《昆虫病原真菌》PPT课件.ppt

昆虫 病原真菌 一、概述 二、白僵菌 三、白僵菌的生殖 （一）无性生殖 （二）准性生殖 四、白僵菌的入侵和致病机理 五、白僵菌的致病性和毒力 六、白僵菌的生产 （一）固体发酵培养法 （二）简易生产法 （三）产品质量检测 七、菌种的分离、复壮和纯化 八、 白僵菌杀虫剂的应用,一、 概 述 真菌（fungi）是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，原因是它们生长在宿主的表面，明显可见。真菌也是首先被研究制成杀虫剂的微生物，并以其特殊的营养方式、独特的入侵方式和可靠的宿存机制在害虫的综合治理中表现出强大的生命力。 真菌是微生物的一个重要类群，约有10万余种。杀虫真菌目前世界上已记载的约有100属，800多种，并且数量还在不断地增加，杀虫真菌大部分是兼性或专性病原体，它们的生长和繁殖在很大程度上受外界条件限制。近20年来，真菌的生理学和生态学方面的研究取得了新的进展，使得杀虫真菌防治害虫的效果显著提高，成为微生物杀虫剂的重要组成部分。 杀虫真菌具有一般真菌的共同特征，由单细胞或者多细胞组成，缺少光合作用所必需的叶绿素，其营养方式是依靠分解有机物而吸收有机物供给的能量和营养物质。真菌具有细胞壁，是真核生物（eucaryote），除少数真菌存在的游动孢子可以运动之外，是典型的不运动生物。大多数杀虫真菌由分枝状菌丝(hypha)组成，菌丝由发芽的孢子（spore）发育而来，许多菌丝在一起组成菌丝体(mycelium)。真菌主要依靠孢子繁殖，孢子既有可能是无性孢子，又有可能是有性孢子。,二、 白 僵 菌 被白僵菌寄生的昆虫，虫体坚硬，体表长有白色菌丝层，通常称为“白僵病”或“硬化病”，白僵菌的杀虫范围达700多种。 白僵菌的菌丝呈白色、淡黄色，偶尔呈淡肉色，疏松，绒毛状，菌丝长且较细，直径为1.5m-2m。分生孢子梗单生或合轴分枝，再育产孢。产孢细胞常着生于短的柄细胞（stalk cell）上，通常呈球形、柱形、瓶形、直或弯，末端变细，抽长成“之”字形。 最常见的杀虫白僵菌有两个种，即球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和卵孢白僵菌(B. tenella)。这两个种的区别是：球孢白僵菌的分生孢子呈球形或近球形，大小为（2m-3m）（2m-2.5m），柄细胞与产孢细胞成簇生长。卵孢白僵菌又名布氏白僵菌（(B. brongniartii)或纤细白僵菌(B. tenella)，其分生孢子98%为椭圆形，大小（2.5m-4.5m）(2m-2.5m)，如果有柄细胞则相当纤细，很少成簇生长。,三、生殖 1、无性生殖(asexual reproduction) 白僵菌可通过分生孢子、芽生孢子、节生孢子、内生孢子、厚壁孢子和菌丝体断裂等多种方式进行无性生殖。生活史的类型是多型性的，在不同的培养条件下产生不同类型的孢子。白僵菌上述六种类型无性生殖的过程是： （1） 分生孢子(conidium) 分生孢子梗是多核的，在顶端延伸成瓶梗时，一个细胞核拉长，进到瓶梗的顶端，此时顶端膨大成分生孢子，最后分生孢子和瓶梗连接处以缢缩的方式分离，瓶梗的内层和外层细胞壁都参与了分生孢子的形成，而分生孢子梗内的核又不断分裂，随着原生质的运动向瓶梗顶端移动。在28培养时，接种3.5h-4h孢子就开始萌发，8h萌发孢子逐渐增多，15h即进入萌发高峰。从分生孢子萌发，长成菌丝体，再形成新一代的分生孢子，最快需23h，72h后分生孢子即大量产生。 （2）芽生孢子(blastospore) 白僵菌在液体发酵培养或在昆虫体腔内增殖时产生大量的芽生孢子，芽生孢子由菌丝体或萌发后以出芽的方式产生，细胞核1至多个，脱落后只要条件适宜即可萌发产生短菌丝，以芽生的方式又产生下一代芽生孢子。