头花蓼茎段愈伤组织的诱导以及再生体系的建立

毕业论文（设计） 本科毕业论文（设计）题 目: 头花蓼茎段愈伤组织的诱导以及再生体系的建立 专 业： 生物工程 目 录头花蓼茎段愈伤组织的诱导以及再生体系的建立- 5 -摘要- 5 -ABSTRACT- 5 -Keywords- 6 -第一部分 文献综述- 6 -1.1 头花蓼研究概况- 7 -1.1.1头花蓼作为景观植物的研究- 8 -1.1.2 头花蓼的成分分析- 8 -1.1.3 组织培养- 9 -1.1.3.1 种子的萌发和育苗技术- 9 -1.1.3.2 组织培养- 9 -1.1.3.3 再生体系的建立及四倍体诱导- 9 -1.2 影响头花蓼组织培养的因素- 10 -1.2.1外植体- 10 -1.2.2 基本培养基- 10 -1.2.3 激素- 11 -1.2.4 附加物质- 11 -1.2.5 培养条件因素的影响- 11 -1.2.6实验过程注意事项- 11 -1.3 头花蓼组织培养的意义- 12 -第二部分 正文- 12 -2.1 材料和方法- 12 -2.1.1 实验材料的获取- 12 -2.1.2 实验方法- 13 -2.2 培养条件- 13 -2.3 培养过程- 13 -2.3.1 胚芽获得- 13 -2.3.2 无菌苗的获得- 13 -2.3.3再生植株的获得- 14 -2.4 结果与分析- 14 -2.5 结论与讨论- 14 -参考文献：- 15 -致谢- 17 -头花蓼茎段愈伤组织的诱导以及再生体系的建立摘 要头花蓼是贵州少数民族地区常用的草药，具有极大的药用价值和经济价值。本实验以头花蓼无菌茎段为原材料，通过头花蓼种子在无菌环境中萌发出胚芽；胚芽生长成完整植株（无菌苗）；无菌苗茎段获得再生植株得的过程。目的是减少培养过程，缩短培养时间，提高组培效率。实验结果：（1）胚芽的获得：以头花蓼种子为原料，以MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)为培养基，诱导胚芽萌发；（2）无菌苗的获得：以（1）中的胚芽为材料，接种到MS培养基中，在光照下培养获得无菌苗；（3）再生植株的获得：以（2）中的无菌苗为材料，剪切下茎段，接种到MS+2mg/L ZT+0.4mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)培养基上，培养获得再生植株。关键词:头花蓼;胚芽;无菌苗;再生植株。ABSTRACTPolygonum Capitatum is commonly used herbs in Guizhou Minority Areas, has great medicinal value and economic value. In this experiment, the first flower stem section Polygonum sterile raw materials, through the head Polygonum seeds sprout germ in a sterile environment; germ grow into whole plants (no vaccine); aseptic stem segments obtain regenerated plants was process. The purpose is to reduce the training process and shorten the incubation time, improve the efficiency of tissue culture.Results:(1) germs obtained: the first flowers Polygonum seeds as raw material, MS + 2mg / L 6-BA + 0.5mg / L NAA + 30mg (sucrose) + 9mg (agar) for the medium to induce embryo germination;(2) aseptic obtained: in (1) the germ of material inoculated into MS medium, and cultured in the light no vaccine;(3) Regeneration Plants: A (2) no vaccine for the material, sheared stem, inoculated into MS + 2mg / L ZT + 0.4mg / L NAA + 30mg (sucrose) + 9mg (agar) on the medium, cultured plant regeneration.Keywords: Polygonum capitatum; germ; no vaccine; regenerated plants.