《蛋白质工程制药》PPT课件.ppt

1,第七章 蛋白质工程制药,第一节 蛋白质和多肽类药物的分类 第二节 蛋白质分子设计与合成 第三节蛋白质工程在制药中的应用,2,第一节 蛋白质和多肽类药物的分类,一、多肽与蛋白质 肽：2-50 蛋白质：50 一般来说，大于20个氨基酸的多肽与蛋白质没有明显界限。,3,二、多肽类药物的分类与作用 激素类 加压素、催产素、促皮质素及衍生物 下丘脑-垂体肽激素 消化道激素 其他激素和活性肽 细胞生长调节因子 含有多肽成分的其他生化药物,4,三、蛋白质类药物的分类与作用 激素、细胞生长调节因子、血浆蛋白质、黏蛋白、胶原蛋白、碱性蛋白质、蛋白酶抑制剂、植物凝集素,5,四、多肽和蛋白质类药物的性质 酸碱性解离 等电点pI 离子结合 蛋白质形成的盐在组织中广泛存在；小离子与蛋白质特异性结合在组织和体液中起重要作用。,6,胶体性质电荷和水化膜 应用：除杂 变性 三维结构破坏,7,五、多肽和蛋白质类药物的制备 提取分离纯化 化学合成法 蛋白质工程法,8,提取分离纯化,原材料选择,预处理,多肽和蛋白质药物提取,纯化,来源丰富、目的物含量高、成本低,破碎、防止变性,水溶液提取、有机溶剂提取,（溶解度、分子大小形状、电性等）,9,蛋白质工程法 更换活性蛋白质的关键氨基酸残基 调整蛋白质分子的某些肽段、结构域或寡糖链，生成合适的糖型，产生新的功能 功能互补的两种基因工程药物在基因水平上融合,10,第二节、蛋白质分子设计与合成,11,蛋白质工程与蛋白质设计的术语是20世纪80年代初产生的。通过序列修饰改造改变蛋白质的性质并有应用价值的第一个报道引起了人们广泛的关注，纷纷成立了蛋白质工程及设计的专门机构。尽管通过蛋白质工程研究已取得许多激动人心的成果，但是通过蛋白质设计产生一个结构确定、具有新的所希望性质的稳定的新蛋白质并不容易。,12,公开性蛋白质研究组织,13,蛋白质设计的目的和类型 为蛋白质工程提供指导性信息； 探索蛋白质的折叠机理。 蛋白质设计分为基于天然蛋白质结构的分子设计及全新蛋白质设计（蛋白质从头设计）。,14,蛋白质设计目前存在的问题 设计的蛋白质与天然蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性。所有设计的蛋白质有正确的形貌、显著的二级结构及合理的热力学稳定性，但一般说来它们的三级结构的确定性较差。,15,从图2-1(a)看出，天然蛋白质有确定主链结构及侧链构象。图2-1(b)所示的设计蛋白质的结构是一组低能构象的集合，缺乏结构独特性。,16,蛋白质设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。 蛋白质设计及结构与功能关系研究的必要性。 蛋白质设计是多学科的交叉领域。 蛋白质设计在许多方面取得的显著进展。,17,基于天然蛋白质结构的分子设计,一、概述 蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的，蛋白质的结构涉及一级结构(序列)及三维结构。即使蛋白质的三维结构是已知的，选择一个合适的突变体仍是困难的，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。,18,计算机模拟,基因构建,突变蛋白质产品,功能分析,蛋白质设计循环,19,蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面,在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选。测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。,20,专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。 在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。,21,22,设计目标及解决办法,蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。 Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。,23,蛋白质设计的目标及解决办法,24,蛋白质突变体的设计涉及如下3个步骤。 （1）从天然蛋白质的三维结构出发(实验测定或预测)，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。这是非常关键的步骤，一般应注意如下问题。 a应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等。 b应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功能关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上的考虑。,25,c应该考察剩余位置对所希望改变的影响。 d当进行互换或插入删除残基时应考虑它们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等。同时也要考虑它们对蛋白质功能的影响。互换或插入/删除区域一般都在外环。有如下一些假设：氨基酸侧链的改变不会影响该主链折叠的改变，插入/删除某些部分不会影响表面区域，侧链交换遵守蛋白质结构保守原则。 （2）利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构。 （3）预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质。 在上述设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新的蛋白质。,26,计算机蛋白质设计只是有效实验设计的一种方法。它不能替代实验，正像蛋白质结构预测不能替代蛋白质结构测定一样。如果一个科学家设计一种具有新的催化性质的酶，他必须了解催化过程及机理；了解蛋白质的结构化学、生物化学方面的知识。因此蛋白质设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密结合。,27,内核假设 所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。 假定蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中残基的相互作用所决定。,二、蛋白质设计原理,28,内部密堆积，并且没有重叠。 由两个因素造成的。 分子是从内部排出的，这是总疏水效应的一部分； 由原子间的伦敦色散力所引起的，是由于短吸引力的优化。,29,氢键都是最大满足的 蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所替代。随着溶剂键的断裂所带来的能量损失是由折叠状态的重组以及可能释放一个结合的水分子而引起的熵的增益所弥补。,30,疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。 对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。 最优的氨基酸侧链几何排列 结构及功能的专一性。,31,三、蛋白质设计中的结构功能关系研究,蛋白质结构功能关系的重要性 蛋白质的序列、三维结构，热力学及功能性质之间的关系是目前广泛关注的热点。它对于蛋白质工程及蛋白质设计都是非常重要的。对蛋白质结构与功能的认识过程始于蛋白质中重要功能残基及蛋白质与其他分子相互作用的确定。,32,定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用 通过定位突变替换单独的氨基酸残基是分析功能残基的有力工具。选择突变残基，最重要的信息来自结构特征。因此如果蛋白质的立体结构是未知的，则突变功能残基的研究带有不确定性。,33,定位突变种类,插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。,34,突变蛋白质结构的评估,溶解性 热力学分析 射线晶体学及谱 园二色谱方法 单克隆抗体探测构象变化,35,热力学分析可以用于测量突变蛋白质的热稳定性及化学变化自由能，并可作为构象整体性的检测。 X射线晶体学及NMR谱可以直接提供突变蛋白的高分辨率结构及评估结构整体性。 圆二色谱方法是可用于分析突变体结构的另一生物物理方法。,36,蛋白质中功能残基的鉴定,根据已知结构信息确定功能残基 突变法鉴定功能残基 利用蛋白质同源性鉴定功能残基,37,不同动物胰岛素在A链中的差异,38,四、天然蛋白质的剪裁,什么是分子剪裁：分子剪裁是指在对天然蛋白质的改造中替换1个肽段或一个结构域。 将小鼠单克隆抗体分子重链的互补决定簇用基因操作方法插到人的抗体分子的相应部位上，使得小鼠单抗分子所具有的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。这项实验有重要的医学价值。,39,结构域由螺旋、折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。 构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。,五、结构域的拼接,40,41,六、结构与功能的容忍度,蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。,42,Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23的突变体保留了酶的活性。 Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。,43,全新蛋白质设计,一、特征 全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白质或多肽的氨基酸序列。,44,全新蛋白质设计是根据所希望的结构及功能设计序列，称反折叠研究。蛋白质的功能是直接与它的三维结构相关的，通过序列的改变来操纵结构提供功能的多样性。基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，改善它们的药效动力学性质。而全新蛋白设计是另一类蛋白质工程，它合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。