培养前期形成的芽生孢子圆形。,在28的人工培养条件下，分生孢子接种后15h，芽生孢子就开始形成，30h逐渐增多，49h达最高峰。芽生孢子壁薄，生活力弱，但在昆虫体内发育时能吸收大量的水分并产生有毒的红色卵孢霉素，该毒素是昆虫致死的重要因素。 （3）节生孢子(knotspore) 菌丝长到一定时期，横隔膜的中胶层发生自溶，一个一个细胞脱落下来，即成一个节生孢子。有的节生孢子由数个细胞构成，可以由菌丝向下逐渐形成，也可以在菌丝中间形成。 （4）内生孢子(endospore) 内生孢子球形或椭球形，在菌体壁内形成，随后菌丝的内外壁发生自溶，内生孢子散落出来。 （5）厚壁孢子(thick-wall spore) 厚壁孢子由菌丝体、芽生孢子等在营养条件不良或有杂菌污染时形成。首先，菌丝体细胞增大，贮藏的颗粒物增多，在老的壁内又增生新壁，单生或串生，间生或顶生，在条件适宜时又可萌发成菌丝。若温度等条件比较适宜，产生壁孢子就少。 （6） 菌丝断裂 菌丝断裂有两种类型：第一，菌丝体内的原生质一段一段的集中，以后从空的地方断掉；第二，在生活条件不适时，菌丝螺旋状生长，然后从弯曲处断裂，断掉的每一段菌丝起孢子的作用。,2、准性生殖(parasexuality) 白僵菌的准性生殖过程大致有三步：异核体的形成，二倍体的形成和单倍化。 白僵菌可通过不同的接合方式产生异核体(heterokaryotic mycelium)，异核体内不同基因型的核融合，进行准性生殖。其一种方式是：两个具异型核的分生孢子，萌发长出菌丝，而相邻的壁发生溶解现象，一个菌丝的原生质和细胞核流入另一个菌丝之内，发生细胞核和原生质的融合现象，形成了一个二倍体的接合子。这个二倍体接合子叫局部接合子。局部接合子形成后，另一个只具空腔的菌丝则消解退化。局部接合直接萌发成二倍体的菌丝体。或者数代后再经减数分裂单倍化。另一种方式是：两个具有展开核的分生孢子产生接合管，相通后，一个细胞核通过接合管进入另一孢子内和其中的一个核相接合，形成了一个二倍体的合子。接合后那个只剩空腔的孢子，壁自溶消解。 与其它真菌一样，白僵菌准性生殖时，二倍体的单倍化，不是通过减数分裂而是在普通有丝分裂过程中发生染色体逐步丢失行为来实现的。 白僵菌的有性生殖在自然情况下很少发生，在人工培养条件下没有特殊的诱导方法，也难以形成。因此，准性生殖是白僵菌发生遗传变异，产生新品系的重要方式。,四、白僵菌的入侵和致病机理 1、入侵途径 白僵菌感染昆虫主要是经过皮肤。分生孢子借助气流、雨水或虫体互相接触，传到健康昆虫的体表。当空气中湿度较大时，分生孢子极易粘附在昆虫体上，然后通过皮肤小气孔、毛孔或创伤部位侵入。此外还发现白僵菌可能通过消化道入侵体腔。因此，与其它病原相比，白僵菌有更多的机会侵入虫体，使昆虫感染致病。 2、入侵过程 白僵菌的分生孢子与敏感宿主接触后，在一定的条件下开始感染昆虫，感染周期中有一个典型的四步入侵的过程，即分生孢子附着、萌发、芽管穿透、营养生长等。 吸附(attachment) 萌发前的孢子通过非特异性的被动过程吸附于昆虫外表皮上。这个阶段有没有特异性的化学作用尚未最后确定。白僵菌的分生孢子有一个干燥的亲水性的表面，能与宿主外表皮的表面相互作用。有人报道，白僵菌分生孢子的表面具有某种凝集素(hemagglutinin)，而糖类（葡萄糖、葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖）能竞争性地抑制这种凝集素的活性。如果将分生孢子用糖类进行予处理，则处理后的分生孢子对宿主的亲和性会大大降低。,萌发(germination) 吸附在昆虫体表的分生孢子，在高湿和适温条件下，开始吸水膨胀，约经8h-12h即行萌发，从孢子的端部或侧面伸出1-2根芽管。 