第一部分 文献综述头花蓼（Polygonum capitatum）是蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）多年生草本植物，又名四季红、石莽草、骨虫草等。头花蓼生长在海拔600-3500米的地区，在我国主要分布在江西、湖南、湖北、四川、贵州、广东、广西、云南及西藏等地；在国外主要分布在尼泊尔、不丹、印度、锡金、缅甸和越南等地。头花蓼喜欢生长在阴暗湿润的环境中，常生在草甸石上，常绿阔叶林中， 常绿林中， 稻田边， 干旱山坡， 干旱田中， 耕地， 沟渠边， 河边，荒地，树 林中， 路边，墙边， 沙滩， 山谷，石缝中。头花蓼根系发达，茎匍匐丛生，叶片略带红色，有大量腺毛；叶面上还有有黑褐色新月形斑点；花期长（1-12月），花球红色或粉红色，成片生长时具有良好的景观效果，因此可作为一种园林观赏植物。头花蓼全草均可入药，具有清热、凉血、利尿、止痢的功能；主要治疗膀胱炎、肾孟肾炎、痢疾等季疾病。头花蓼是贵州苗族地区常用的草药，也是贵州着重发展的“六大苗药”之一。贵州威门药业股份有限公司以头花蓼为原料生产“热淋清”颗粒，该颗粒对泌尿系统疾病有独特疗效、服用方便且无毒无副作用等特点，深受东南亚地区人民的欢迎和认同。该公司每年需要上百吨头花蓼用于生产“热淋清”颗粒，然而贵州省头花蓼野生资源有限（蕴藏量大约有300000kg），由于常年采摘，自然储量已越来越少。此外，头花蓼也有较高的经济价值（据贵州省施秉县药材价格数据显示，贵州头花蓼鲜活6元/公斤，按每亩400kg产量 计算，可比种植玉米增收500-800元）。基于上述两点原因，贵州已开始大面积人工种植头花蓼（例如：施秉县头花蓼GAP种植基地和织金县头花蓼基地）。随着药材市场需求量的不断增加和头花蓼人工种植面积的不断扩大，掀起了科学实验者们对头花蓼研究的热潮，头花蓼的研究正在进入一个全新的时代。研究的内容有：研究头花蓼种子种植技术，头花蓼化学成分分析，药用成分研究，茎尖快速繁育，还有头花蓼茎段组织培养技术，但是关于头花蓼无菌苗茎段研究的很少。因此，本实验在无菌环境下，通过头花蓼种子消毒灭菌后在光照培养箱中萌发出胚芽；胚芽生长成完整植株（无菌苗）；无菌苗茎段培养获得再生植株的过程，建立了头花蓼茎段的再生体系。1.1 头花蓼研究概况从德国植物学家GHaberlandt 19世纪初提出植物细胞组织培养的设想到现在，通过长期的科学研究，植物细胞的全能性和器管分化、体细胞胚胎发育的激素调节得到了证实；植物组织培养技术也有了迅速发展。组织培养技术的广泛运用使得植物繁育体系发生了很大的改变。组织培养技术已经成为了人们获得理想植株最常用的方法之一。组织培养技术可以得到和母本性状保持一致的子代，这在果树培育、濒危植物的延续方面已经得到运用；新品种的开发，也离不开组织培养，例如无籽西瓜。头花蓼是1959年在铜矿区发现的生长旺盛的优势草本植物1；1999年，贵阳中药现代化科技产业实施方案颁布以后2，为头花蓼的深入研究提供了条件。以头花蓼为原料生产的热淋清药物开始用于尿道炎治疗，疗效显著3；其后，头花蓼的研究主要在头花蓼的药用成分分析以及热淋清药物治疗泌尿系统疾病方面4-6；直到2005年，才有了关于头花蓼种子繁育的报道7；在之后的10年中，头花蓼的研究的不断的发展深入到各个方向：1.1.1头花蓼作为景观植物的研究头花蓼叶面上还有有黑褐色新月形斑点，花期长，花球红色或粉红色，成片生长时具有良好的景观效果，因此可作为一种园林观赏植物8。2014年，刘艳丽，付飞跃和王海洋三人以头花蓼为研究对象，通过屋顶种植槽,设置实生苗幼苗期3种不同水分及成苗期6种不同水肥处理,对比分析其适应性,探讨景观价值.结果表明:幼苗期,头花蓼在900mL的浇水量下,生长最佳,经历30d,叶片大小稳定;成苗期,头花蓼在浇水1 600mL施氮肥处理下,生长最佳;头花蓼植株80d成坪,种群平均盖度为91%,花期持续时间为240d,可作为屋顶绿化地被材料9;韦美玉和赵洪对野生头花蓼形成的景观效果进行研究，发现它的茎、叶、芽、花等具有较高的观赏价值,可作为花卉开发利用10。