CD4CD25CD127调节性T细胞在胃癌不同TNM分期中表达.doc

CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在胃癌不同TNM分期中的表达康文喜 樊 静 河北省秦皇岛市肿瘤医院 邮编：066001 摘要 目的：探讨CD4+CD25+CD127调节性T细胞（Tregs）在胃癌患者不同TNM分期外周血中的表达。方法：采用流式细胞仪检测200例胃癌患者不同TNM分期外周血中CD4+CD25+CD127调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比，并进行比较。结果：胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127调节性T细胞占CD4+T细胞比率明显高于健康对照组，P 0.05；期明显高于期, P0.01；低分化者明显高于高分化者，P0.05；有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者，P0.05；差异具有明显统计学意义。 结论: 胃癌患者外周血中的CD4+CD25+CD127调节性T细胞占CD4+T细胞的比例明显升高，可能在胃癌的免疫耐受中发挥重要作用,检测其结果对于判断胃癌的病程进展及预后有一定参考价值。 关键词 ：胃癌 CD4+CD25+CD127-调节性T细胞 流式细胞术 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率居各类肿瘤之首。胃癌的发生与机体的免疫状态密切相关，在诸多发病机制中Tregs细胞发挥着重要的作用1。CD4+CD25+ 调节性T 细胞（Tregs）由日本学者Sakaguchi等2于1995年首次报道。研究发现，Tregs能抑制免疫反应, 防止自身免疫的发生, 诱导免疫耐受。研究证实Tregs 在生理和病理状态下均有重要的免疫调节作用。Tregs细胞具有低反应性与免疫抑制性两大功能特征。在体内发挥免疫调节、维持自身免疫耐受中发挥着决定性作用。胃癌可诱导Tregs增生，致血液中Tregs数量增多。本研究采用流式细胞仪分析胃癌患者外周血CD4 +CD25+ CD127-调节性T细胞表达，探讨Tregs细胞与胃癌不同TNM分期、肿瘤发生、发展的关系及其临床意义。1.材料和方法1.1 临床资料：本文收集我院2006年3月-2010年12月收治的胃癌患者200例，其中男性140例，女性60例，年龄2869岁，平均年龄（42.328.69岁），所有病例均经病理学诊断为胃癌。临床TNM分期按照国际抗癌协会标准进行：期95例、期68例、期37例；其中高分化腺癌83例，中分化腺癌49例，低分化腺癌68例；有淋巴结转移者139例，无淋巴结转移者61例；对照组均为健康体检者共30例。1.2 主要试剂及仪器：鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE；同型对照IgG1、IgG2、红细胞裂解液、流式细胞仪（EPICS XL）购自美国贝克曼库尔特公司。1.3 实验方法：所有被观察对象均于清晨空腹采集静脉血2ml，经EDTA-2K抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤：取单克隆抗体CD4-FITC、 CD25-PC5、CD127-PE及同型对照各20l，加入100ul EDTA-2K抗凝的外周血，室温下避光孵育15分钟,再加入红细胞裂解液500l，避光孵育10分钟；加入PBS洗2次，离心1500转/5分钟，弃上清后加入适量的PBS，上机检测。1.4 统计学处理 应用SPPS13.0 统计软件分析，进行t检验，数据以 （x-s）表示，P0.05 为差异有统计学意义。2.结果2.1 胃癌患者外周血调节性T细胞比率与健康者的比较 通过流式细胞仪检测法分析, 胃癌患者外周血CD4+CD25+CD127- Treg占总CD4+ T细胞的比率为4.24%1. 16 % ,健康对照组为 0.71%0.32%，胃癌患者外周血Treg比例较健康对照组显著增高( P 0. 05) 。表1. 胃癌患者与健康者CD4+CD25+CD127-/CD4+T比率的比较类 别NCD4+CD25+CD127-/CD4+T（%）P对照组300.710.320.05胃癌患者2004.241.162.2 胃癌患者外周血调节性T细胞比率与临床TNM分期的关系 表2的数据显示，胃癌患者在期、期外周血Treg的比例明显高于期和期，P0.01，提示TNM分期越晚, Treg细胞增多越明显。