敏感膜对某一离子产生选择性的响应。,比色法：样品与显色剂可发生颜色反应，依颜色反应的强度测定含量。,光谱分析法,例：用比色法测定硫酸软骨素的含量,原理：样品先用盐酸水解生成氨基己糖，然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛反应产生红色，以盐酸氨基葡萄糖为对照品，用比色法测定。,1.样品配制： a.配制盐酸氨基葡萄糖对照品溶液； b.配制供试品溶液，水解并中和多余盐酸；,方法：,2.显色反应： 精密量取两份对照品、供试品溶液，以水作为空白，在碱性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛进行显色反应；,3.吸光度测定： 在525nm的波长处分别测定对照品溶液与供试品溶液的吸收度，以两份的平均值，按下式计算：,A、As分别为样品和对照品溶液吸收度的平均值； Ws为对照品溶液每lml中含盐酸氨基葡萄糖的量（mg）； W为供试品重量（mg）； 0.8309为氨基葡萄糖与盐酸氨基葡萄糖分子量的比值。,样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。,紫外分光光度法,样品或其衍生物经紫外光照射后发出荧光，利用荧光强度进行定量；或利用衍生化反应和荧光淬灭进行测定。,荧光分光光度法,HPLC法：,特点：不破坏样品，适合分析高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生化药物，尤其是具有生物活性的物质。,色谱分析法,常用的固定相、流动相、检测器,1反相高效液相（RP-HPLC）：,主要用于分析肽类、氨基酸、蛋白质和多糖等的定量分析,常用的HPLC法包括：,2高效离子交换色谱法（HPIEC）：,常用于分离分析蛋白质、多肽；,特点：,蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而进行的；,分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的；,柱效中等但具有较高质量的活性回收。,3高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）,可用于多肽和蛋白质等生化药物分离，并测定分子量。,特点：,本法填料和样品间的相互作用在所有的液相色谱技术中，是最温和的。,在固定比例的水溶液中分离，流动相通常为缓冲液；,分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进行的。,灌注色谱法：,20世纪90年代发展起来的用于分离纯化和分析的色谱新技术。,特点：采用新的分离介质，允许液体传送流经介质的内表面，样品直接灌注入介质颗粒中，大大消除了传统色谱分离中扩散速率对分离容量和分辨率的负面影响，提高分离的速度和效率。,应用：基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化和分析,分类：,定义：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。,二、 生化测定法,原理：基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的分析方法,电泳法,根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类： （l）自由界面电泳：,（2）区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。,纸电泳法； 醋酸纤维素薄膜电泳法； 聚丙烯酰胺凝胶电泳法； 十二烷基硫酸纳（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳法；,（3）高效毛细管电泳：是在一根内径约50m的毛细管中，在高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。,常用方法：,根据所用的支持物不同可分为：,酶法,酶活力测定法,酶分析法,以酶为分析对象的分析方法,以酶为分析工具或分析试剂的分析方法,酶活力测定法 酶分析法,以酶能够高效、专一地催化某些化学反应为基础，通过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量,原理：,定义：,目的：,测定某种酶的活力或活性，用酶的活力单位和比活性表示,以酶为试剂测定样品中酶以外的其它物质的含量,酶反应速度用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示,酶活力测定法,1. 概念：,酶活力：指酶催化一定化学反应的能力,酶活力的测定即是测定一个被酶所催化的化学反应的速度,A,B,酶,2. 酶活力 评价指标,酶的活力单位（enzymatic activity unit）,酶的比活性（specific activity）,定义：一定条件下，单位时间内转化一定量底物所需酶的量。,酶在25以最适当的底物浓度、最适当的缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件下，每分钟能转化1 mol底物的酶量为一个活性单位，用IU表示。,定义：每毫克蛋白质中所含的酶单位数，用IU/（mg 蛋白质）表示,每毫克酶的活力单位数,在酶高度纯净，酶的分子量已知时，可采用分子活力表示。,3. 酶促反应的条件及影响因素：,使所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。,如何选择酶促反应的条件：, 底物浓度影响：反应速率受到底物浓度影响, pH影响：pH影响酶的活性和反应方向,S100Km,pH7,pH10,乳酸,丙酮酸,如：乳酸脱氢酶, 温度影响：,这一影响体现在两个方面,直接影响化学反应速度 影响酶,通常选用25，30或37 （0.1）, 辅助因子影响：,有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时需要某些相应的物质。如对巯基酶可加入二巯基乙醇、二巯基苏糖醇等。