1.1.2 头花蓼的成分分析2000年，李勇军，王永林，胡昌奇等人对头花蓼的黄酮类物质进行研究，首次在头花蓼中分离出了槲皮素、槲皮苷、陆地棉苷和槲皮素-3-O-(2 没食子酰基)-鼠李糖苷11；许乾丽对头花蓼和头花蓼制剂进行研究，发现了主要有效活性成分是没食子酸12；2003年，张丽艳、杨玉琴和高言明等人对不同产地、不同季节头花蓼的黄酮含量进行测定，结果显示不同采收期的的头花蓼中总黄酮含量差异明显，在8月和9月含量最高13；2005年，赵德刚、刘世会和高玉琼等人对头花蓼挥发性成分研究，分离出88个成分,确定了51个化合物,占挥发油总量的73.10%14；赵叶，张开霞，刘军等人对头花蓼水提取物化学成分进行研究，结果分离鉴定了15个化合物,分别为龙胆酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、木犀草素、儿茶素、水飞蓟宾、大豆苷、杨梅苷、芦丁、槲皮素、槲皮苷、五味子苷、山柰酚、尿嘧啶、苯丙氨酸。其中龙胆酸、没食子酸甲酯、木犀草素、大豆苷、尿嘧啶、苯丙氨酸为首次从头花蓼中分离得到15。1.1.3 组织培养1.1.3.1 种子的萌发和育苗技术2003年，贵州省启动中药现代化产业种植基地、2004年贵州全力打造中国药谷的期刊发布以及贵州威门药业生产的热淋清药物在治疗泌尿系统疾病取得的良好效果16-18，推动了贵州省头花蓼的现代化、产业化发展，同时也加快了科研人员对头花蓼快速繁殖研究的步伐。2006年，王新村和孙长生等人通过对影响头花蓼种子育苗的因素（育苗基质、覆土厚度、播种方法、播种后保温保湿措施等）进行系列试验研究,提出了头花蓼种子育苗的可行方法,并研究制订了种苗质量标准19；吕小梨、赵 致、王华磊对头花蓼种子发芽条件(温度、盐胁迫和培养方式)的研究，得出在种子15摄氏度时发芽率最高，在同一温度条件下光培养比暗培养发芽率高,纸间比纸上发芽率高的结论20；孙长生，韩见宇，魏升华等人也对头花蓼种子育苗技术做了进一步研究21。1.1.3.2 组织培养继头花蓼种子育苗技术研究之后，为了满足头花蓼产业化种植的需要，科研人员的研究也进一步深入到头花蓼的组织培养和快速繁育方面。2006年，龙祥友和孙长生以头花蓼茎尖为实验材料，以MS为基本培养基，以6-BA和NAA作为生长调节剂，通过丛芽诱导培养、增殖诱导培养、生根诱导培养获得苗根22；毛堂芬和朱英以当年新生的植株的中部茎段为外植体，在超净台上，先用75%的酒精消毒10-20秒，再用0.1%的升汞消毒4-5分钟，无菌水冲洗4-5次后，然后切小段极性接种在不同浓度培养基（MS、1/2MS、6-BA和B5）上，通过继代培养和生根培养获得幼苗23；马鲜，赵德刚，杨琴和苏莲等人报道了不同方法对头花蓼组织培养实验材料消毒效果的影响24；1.1.3.3 再生体系的建立及四倍体诱导刘世会，龙凤荣，赵德刚等人以头花蓼无菌苗顶芽为外植体,MS为基本培养基,通过顶芽直接诱导丛生芽、丛芽增殖培养、生根培养、移栽炼苗,以建立头花蓼组培快速繁育体系。结果表明:头花蓼丛生芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.10mg/L+30g蔗糖/L+9g琼脂/L；最佳芽增殖培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+30g蔗糖/L+9g琼脂/L；组培苗生根的最佳培养基为1/2MS+NAA 0.10 mg/L+30g蔗糖/L+9g琼脂/L；在腐殖土中,幼苗移栽成活率达100%,植株生长良好25。郭彪在研究头花蓼再生体系的建立及四倍体诱导的实验中，通过不同的消毒方法、更换培养基种类、添加活性炭、添加不同植物生长调节剂等方法对头花蓼的叶片和茎段进行处理，并利用秋水仙素诱变头花蓼的不同器官获取纯合的四倍体，然后进行四倍体及二倍体的形态学、细胞学及抗逆性等特性进行分析比较,为头花蓼育种的研究提供了基础性资料。研究结果如下：1消毒、叶片用70%的酒精消毒10秒，无菌水洗3-4次后用0.15%的升汞消毒6分钟；茎段用10%的升汞消毒毒9分钟效果最好。2再生体系的建立用江段作为外植体效果最好。3愈伤组织在生长的过程中会出现褐变、畸形或玻璃化的现象，添加活性炭对褐变有抑制作用。4用化学诱变剂秋水仙素诱导头花蓼多倍体植株,不同组织或器官都可以得到变异株,获得的变异株均为嵌合体26。1.2 影响头花蓼组织培养的因素1.2.1外植体外植体选择是头花蓼的组织培养的第一步，也是最重要的一步。外植体的选择直接影响之后的实验。