,45,二、 蛋白质的全新设计内容,蛋白质结构的从头设计 蛋白质功能的从头设计,46,三、蛋白质结构的从头设计,二级结构模块单元的自组装 配体诱导组装 通过共价交叉连接实现肽的自组装 在合成模板上肽的组装 线性多肽折叠为球状结构 基于组合库的全新蛋白质设计,47,设计一个新奇的蛋白质结构的中心问题是设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列。要达到这个目标需要克服的基本障碍是线性聚合链的构象熵。例如，如果在具有100个残基的蛋白质中每个残基采取10个可能构象中的一个构象，则这条链折叠成为确定的三维构象所消耗的熵是568.48kJmol。这个数字代表不合适的自由能的真实的量。因此要实现正确的折叠必须借助于许多合适的相互作用，要使一个序列能折叠为确定的三维结构，设计的相互作用能必须超过构象熵。,48,可以采用不同的策略达到这个目标。最主要是使相互作用的强度与数目达到最大。另一个策略是通过共价交叉连接减小折叠的构象熵。根据第一原理设计一个蛋白质，我们必须依赖于分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元，例如螺旋、折叠片、(环)以及转折，得到一些结构知识，这些知识涉及氨基酸形成二级结构的倾向性等。十多年来，科学家对螺旋已有很好的认识，近几年的重点在于二级结构在三维空间形成的独特的构象通过长程相互作用可控形成超二级结构。我们可以有把握地设计并合成螺旋束，折叠片以及模块，它们的形成规律比较清楚，成功的概率也比较高。蛋白质中不同层次的结构组织见图2-6。,49,50,分析己知结构的蛋白质，可以认为复杂的三级折叠和四级结合可以分解为有数的二级结构单元，例如螺旋、串、转角，它们通过LOOP连接为三级结构。特殊折叠的稳定性是由一定距离残基间键相互作用决定的。 全新蛋白质设计要求很好地认识蛋白质结构及稳定性的规律。在了解残基形成二级结构单元的倾向性后，要安排残基的最大的疏水相互作用形成一个紧密的疏水内核。离子相互作用及氢键可以进一步用于稳定蛋白质的结构。另外一种途径是根据主链的构象限制设计二级结构。,51,1二级结构模块单元的自组装 设计新的蛋白质结构的最简单、最直接的策略是合成单一二级结构单元(螺旋或折叠股)作为多肽链的片段的模块途径，然后复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。通常，这些二级结构是两亲性的。疏水表面埋藏在内核形成紧密的蛋白质结构中，如图2-7所示。,52,2配体诱导组装 全新蛋白质设计的第二个策略是使用一个配体(典型的是一个金属离子)诱导模块蛋白片段的组装，如图2-10所示。一个配位结合位点设计在结构中几个相互作用片段的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并驱动肽自组装。,53,3通过共价交叉连接实现肽的自组装 设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当几个没有连接的肽链进行自组装时，熵势垒是比较难以克服的。通过共价交叉连接可以减少构象熵。因此共价连接他们的预组织肽是直接形成所希望结构的有力途径，如图2-13所示。,54,4在合成模板上肽的组装 Mutter及其合作者发展了一种模板组装合成蛋白(TASPs)方法。他们不是使用天然蛋白中的turn和loops连接二级结构单元，而是使用图2-16中所显示的人工模板。同天然线性蛋白质不同。螺旋和折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。TASP分子的螺旋和股通过模板结构导向形成所希望的构象。,55,5线性多肽折叠为球状结构 不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠形成球形的确定的三维结构是全新蛋白质设计追求的目标之一。把一个线性肽折叠形成独特的三维结构的主要障碍是构象熵，这需要精心设计一系列的相互作用才能稳定结构。这方而工作已取得重大进展。,56,6基于组合库的全新蛋白质设计 蛋白质组学是目前备受关注的新领域，它包括天然蛋白质的多样性、相互作用、结构以及功能。它回答的问题是“什么是天然存在的”。组合库方法要回答的问题是“什么是可能的”。要问答这个问题是要构筑大的全新蛋白质库。比较库中的全新蛋白质与自然进化选择的蛋白质，可以得到很多有用的信息。,57,所有可能的氨基酸序列是一个天文数字，例如一个含有100个残基的序列可能有20100种。但是实际能形成独特三维结构的序列仅占序列空间的很小部分。 组合库的构筑既要顾及序列的多样性又要利用合理设计大大减少序列的数目。,58,组合库设计的一个核心问题是埋藏疏水部分。一个常用的方法是基于极性（P）和非极性(N)氨基酸的“二元模式”。“二元模式”一方面要有利于形成二级结构，另一方面又要埋藏疏水残基。二元模式可用于二级结构两亲片段，一面完全是极性残基，另一面完全是非极性残基。,59,组合库的设计中要考虑优化疏水核，通过筛选发现最优的堆积相互作用。主要使用两种筛选方法：第一种是使用一维1H-NMR谱；第二种方法是使用电喷雾质谱(ES-MS)观察H-D交换动力学。除了考虑疏水核堆积外还要考虑优化二级结构单元间的界面。 近年来发展了一些计算机辅助设计方法，在开始实验之前先进行计算机筛选。一般分为两步，第一步建立侧链的旋转构象库(rotemer)；第二次把Rotomer库作为输入，计算低能序列组合的可能性。,60,三、蛋白质功能的全新设计,蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功