宿主表皮的组分不仅对分生孢子的吸附有重要作用，而且对分生孢子芽管的萌发有着刺激作用，并能为其生长提供营养。试验证明外表皮在提高分生孢子的萌发率方面起到了一些作用。N-乙酰葡萄糖、几丁质、淀粉、长链脂肪酸等都能刺激白僵菌分生孢子的萌发。用硅柱层析对外表皮的粗提物进行层析分离并作体外测定发现，甾醇、甘油二酯和极性脂类物质所刺激的萌发率与原始抽提物质类似。而无机的和有机的氮都能为芽管生长提供营养。 芽管穿透 芽管侵入体腔的过程与酶和机械的作用有关。白僵菌分生孢子萌发时产生的一系列表皮分解酶，如蛋白质酶、几丁质酶、水解脂酶等，分别降解表皮上相应的成分。由于这些酶的联合作用，使昆虫的表皮溶解，正常的片层结构被破坏，芽管因此可以靠机械的力量穿透表皮，伸入体腔之中。,营养生长（vegetative growth） 侵入体腔内的芽管，在血淋巴中或部分组织中繁殖，由发芽管形成菌丝，稍经伸长即产生芽生孢子。菌丝表面存在的半乳糖残基能有效地排除昆虫的血球凝集素，从而大大降低昆虫血细胞对白僵菌的吞噬作用。此外，菌丝生长时产生的毒素也能抑制血细胞的防卫反应。在营养丰富、水分充足的体腔内，菌丝生长旺盛，穿插于体腔的各组织、器官之间。 有的菌丝钻入组织细胞内，特别是脂肪组织内，使细胞内的原生质和核被消耗，细胞萎缩，虫体各组织终被破坏。菌丝生长到一定时期，便按垂直方向长出分枝，并且在菌丝的上端或旁边形成筒形孢子，筒形孢子成熟以后，就与原来菌丝分离，直接长成菌丝。这种新生长的菌丝及原来的菌丝在虫体内又可再生长形成筒形孢子，直接长成新的菌丝。如此不断增殖，充满了整个昆虫体内，侵入肌肉，损坏虫体运动机能。筒形孢子和菌丝弥漫在体液中，不但妨碍了昆虫血液循环，而且菌丝的代谢产物，如草酸盐类在血液中大量积累，引起血液理化性质改变，使宿主新陈代谢紊乱而死亡。,3、病症和组织病理 病症 白僵菌杀死昆虫之后，刚开始虫体还是柔软的，后来因为菌丝猛烈地夺取虫体内的水分，使被寄生的昆虫尸体干硬。菌丝吸尽体内养分之后，便沿着虫体的气门间隙和各环节间膜，伸出体外，生成气生菌丝，然后其顶端再产生分生孢子。这时便可看见虫体上披着白色的茸毛，即为气生菌丝和分生孢子。 组织病理 组织病理学研究表明，白僵菌在虫体内寄生能引起几乎所有的组织出现病理变化。菌丝在体腔内生长，首先使血淋巴发生变化。主要表现在血细胞成团地包围菌丝，形成肉芽肿（granuloma），这是血细胞的防卫反应，但由于菌丝抑制血细胞防卫反应的反应，血细胞核和细胞质被破坏，出现空泡。由于白僵菌生长过程中产生了很多有机酸，使昆虫体液血淋巴pH降低，同时菌丝的迅速生长和繁殖，还引起血淋巴中蛋白质含量降低，而其它代谢产物增多。此外菌丝生长吸收大量的水分之后使血淋巴部分浓缩粘滞性变大，从而阻碍了血淋巴循环。,在血淋巴中菌丝生长极快，不久充满整个体腔，并且菌丝很粗，几乎为气管中菌丝的两倍。菌丝在血淋巴中增殖到一定程度之后，就侵入脂肪体细胞。正常的3龄-4龄幼虫脂肪体小，呈不规则的带状，分布于近体壁的四周，脂肪体的细胞核和细胞膜清晰可见。正常老熟幼虫的脂肪体大，占据体腔的绝大部分。脂肪滴甚多，细胞核较难辨认。3龄-4龄幼虫脂肪体被菌丝侵染之后。细胞很快解体，而老熟幼虫中脂肪体病变发生较迟，一般发生在感染第6d以后。在脂肪体发生病变以后，其它组织的病变也相继发生。正常中肠有基底膜、中肠上皮细胞和围食膜三层结构，感染以后中肠的基底膜不完整，上皮细胞和肠腔都充满菌丝。气管受菌丝感染后，菌丝在其中充分生长，长得长而且细，受菌丝的影响气管逐渐解体。马氏管病变后原来厚而完整的管壁被破坏，幼虫肌肉组织被破坏成断片状，横纹模糊。正常幼虫的体壁由外表皮和体壁上皮细胞组成，菌丝刚入侵幼虫时，芽管不留在体壁而进入体腔之中，故在感病前期难在体壁中发现菌丝。