果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定.doc

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定摘要目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段，经酶切亚克隆至pGL3Basic的真核表达载体中，转染果蝇S2细胞，通过测定荧光素酶和半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3Control中增加了2.7万倍。结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3pac。 关键词果蝇S2细胞；荧光素酶；启动子；报告基因；转染 在研究基因功能的过程中，不可避免地要研究基因的调控机制，而基因的表达产物复杂且难以对其定量和定性，要在细胞生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但报告基因分析系统的发现给基因调控与表达的研究带来了新的希望。近年来，报告基因系统的研究取得了快速的发展。报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，因此，对真核基因调控的了解可以不通过直接测定调控元件调节转录速率的能力，而是把顺式调控元件与报告基因的序列连接起来，在基因转录的过程中测定报告基因转录产物的表达量，从而判断相应的顺式作用元件的调控能力。作为报告基因必须具备以下特点：（1）由原核基因编码的基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）细胞内其他基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高、重复性好。该技术的主要优点是灵敏度高、可信性大及检测方便且适合大规模检测，目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件13。荧光素酶（LUC）报告基因来源于北美萤火虫，能催化萤火虫的氧化性羧化作用，同时发射出光子，可被光度计捕获定量。LUC的分析具有快速、方便、线性较好等优点，正成为最广泛使用的报告基因。pGL3系列的质粒就是带有LUC报告基因的质粒载体，我们可以利用这一系列的工具载体研究果蝇中基因的表达调控方式，其中pGL3Control带有SV40的启动子和增强子。SV40是一种猴病毒， 它的增强子/启动子区域可使其在大多数细胞株中有高度的组成性表达，因而广泛用于构建真核基因的表达载体，因此pGL3Control可作为检测体系中的阳性对照。但由于SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达，所以我们将果蝇actin 5C 蛋白的启动子（pac）4构建到质粒pGL3Basic中，得到了高表达LUC的重组载体pGL3pac。这一质粒的构建可为研究果蝇中基因的调控方式奠定基础，同时也可为研究其他报告基因在不同细胞中的表达提供借鉴作用。 1 材料和方法 1.1 菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5（作者所在实验室保存），质粒pGL3Basic(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性内切酶Xho、Hind及T4连接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量胶回收试剂盒(TaKaRa公司)，中量质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)，LUC检测试剂盒(Promega公司)，S2细胞Schneider培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。 12 方法 1.2.1 pac启动子的获得 以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板进行PCR扩增。上游引物5GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3,下游引物5GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3（划线部分分别为Xho和Hind酶切位点）。PCR反应参数为：95 5 min；94 1 min，60 1 min，72 2 min，共30个循环； 72 延伸10 min。 1.2.2 重组质粒的构建鉴定与中量抽提纯化 PCR产物分别经Xho、Hind双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切片段，与同样经酶切、割胶回收的pGL3Basic质粒于16 连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5，并涂布于含氨苄青霉素（终质量浓度为50 mg・L-1）的固体培养基上，37 过夜培养。挑阳性克隆提取质粒，酶切和测序鉴定，鉴定正确的质粒经中量质粒抽提试剂盒提取纯化。 1.2.3 S2细胞培养及瞬时转染 S2细胞由本实验室冻存，使用Schneider培养基，补以10%胎牛血清。S2细胞培养在28 无CO2培养箱中，根据其生长状态，按一定比例每3 d传代1次。待细胞生长状态良好时进行瞬时转染分析。转染时在12孔板中接种1106个细胞，加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培养基，置28 无CO2培养箱中培养616 h细胞生长至对数生长期达（24）106ml-1，在1.5 ml Eppendorf 管中准备以下试剂：溶液A,12 l 2 mol・L-1 CaCl2，5 g重组质粒,1 g pAcLacZ质粒，加入双蒸水至总体积为100 l，混匀待用；溶液B,100 l2HBS。将A溶液缓慢加入B溶液中，轻轻混匀，室温放置30 min，以形成Ca3PO4DNA复合物。