, 空白和对照：,通过不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需经过失效处理）；,空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量；,提供未知因素的影响。,对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要用于比较或标定。,ii) 常用方法有：,适当条件下 将酶和底物混合, 测定生成一定量产物所需的时间，即终点法, 隔一定时间，间断或连续地测定反应变化, 反应一定时间后停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量,i) 包括物理法、化学法和酶分析法,4. 测定方法：,按取样和检测方式分为取样测定和连续测定：, 取样测定,酶反应开始后不同的时间，取出一定量反应液，并用适当的方法停止其反应后，对产物和底物进行定量分析，求得单位时间内酶促反应变化量的方法。,加入酶变性剂,加热使酶变性,基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统进行直接连续检测的方法。, 连续测定, 几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出具体测定方法,取样测定法目前仍广泛采用，这是因为：, 它不需要特殊仪器；, 由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。,从准确性和测定效率看，连续法都比取样测定好。, 检测方法：,常用UV-Vis和荧光分光光度法, UV-Vis分光光度法：, 荧光分光光度法,如：细胞色素氧化酶的底物为细胞色素C，该物质的还原态在550nm的摩尔吸收系数为2.18104，而氧化态为0.80104，可利用这种吸收度差别来进行测定。,产物和底物之一有荧光，荧光强度变化可指示反应速度。特别适于酶量或底物量极低时的快速分析。, 旋光度法,产物和底物在某波长或波段处有明显的特征吸收差别。,某些酶反应过程常伴随着旋光变化，在没有其它更好的方法可用时，可考虑用旋光度测定法, 其它法,酶偶联测定、电化学测定、放射化学法等,5. 计算：,测定酶反应速度 V (velocity),求酶的浓度或含量 C (concentration),V=kC+b, 酶反应进程曲线： 不同酶量的 产物浓度CB时间t,反应速度 Vt,检验酶反应和测定系统是否正确,酶浓度曲线： 反应速度Vt酶量C,例：胃蛋白酶的活力测定,原理：胃蛋白酶催化血红蛋白水解成不被三氯醋酸沉淀的氨基酸，水解的芳香氨基酸如酪氨酸有紫外吸收，用UV分光光度法直接测定，计算酶活力。,方法：,1.对照品溶液的制备：精密称取经105干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液（取1molL盐酸溶液65mL，加水至1000mL）制成每1mL中含0.5mg的溶液。,2.供试品溶液的制备：取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每1ml中约含0.20.4单位的溶液。,取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1mL，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置370.5水浴中，保温5min，精密加入预热至370.5的血红蛋白试液5ml，摇匀，并精确计时，在370.5水浴中反应10min。立即精密加入5三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。,另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置370.5水浴中保温10min，再精密加入5三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照分光光度法，在275nm的波长处测定吸收度，算出平均值As和A,3. 测定法：,取样测定,空白测定,4. 计算：,以每分钟能催化水解血红蛋白生成1mol酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位，计算每1g含蛋白酶的活力单位：,式中：Ws为1mL对照品溶液的酪氨酸含量（g）； 181.19为酪氨酸的分子量。 W为供试品取样量（g）； n为供试品的稀释倍数； A，As为对照品及供试品溶液吸收度的平均值；,酶分析法, 酶分析法是以酶为分析工具或分析试剂的分析方法，分析对象包括酶的底物、辅酶、活化剂和酶的抑制剂等。, 分析过程：,选择“工具酶”,酶反应的测定,含量浓度测定, 方法：, 总变量分析法：又称为平衡法或终点法,仅适用于底物的检测方法。在酶作用的反应完成后，借助理化方法测定其总变化量，并参考反应的平衡点，计算被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。,动力学分析法：,讨论：,1. 被测底物的浓度应很小，且反应须控制在一级反应水平；,2. 其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。,3. 酶的用量要适宜,足够高，以保证反应较快达到终点,价格昂贵,12 Km(IU/mL),原理：通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。,方法：酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。,（1）被测物是酶的底物： 当底物浓度SKm时，酶反应相对底物为一级反应，v=kS，因此测定酶反应速度可以得知其浓度。,（2）被测物是辅酶（双底物反应）： 需要NAD(P)、CoA之类辅酶的反应可看作是双底物反应，这些辅酶可看作是底物之一。当另一类底物浓度足够高时，反应速度将与其浓度成正比。,（3）被测物为活化剂： 当其他条件最适且一定时，活化剂在低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在一定范围内具有线性比例关系。,（4）被测物是抑制剂： 不可逆抑制剂对酶反应的抑制程度随抑制剂浓度呈线性增加，而且酶反应的最终抑制程度由抑制剂的绝对量决定； 可逆抑制剂在底物浓度一定时，在低浓度范围内，酶反应速度随抑制剂浓度