菌丝在侵染了体腔内各组织之后，便开始蔓延到外表皮中，此时能在外表皮中看到少量的菌丝。当体腔内组织完全解体之后，外表皮中充满了菌丝，有些菌丝开始伸出体外。,五、致病性和毒力 白僵菌的毒力和致病性与病原体、宿主和环境三要素有关。 1、病原体 白僵菌是人们研究最多的虫生真菌之一，它分布非常广泛，筛选分离的株系也很多。已有许多试验证明从不同宿主和不同地理区域分离的白僵菌存在酯酶型和血清型上的差异，这些差异又反应了菌株毒力上的差异，在分析白僵菌的酯酶图谱多型的原因时，有人提出这与遗传变异（如突变、杂交、准性生殖）以及生命（宿主、自溶、异溶）和非生命（温度、湿度）因素的选择过程有关。因此，白僵菌的致病力并不是不变的，经人工培养的白僵菌，生长力会减弱，毒力下降，这可能是因为白僵菌的准性生殖发生体细胞重组，或人工培养改变了它的寄生生活环境所引起的。因此生产白僵菌时必须经常复壮以保持它的致病力。 能否完成入侵的每一步即吸附、萌发、穿透、营养生长，是衡量白僵菌毒力高低的重要标志，其中一步完成不好，致病力就明显减弱。此外，病原体的数量及其稳定性，也与毒力密切相关。感染的成功必须有一定数量的孢子作保证。家蚕接触白僵菌分生孢子的有效剂量为250个/幼虫，在这个剂量以上，感染率随孢子剂量的增加而增加。据报道，白僵菌分生孢子对温度的耐受能力较好，纯分生孢子在低于70温度下烘烤4h，其发芽率不受影响。分生孢子在冷而干燥的条件下保存多年仍能萌发。一般情况下，白僵菌孢子在21经几个月就会失去活性，而在8时，可保持1年的活性。,2、宿主 宿主对白僵菌的感受性也有差别。某些地下害虫例如西方五用鳃角金龟子(Melolontha melolontha)对卵孢白僵菌比较敏感，而对我们普遍应用的球孢白僵菌感受性要差一些。现在还没有足够的资料说明昆虫对白僵菌产生了免疫力。宿主的感受性也与其发育阶段有关。据报道昆虫在蜕皮时最易受白僵菌的侵染，鳞翅目昆虫的幼虫较卵、蛹和成虫易受感染，而幼虫又以低龄期最敏感。如在剂量和温湿度相同的条件下白僵感染马尾松毛虫的效果，3龄幼虫死亡43%，4龄幼虫死亡20%，5龄则死亡极少。 在昆虫的生长发育过程中，凡营养不良，或因环境条件不适而使营养消耗过度，以致影响昆虫的正常生理活动的个体，易受白僵菌感染。以幼虫越冬的昆虫由于越冬前后表皮几丁质的渗透性不同也使白僵菌的致病性有差别。 昆虫体腔内的条件，包括pH、营养成分、含氧量同样影响到白僵菌的致病力。一般pH合适，通氧好和营养成分高的体液，菌丝生长旺盛，故毒力要强。 3、环境 在昆虫种群中能否形成白僵菌流行病，受物理条件（如温度、湿度、光、风等）、化学条件和生物条件的影响。 （1）温度 白僵菌的生活温度范围是0-40，最适温度是22-26。然而在平均温度远低于最适温度的环境条件下，白僵菌也能杀死越冬昆虫。,（2）湿度 湿度对于分生孢子的萌发极为重要。白僵菌分生孢子萌发的最适条件是94%的相对湿度和28的温度，以100%的湿度最为适宜，90%以下则不利于孢子的萌发，过于干燥对孢子生活力有不良影响。例如干燥处理后，孢子萌发率明显下降，如处理423小时的孢子完全不能萌发。因此湿度直接影响着孢子的萌发和真菌病在自然界的流行。据报道，白僵菌在潮湿的树皮中能杀死波纹小蠹（Scolytus multistriatus）92%的幼虫，而在干燥环境的树皮中仅能杀死4%的幼虫。 （3）光 不同光质对分生孢子产生不同的效应，在可见光中，波长较短的蓝绿光（500nm以下）比波长较长的红黄光（565nm以上）更利于孢子的形成。一般的散射阳光对白僵菌孢子的萌发有促进作用，可提高萌发率4倍-5倍或更多。孢子暴露在直射阳光下150h仍不完全丧失活力，在90h内直射阳光对孢子的生活力反而有刺激作用，在90h以上，孢子生活所逐渐衰弱。