将Ca3PO4DNA复合物逐滴加至细胞上，混匀后置28 无CO2培养箱中继续培养，24 h后用含10%胎牛血清的Schneider培养基给细胞换液。细胞转染48 h后裂解细胞，先吸去培养液，用PBS洗2遍，在每个培养孔中加入200 l Reporter lysis buffer，保证充分覆盖细胞，冻融1次以确保细胞裂解，将细胞裂解液移至1.5 ml Eppendorf管中，振荡1015 s，离心（12 000g，2 min，4 ），转移上清于新管。制备好的细胞裂解液可用于测定或贮存于-70 备用。 1.2.4 LUC和半乳糖苷酶(gal)活性测定 取制备好的细胞裂解液进行LUC和gal活性的测定。LUC活性测定前取20 l平衡至室温的细胞裂解液，加入80 l LUC底物，迅速混匀，置光度计中，记录读数。gal活性测定根据分子克隆的方法，在每个用于测定转染细胞裂解物的Eppendorf管中加入100Mg2+ 3 l、1ONPG 66 l、细胞裂解物30 l、0.1 mol・L-1Na3PO4 201 l,混匀。置37 保温30 min，以500 l 1 mol・L-1 Na2CO3终止显色反应。置酶标仪上，在波长420 nm处读光吸收值来表示gal的活性，以共转化的gal活性作为内源对照，以/gal活性的值为系数，比较各组在转化效率相同时LUC活性的相互关系。以没有任何插入片段时pGL3Basic的LUC活性为1，比较加上插入片段pac启动子后的LUC活性增加的倍数，即LUC的相对活性，以反映LUC基因表达的相对水平。 2 结 果 2.1 重组载体的构建鉴定与纯化以pAc5.1/V5His/LacZ质粒为模板，通过上游引物和下游引物PCR扩增获得pac启动子2 500 bp基因片段（图1），用Xho、Hind双酶切后克隆到载体pGL3Basic中（图2）。提取重组阳性质粒，Xho、Hind双酶切后得到2 500 bp的基因片段（图1）。经测序鉴定，阅读框架不变。鉴定完成的重组质粒经过质粒中量抽提试剂盒提取纯化，得到符合转染所需的高纯度高浓度的重组质粒pGL3pac，经测定其260 nm的OD值，计算得到其浓度为0.99 g・l-1,A260 nm/A280 nm为1.81。 2.2 S2细胞的瞬时转染分析转染结果显示，pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相对活性无明显差异，提示SV40启动子在果蝇S2细胞中不表达或低表达。而pGL3pac中插入了pac启动子，LUC的相对活性明显增高。pGL3pac在果蝇S2细胞中LUC的活性是pGL3Basic LUC活性的近2.7万倍。见表1。表1 瞬时转染后各组分酶活性值 3 讨 论LUC是现在常用的一种报告基因,因其无放射性、检测快、灵敏度高、半衰期短、线性好等特点而得到广泛的应用。我们构建了pGL3pac这一重组质粒，使得在果蝇S2细胞中能够高表达LUC，为进一步的实验提供了一个好的工具。首先，它可作为基因启动子分析研究中的阳性对照,通过与该重组质粒的转染结果比较,从而判定不同顺式作用元件对转录的影响。其次，我们可以将目的基因某一区域的启动子元件插入到重组质粒pGL3pac启动子的上游或下游，通过LUC表达量改变的放大作用，进一步分析这些启动子元件的生物学作用，找到在转录过程中起到关键作用的核心启动子序列。在此基础上，我们还可以了解特定的反式作用因子对基因表达的影响。再次，还可以将目的基因自身的5端或3端的UTR序列插入到LUC基因的上下游，通过检测LUC的水平，为翻译水平的调控提供依据。在实验过程中，有很多方面值得我们注意。第一，在重组质粒利用中量试剂盒抽提纯化时，想得到浓度高的产物，应注意在菌液的培养量和培养时间上进行调整。因实际环境的不同，按照操作说明所示的条件往往难以得到足够的质粒量，通过增加培养的菌液量和延长培养时间可取得很好的效果。由于所得的质粒是细胞转染所需，故在抽提纯化时应特别强调无菌的原则。第二，在转染实验中，重组质粒pGL3pac必须共同转染表达另外一带有报告基因的质粒以衡量转染效率。我们选择了pAcLacZ，该质粒含lacZ基因，能够表达gal，利用gal水解底物ONPG的能力计算出gal的活性，以此作为内源对照衡量不同组分的转染效率。这个质粒与目的质粒的转染比例对于结果有很大的影响。因gal的活性在0.20.8之间符合线性范围,所以可根据这一要求摸索合适的转染比例，通过实验可得出两者在51浓度比时较合适。另外，还可以选择带有其它报告基因的质粒载体，如phRL是一种带有海肾荧光素酶（RLUC）报告基因的质粒载体，如果选择phRL作为共转质粒则可通过在一管细胞裂解液中先后加入不同的底物，用同种仪器测定酶的活性即可，因其测定的两种酶的活性在同一数量级而且减少实验步骤，使实验数据更加可靠，实验过程更加简便5。第三，我们是通过瞬时转染得出结论，为排除一些因素的影响，转染实验必须重复3或4次，本实验的转染数据即是3次实验的平均值。在实验中我们选择了pac替代pGL3Control中的SV40启动子，主要是因为果蝇actin 5C蛋白组在果蝇体内为组成性表达且不需诱导，因此，利用pac作为替换启动子，不仅能产生较好的效果而且可简化实验操作。这一质粒的构建不仅为我们在细胞水平利用报告基因系统研究果蝇中基因的表达调控方式提供工具载体，而且它的构建方法提示我们可通过相同的途径构建适合转染不同类型细胞的带有报告基因的质粒载体，作为相应研究的基础。 参考文献 1LOUISE H. Reporter gene technology：the future looks bright J.Biochem Pharmacol,1999,58:749757. 2GAMBHIR S S，BARRIO J R，HERSCHMAN H R，et al. Assays for noninvasive imaging of reporter gene expression J. Nucl Med Biol，1999，26：481490. 3LECLERC G M，BOOCKFOR F R,FAUGHT W J,et al.Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression J.Biotechniques,2000,29:590596. 4ARNOSTI D N.Design and