头花蓼在组培中用得最多的外植体是顶芽、茎段、叶片和茎尖。不同的外植体愈伤组织的发生率、植株的再生性都有着很大的差异。刘世会，赵德刚等人的研究表明：最佳的丛芽在MS+2.0 mg/L 6-BA +0.10 mg/L NAA下的诱导增值倍数是7.1倍，在MS+2.0 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA的诱导下芽的增殖倍数是10倍；头花蓼的茎段作为实验的主要材料是因为其表面的纤毛很少，没有气孔，所携带的杂菌少；茎尖是作为实验的材料是因为它分生能力强，能很快长出愈伤组织或新的植株；叶片的使用是因为其量多，最易获得，但也存在着杂菌多，分化能力弱的特点。1.2.2 基本培养基植物组织培养常用的基本培养基有MS和1/2MS, 也有使用N6、MT、B5等其他培养基的，头花蓼组织培养主要使用的培养基是MS，琼脂使用的浓度为9g/L,蔗糖浓度为30g/L, 头花蓼组织培养中使用的是固体培养基，不用液体培养基，pH值5.80-6.0之间。1.2.3 激素植物组织培养成功的关键是激素的种类和比例，生长素，赤霉素，细胞分裂素，脱落酸和乙烯等五大类基本植物激素是实验常用的激素。一般认为，生长素和细胞分裂素很重要，不同浓度的配比决定着实验的走向。低浓度2.4-D有利于胚状体的分化，NAA有利于单子叶植物分化，IBA诱导生根效果最好。普遍认为细胞分裂素对头花蓼愈伤组织分化和芽分化诱导是必需的。在已知的所有文献中，6-BA是头花蓼组织培养中用于芽的诱导培养和芽的增殖培养效果最好的生长调节剂。毛堂芬和朱英的研究表明：添加4.0mg/L的6-BA时芽的增殖倍数达最高4.2，且植株生快，长势旺盛，有利于组培苗的大量繁殖，6-BA和NAA之间具有协同作用。1.2.4 附加物质头花蓼组织培养中使用的附加物质很多,有机成分为肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸或VPP，使用浓度一般比较低，为（0.1-100mg/L）。生根诱导中也会使用的活性碳之类的物质,但是这些物质成份复杂和具有不确定性，因此常用在研究上。 1.2.5 培养条件因素的影响温度、光照时间、光强和湿度对头花蓼组培都有一定影响。头花蓼组织培养条件一般的要求是:温度24-27,光照强度1 5003 500 lx，光照时间12小时/天，湿度为70%-85%。1.2.6实验过程注意事项为了减少材料因操作不当而染菌，实验过程应注意以下问题：1）、实验材料现取现用，不能放置太长时间。2）培养基应在接种前配好，冷却凝固。3）材料消毒洗净后用滤纸吸干水分，尽快接种。4）接种过程中要经常用75%的酒精擦手和超净台桌面。5）镊子、剪刀在使用时最好只用一次，然后灭菌。6)材料剪好之后立即接种。7）材料接种后用封口膜封好。1.3 头花蓼组织培养的意义随着社会的需求面的不断扩大和人们保健意识的不断增强，无毒无副作用且治疗效果显著的药物已经是人们日常生活中用药的首选。随着头花蓼为原料生产的“热淋清”颗粒对泌尿系统疾病的疗效不断增强、再加上服用方便且无毒无副作用，热淋清颗粒受到广大人民的欢迎，所以每年贵州省威门药业股份有限公司需要上百吨头花蓼用于生产“热淋清”颗粒27。为了满足药材市场对头花蓼每年不断增长的需求，人们已经开始人工规范化、产业化种植头花蓼，但这都需要科学技术的支撑。为了给头花蓼的快速繁育和再生体系的建立提供参考，本实验以头花蓼（无菌苗）茎段为实验材料，通过组织培养，直接获再生植株，减少愈伤组织增殖培养和诱导愈伤生根、生芽环节，目的是缩短组织培养时间，提高组培效率。第二部分 正文2.1 材料和方法2.1.1 实验材料的获取 头花蓼的种子用自来水浸泡24小时后，在超净台上，先用75%的酒精消毒50秒后，无菌水洗3-4次，然后用0.1%的升汞消毒10分钟，无菌水洗3-4次，最后接种到MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)的培养基上，放在光照培养箱中培养至露出胚芽，将胚芽转接到MS培养基中，放在光下培养成无菌苗，剪切下无菌苗的茎段作为实验材料。2.1.2 实验方法将剪切下的头花蓼无菌苗茎段（长度约0.5-1CM）（超净台中）接到MS+2mg/L ZT+0.4mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂) 和MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)培养基中，在光照培养箱培养。 