紫外线对白僵菌有一定的杀伤作用，但不同株的白僵菌对紫外线的忍耐力有明显的差别。 （4）pH值 白僵菌的分生孢子在pH3.0-pH9.4间均能萌发，pH2.4或pH10.0则不萌发，以pH4.4时的萌发率最高，萌发也最快。菌丝在pH4.5-pH5.0生长旺盛，孢子产生以pH6最好。,3、二级液体培养 二级种子扩大培养的培养基如下： 洗米水培养基（500g水洗500g大米）； 花生饼粉3%（取煮出液过滤）、蔗糖3%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.02%、硫酸镁0.02%、水100%。 二级培养接种量应尽量大一些，一支斜面菌种约接4-5瓶，也可用接种铲铲一块斜面菌苔接进培养基内，置于复式（每分钟80次-100次）或旋转式（100r/min120r/min）摇床上振荡培养72h，温度控制24-28，产生大量孢子时即可作二级菌种。 4、三级扩大培养 三级扩大培养的培养基配方有以下三种 米糠30%、麦麸60%、谷壳、酵母1%； 麦麸70%、谷壳30%； 麦麸30%、米糠40%、谷壳30%。,灭菌后的培养基，按15%-20%的接种量加入种子，平铺2cm-3cm厚。在整个培养过程中，始终要加强白僵菌的生长，削弱杂菌的生长。环境消毒是从数量上削弱杂菌的另一种手段，加大接种量则是从数量上加强白僵菌的一种手段。但还需严格控制培养条件，特别是温湿度。白僵菌生长的最适温度是24，而孢子萌发和菌丝生长都要求较高的湿度（90%以上的相对湿度），高温高湿容易引起杂菌生长。因此，早期培养温度应控制在24以下，约22-24左右。不但要注意气温，更重要的是注意料温。如果料温升高，则适当调节气温或培养基铺薄些。当气温达26时，就要开动鼓风机、风扇和打开门窗，增强空气对流，避免高温高湿引起杂菌丛生。白僵菌的菌丝充分生长布满全部培养基，变成雪白一块的时候（必要时可以将培养物放在室外稍微干燥），然后放回室内。因为低湿有利于孢子形成，而不利于杂菌的生长。大约培养3d后菌丝大量繁殖，7d-10d后开始产生孢子，产孢子盛期是第10d-15d，培养20d以上便可以收获了。,5、菌粉加工 将生长成熟的固体菌块，在红外光下或在40-45的烘房内鼓风干燥，也可成块在自然条件下风干或是晒干，用粉碎机粉碎。注意粉碎时温度不得超过45，否则会造成孢子的大量死亡。把粉碎好的粉末通过100目筛孔，或旋风分离纯孢子粉。另选干燥细陶土、红土和白泥等作填充剂粉碎过筛，使含水量在10%以下。按每克含孢子50亿个的比例加入烘干的孢子粉，用塑料袋包装备用，一般可贮藏半年至一年。,（二）简易生产法 1、场地选择 选无积水的空地、林地，夏季气温较高时，以遮阴通风的地方为好。然后用疏松的细土（最好是新土，不必消毒）做个长方形的平整床面，高15cm-20cm，以不被水淹为原则。或挖15cm深的长坑，坑底要平，周围垫以3cm左右的土，以防水淹。床宽80cm为宜，以便操作。长度不限，可按投料多少而定。床面四周挖排水沟，以防积水淹没床面。为避免日晒雨淋，在床上应搭一个南高北低的凉棚，棚子南面高1.3m左右，北面高1m左右。如床面太干，可喷些水保持床面土湿润，以免土干吸取培养基的水分，影响白僵菌的生长。 2、菌种扩大培养 一级菌种可采用试管装麦麸（麦麸与水的比例为1：0.5-1:0.8）或大米饭灭菌。接种后置25-28下培养7d-10d，待麦麸中长满白色粉状孢子，即进行二级固体扩大培养。二级生产一般用罐头瓶装湿麦麸（麦麸与水比例为1：0.5-1:0.8）,所装的湿麦麸约为罐头瓶容量的1/3-1/2。高压蒸汽灭菌，待瓶温降至45时，用接种针刮入菌种，接种量为每瓶用一支试管菌种，然后摇匀，置25-28下培养。培养前期3d-4d内为利于菌丝体迅速生长，在瓶口盖纱布棉塞和牛皮纸以保温。培养后期为适应孢子对高温低湿的要求，把牛皮纸盖去掉，并提高培养温度至30促使产生大量孢子。严格选择无杂菌的二级固体种子，准备露天培养接种用。,3、露天培养 露天培养包括顺序进行的几个步骤。首先是灭菌和接种。三级露天培养料可选用新鲜麦麸，或加入10%谷壳、锯末、粉碎的玉米秸粉（料水比例为1：0.8），用0.1%-0.2%的高锰酸钾液拌料。经试验，由于微量元素锰的作用，培养24h-26h，白僵菌丝即可布满培养基，不易被污染。但高锰酸钾液浓度低于0.1%则效果不明显。把拌匀的料用布袋疏松包成0.5kg-1kg的小包，轻轻放入高压灭菌锅或常压高温灭菌锅内（在常压高温灭菌锅中100须保持两个小时以上）进行灭菌。接种以清晨或夜间最好（空气杂菌少）。先将灭过菌的三级料倒入干净的盆子或铺有塑料薄膜的簸箕中（手、盆、塑料薄膜须事先用2%的来苏尔水洗刷消毒）。摊开降温，待料温降至50左右时才接种。因为白僵菌丝的穿透力比较弱，接种时不但要搅拌均匀，而且要把培养基中的料团搓细，以免污染杂菌。接种量可以稍大些，按料与二级种子10：1的比例接种，这样白僵菌生长较好。,第二步即入床，先在床面上铺二层灭过菌的旧报纸，再将接过种的培养基迅速疏松铺平（厚3cm-6cm左右），在料上再盖灭过菌的旧报纸，并根据不同天气加覆盖物。晴天应在灭菌的报纸上盖上1cm-2cm厚的湿润细土或细砂（不用消毒），以控制水分蒸发，阴天多雨时空气湿度大、则只用两层灭过菌的旧报纸覆盖即可。 入床后的管理应根据白僵菌的最适生长条件来进行。根据白僵菌生长温度范围（5-30）内最适宜发育温度为25-28，以及培养前期（3d-4d）需低温高湿才便于菌丝体繁殖，后期需低间断高温才便于形成孢子的要求。夏季露天培养时一定要有凉棚，以利遮阴和通风，避免阳光直射，且以散发品温急剧增加的热量。如气温高，则培养前期还要在覆盖物上少喷、勤喷凉水，以保持培养湿度，但也要防止湿度过大使培养基污染杂菌造成霉烂。接种后如遇低温，可覆盖一层塑料膜进行保温保湿，大约5d-7d即可收获。 4、露天培养的优点 白僵菌的露天培养具有设备简单、方法简便、不需要大量投资且操作管理简便等优点，适宜于农村推广。此外，杂菌污染少，利于大量生产。培养床在新接种时不必消毒，如重复接种，可在接种前用日光照射半天或更新床面，达到消毒的目的，这样可节省尤其是消毒药剂。因生产范畴不受房间限制，可选择适当场地大量生产。露天培养时，前期湿度易控制、后期品温较均恒，利于菌丝和孢子的生长。,（三）产品质量检测 白僵菌的产品质量检测目前主要是测定菌粉的含水率和含孢子数（或含活孢数），但这两项指标都不能完全反映产品的质量。因为产品的质量还应反映产品的毒力，而目前还没有测定毒力的简更易行的方法以统一标准，所以暂时还是以菌粉含水率和含孢子数作为主要的质量指标。 1、含水量的测定 用分析天平称取菌粉1g，放在烘箱内用120烘2h，再称菌粉重量，算出失水重量百分比。 计算公式： b B=100% G 式中：B=含水量%，b=烘干后减轻的重量，G=烘干前菌粉重量。 2、含菌量的计算。 （1）平板计数法 在无菌的条件下，取1g白僵菌样品，系列稀释至1106倍，取1mL作平板培养48h-72h，根据长出的菌落数，即可推算出1g菌剂中含有活孢子数。 菌落平均数稀释倍数 样品孢子数/g= 样品克数（g）,（2）血细胞计数法 取1g白僵菌样品，10倍稀释后，用灭菌滴管滴一滴于血细胞计数板上，小心加放盖玻片，勿使产生气泡，在显微镜下直接计数。从血细胞计数板上每个小方格（体积1/4000000mL）中的孢子数可进一步推算出1g菌剂中的孢子数。 20个小格总孢子数 样品孢子数/g=4000000稀释倍数 20 （3）孢子存活率的检查 孢子存活率用发芽率来表示。测定时，取孢子液少许滴于一片四边涂有凡士林的盖玻片上，再翻转放在载玻片上。