2.2 培养条件培养条件：温度25士2，光照时间(光照/黑暗)12h/12h，光照强度？。培养基条件：pH 5.855.88，121灭菌20min ，MS加蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L。植物激素: 6-BA, NAA，ZT。2.3 培养过程2.3.1 胚芽获得将头花蓼种子放在大烧杯（1000ml）中，用自来水浸泡24小时，去除悬浮在水面上的种子，将沉在烧杯底的种子倒入小烧杯（50ml）。在超净台上，先用75%的酒精消毒50秒后，无菌水洗3-4次，然后用0.1%的升汞消毒10分钟，无菌水洗3-4次，最后接到事先准备好的MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)培养基上，放在光照培养箱中培养至露出胚芽。2.3.2 无菌苗的获得在超净台上，将培养获得的胚芽接种到预先准备好的MS+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)培养基中，然后放在光照培养箱中培养至长出完整植株（即无菌苗）。2.3.3再生植株的获得将无菌苗的茎段剪切成(0.5-1CM),分别接种到MS+2mg/L ZT+0.4mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)的培养基和MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)培养基上，观察茎段的生长情况。接种在添加ZT和NAA培养基的茎段形成了再生植株，而在添加6-BA和NAA培养基的茎段没有形成再生植株，只形成了愈伤组织。2.4 结果与分析本实验将头花蓼无菌苗茎段接种在添加不同植物激素的培养基中，第一组为MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)；第二组为MS+2mg/L ZT+0.4mg/L NAA+30mg(蔗糖)+9mg(琼脂)。接种在第一组的无菌苗茎段，在光照培养箱中（培养条件：温度25士2，光照时间(光照/黑暗)12h/12h。）经过50天的培养，长出了再生植株（中途没有更换培养基。）。第二组在光照培养箱中（培养条件：温度25士2，光照时间(光照/黑暗)12h/12h。）经过50天的培养，没有长出再生植株。 由此可以看出，头花蓼的组织培养在原有固定步骤上，也可以通过一步培养获得再生植株，不用经过增殖培养和诱导生根、生芽步骤，由此可简化组培步骤。 2.5 结论与讨论 组织培养是植物无性繁殖最常用的方法，它利用植物组织或器官在离体条件再生获得新植株，以此获取和母本一样的理想植株，为种植提供优质、适应力强和快速繁殖的物种。植物生长调节剂在植物组织培养中起着至关重要的作用。组织培养中细胞分裂素和生长素有着协同作用，植物愈伤组织的形成、脱分化、再分化都受到细胞分裂素和生长素浓度比的影响。头花蓼茎段的组织培养，相同的实验材料通过添加不同植物生长调节激素，可以得出：添加2mg/L ZT和0.4mg/L NAA，头花蓼茎段愈伤组织形成，脱分化和再分化都能一次完成，中途不需要更换增殖培养基、诱导生根和生芽培养基，这样可以大大缩短头花蓼培养的时间，简化头花蓼组织培养步骤，为头花蓼的快速繁育提供参考。参考文献：1宁德铭，徐奇元，王大宁，李家英等人. 四川西部几个铜矿区之生物地球化学研究J，四川大学学报，1959年6月2贵阳市科学技术委员会.贵阳重要现代化科技产业实施方案J，世界科学技术，1999年5月303黄东平，庄 凯，李炽明.淋菌性和及淋菌性尿道炎的治疗J,实用医学杂志，1999年5月254张 杰，杨双慧，屈燧林.热淋清对泌尿系结石的疗效J，临床泌尿外科杂志，2000年11月5徐英春，张小江，谢秀丽等人.热淋清颗粒对淋病奈瑟球菌体外抑菌活性的研究J,2001年6月6徐文欣. 热淋清颗粒治疗尿路感染疗效观察J,时珍国医国药，2001年7月7孙长生，韩见宇，魏升华等人. 头花蓼种子发芽生物学特性研究J,现代中药及研究于实验，2005年2月8钟业聪.头花蓼一种理想的野生覆盖植物J.植物杂志，2001年12月9付飞跃，刘艳丽，王海洋.头花蓼在屋顶绿化中的生长及观赏特点研究J，西南师范大学学报，2014年8月10韦美玉，赵 洪.头花蓼一种有潜力的野生花卉J，中国花卉盆景，2005年3月11李勇军，王永林，胡昌奇等人.头花蓼黄酮类化学成分的研究J