轻压四边使凡士林将上下两用人才玻片粘紧，然后密封，置25-30下培养2d-3d，取出放在显微镜下观察。计数观察到的孢子数和发芽的孢子数，求出孢子发芽率，即为孢子存活率。 发芽的孢子数 孢子存活率（%）=100% 检查的总孢子数,另一种检查孢子存活率的方法是：将稀释后的白僵菌孢子，用0.1%的亚甲基蓝（methylene blue）酒精溶液染色10min-15min，按同样方法滴于血细胞计数板上，加盖玻片，镜检。失去生活力的孢子因无呼吸作用，不产生脱氢酶 而被染上蓝色；而活孢子能产生脱氢酶，把亚甲基蓝还原成亚甲基白，因而不着色，仍呈原亚的色泽。通过显微镜观察，计算不着色的活孢子数，即可推算出样品中活孢子的含量。,（七）菌种的分离、复壮和纯化 1、菌种的分离纯化 如果菌种污染了杂菌，则必须进行菌种的分离和纯化。由于微生物生长时对pH、温度、化学药品及营养的要求都有差异，故在分离菌种时，要根据各类微生物生长的条件，采取适当的方法，选择和控制培养条件，如调节pH、控制温度和渗透压、添加化学抑制剂等，以获得纯培养的菌种。分离的方法有两种：琼脂平板划线法及稀释分离法。琼脂平板划线法是用沾有孢子的接种环在琼脂平板上往不同的方向划蛇形折线，从浓到稀分成4个区，然后置于24-28恒温箱培养3d-4d，将稀疏处单个完整的菌落移至斜面，培养2d-3d后，再往另一支斜面移接，如此反复一二次，直至获得纯的菌种。稀释分离法是把待分离的白僵菌孢子配成悬液，依次稀释6次，然后用无菌吸管从稀到浓分别吸取相应浓度的孢子悬液1mL放入培养皿内，倒入琼脂培养基充分摇匀，置24-28恒温箱培养。3d-4d后，选单个、孤立的菌落移至斜面，再从斜面移接一二次即得纯种。,2、菌种的复壮 白僵菌经人工培养多代后，生长能力会减弱，故要做好菌种的复壮工作。复壮的方法有以下几种： （1）选择接种后7d-10d菌丝生长旺盛的斜面菌种，紫外灯下50cm距离照射30min，再继续培养，待长出孢子后复接留种。 （2）选择刚开始长孢子的菌种，在紫外灯下照射30min，即用来作孢子复接，复接后4d-7d，观察菌丝生长旺盛的留作菌种。 （3）从施药后的田间或林间采回白僵菌致死的虫尸，用平板划线分离法或稀释分离法分离出菌种，经检查确无杂菌便可作菌种。 （4）利用射线等诱变剂使白僵菌发生变异，再经过人工选择，从中选育出优良菌种。这种方法在生产上是可取的。有试验表明：突变菌株比原始菌株成熟早，生产周期短，孢子含量也有增加。在单位面积用药量与对照区相同的情况下，致病力增强，但突变菌株在遗传稳定性方面还不是很理想。 （5）改变培养基成分。在培养基中增加或改变碳源、氮源，加入B族维生素，特别是加入碾碎的玉米螟等昆虫的汁液，使培养基内动物性营养增加（因白僵菌最适于在虫体上寄生），可以使其复壮。然后分离或直接作为菌种，一般以分离筛选为好。 3、菌种的保存 菌种的保存方法有几种。可用石蜡把培养好的斜面菌种封口，放在冰箱或室温下，这样可保存2年左右。若用砂土管保藏，放在盛有生石灰或氯化钙的干燥器或广口瓶中封闭，亦可保藏1年以上。,一、白僵菌杀虫剂的应用 我国应用白僵菌防治农、林害虫，无论从防治害虫种类和防治面积均居世界首位。据统计：自60年代以来，我国试验和应用白僵菌防治害虫种类达40种以上。每年防治面积近670万公顷。近年来，除大面积应用于农、林害虫外，已扩展到果树、茶叶、蔬菜等经济作物。除普遍应用球孢白僵菌，近年来对布氏白僵菌进行了研究和应用，并取得较好的防治效果。 （一）防治松毛虫 国内应用白僵菌防治松毛虫有着悠久历史，防效明显。由于林区中自然生态环境较适合白僵菌的生长和传播，在林区中松毛虫白僵菌流行病时有发生，有效地控制虫害起到积极的作用。在福建省、湖北省大面积，连续喷撒白僵菌已使松毛虫发生面积从53万公顷下降到20万26万公顷左右。效益显著。因此，白僵菌防治松毛虫已成为综合防治此虫的有效措施之一。根据林业部门历年防治工作，总结以下几种应用方法。 1.地面常规喷粉：将菌粉掺入一定比例的白陶土，粉碎稀释成20亿孢子/g的粉剂，用手动或机动式喷粉器进行林间全面或局部喷粉，24周后，松毛虫寄生率可达7080。 2.地面常规喷雾：用100亿150亿孢子/g的原菌粉，掺水稀释至0.5亿2亿孢子/ml的菌液，加入0.01洗衣粉，用背负式手动或机动喷雾器喷雾，僵虫率可达7090。,3.放虎归山（即释放带菌活虫）：采集活幼虫，集中撒菌粉于虫体上，再放回松树上，任其自行扩散。或一人端瓦钵，瓦钵内盛有5亿孢子/ml的菌液，沿山间小路，边走边采集松毛虫幼虫，放在菌液中沾一下再放回到树上，任其自行爬行。这些带菌虫死后，体上形成孢子可扩散到林中，在林间逐惭形成白僵菌流行病。应用时间宜在早春和梅雨季节。约经13个月，松毛虫死亡率可达90以上。 4.挂粉袋：在福建，广东一些林区，群众将白僵菌装入纱网袋中。每袋装0.5Kg，挂于林间树枝上。每公顷挂15袋，让白僵菌孢子自然扩散，可有效地起到控制松毛虫的发生。 5.放粉炮：手甩炮；用报纸或牛皮纸包装制成园筒形炮，中间放一炮心。每包装150250克菌粉。当阴雨天，在林中点燃火炮甩向树冠爆炸，起到撒粉治虫作用。每公顷约1530个甩炮。24周后防治效果达7080。高空发射炮；用口径10cm，长100cm左右的纲管制成迫击炮式小炮。底部密封，近底部钻一引线孔，插上引线，放入少量黄泥和炸药，隔一园纸片紧压，上面再加白僵菌粉并压紧，然后点燃引线，借用炸药的冲力，将菌粉送到树冠上，达到高空撒粉或远距离撒粉。其高度达2030m。 6.飞机和地面超低量喷雾：广东省采用“82乳油”加入白僵菌高孢粉和清水，按5:1:14配制成含量为50亿100亿/ml孢子的乳剂，每公顷喷2250ml，约15万亿孢子，飞机超低量喷雾防治松毛虫，半月后效果为4392.9。,（二）防治玉米螟 白僵菌防治玉米螟全国有11个省、市，特别是北方春玉米产区使用面积较大。防治玉米螟主要采取以下几种方法： 1.10白僵菌颗粒剂：将白僵菌原菌粉按1:10比例与沙子（或沪渣经20和30筛目过筛，取其中间颗粒）充分混合。在玉米心叶期（即喇叭筒期）逐棵向心叶中投放颗粒剂，每株1克（剂量约61013孢子/ha），防治效果达8090。有的地方采取隔垅施药，治螟效果也可达6070。但可减少一半用药及投工。 2.玉米心叶培养白僵菌防治玉米螟：此法是群众在生产和应用中一个创造，它把生产白僵菌和防治玉米螟有机地结合起来。利用玉米心叶中有一定水分，可保持有适合白僵菌的生长条件，既繁菌又治虫，一举两得。具体方法是，先将麦麸经小火炒熟，然后按二级固体菌种、麦麸与沙子，按1:10:100比例加以混合，然后撒于玉米心叶中，每株用量2克，防治效果可达80以上。施用期间玉米植株较小（1012片叶左右），便于投放，节省了大量生产场地和劳力。,3.白僵菌封垛防治玉米螟：将白僵菌原菌粉按1:20和滑石粉（或细黄土及草木灰、草炭土等）混合，先用木棍向玉米茬或玉米杆垛内插一洞，将手摇式喷粉器或动力喷粉器喷头插入垛内进行喷粉，每隔一米左右插个洞，喷一次，直至全垛喷完，喷粉用量约4两/m2，大面积封垛后，对提高垛内越冬玉米螟幼虫寄生率8096，减少玉米螟田间为害率70左右。此方法主要是消灭越冬虫源，提前了防治时间，并大大减少了用药及投工。 4.田间喷撒白僵菌粉剂和液剂 采用白僵菌粉剂（载体滑石粉，含孢量10亿孢子/g），用东方红18型背负电动机喷粉器，每次喷幅20垅，喷量15Kg/ha，防治效果6980。采用可湿性粉剂（含孢量500亿/克），稀释100倍，喷液剂30Kg/ha，喷幅6垅，防治效果达84.2。 5.飞机喷撒白僵菌 黑