表2 CD4+CD25+CD127-/CD4+Tregs 在TNM分期的比较分析对象n CD4+CD25+CD127-/CD4+T（%）P临床分期期951.250.860.01期683.431.71期374.281.252.3 胃癌患者外周血调节性T细胞比率与癌组织分化程度和淋巴结转移情况的关系 数据显示，胃癌患者外周血Treg细胞比例在低分化者明显高于高分化者，P0.05；有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者，P0.05。分 析 对 象NCD4+CD25+CD127-/CD4+T（%）P组织分化程度高分化832.680.350.05中分化493.830.37低分化684.210.42淋巴结转移有1394.521.340.05无612.260.31表3.CD4+CD25+CD127-/CD4+Tregs比率在癌组织分化程度和淋巴结转移情况的比较3. 讨论CD4+CD25+ Tregs细胞是近年新发现的一种免疫调节细胞，在维持免疫系统的内环境稳定、免疫应答、免疫耐受的平衡中起重要作用，尤其是在宿主抗肿瘤免疫反应中起抑制性调节作用。人体内Tergs的比例变化在机体发生、生长、发育、进展过程中可诱发一系列的免疫逃逸。研究发现，肿瘤患者Tregs细胞数目明显高于正常人，肿瘤患者常处于免疫功能低下状态，当肿瘤发生时外周血中CD4+CD25+ Tergs细胞可诱导性增高。肿瘤抑制因素对免疫系统的抑制性调控是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一，在诸多的肿瘤免疫耐受和免疫抑制性调节机制中，Tregs的作用倍受关注。据报道肿瘤患者的外周血和肿瘤局部的CD4+CD25+Tergs比例增加，说明Tregs细胞调节的免疫耐受和肿瘤发生密切相关，并直接参与了肿瘤的进展。Tregs高表达CD25分子、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced TNFreceptor）， GITR和细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4），并表达一种独特的细胞核内蛋白-Foxp3。 研究证实, Tregs 在生理和病理状态下均具有重要的免疫调节作用【3】。其机制主要是通过直接接触和分泌抑制性调控因子两个途径对免疫系统，特别是细胞免疫，发挥抑制性免疫调节作用。最近研究表明，CD127分子在Treg细胞表面呈现低表达并且与Foxp 3的表达成负相关，因此用CD4+、CD25+、CD127lo/-可以很好的反映具有抑制作用的Treg亚群。正常情况下，维持免疫平衡、防止自身免疫反应的重要机制中Tregs起到免疫抑制调节作用；在肿瘤病理条件下，Tregs功能上调和诱导增高，能有效、系统地抑制免疫系统的反应性，造成肿瘤免疫耐受加剧，降低免疫系统的免疫监视作用，从而使肿瘤产生免疫逃逸【4】。国外研究表明，肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤等多种肿瘤患者都有外周血和肿瘤局部Tregs比例增高【5,6】，刘海红等12 采用流式细胞术对胃癌患者外周血Treg 进行检测发现胃癌患者外周血Treg 水平增高,且与临床分期有关, III、IV 期患者外周血Treg 水平高于I、II 期患者,而且IV 期患者Treg比例明显升高,提示胃癌患者免疫功能失调与其外周血调节性T 细胞比例增大有关,胃癌患者调节性T细胞介导的免疫耐受和肿瘤的生长密切相关,可能直接参与肿瘤进展的发生过程。本研究结果显示，200例胃癌患者外周血中CD4+ CD25+ CD127- Tregs占CD4+T淋巴细胞的比率为4.241.16，较30例健康对照组0.710.32显著增高， P0.01。在不同TNM分期的胃癌患者中，期患者外周血CD4+ CD25+ CD127lo/-Tregs细胞比率为4.281.25，明显高于-期患者1.250.86、3.431.71。 P0.01。在不同分化程度的胃癌患者中，低分化者CD4+CD25+CD127-Tregs的比率明显高于高分化者，有淋巴结转移者CD4+CD25+CD127-Tregs的比率明显高于无淋巴结转移者。结果显示Tregs调节性T细胞的数值与TNM分期呈正相关，与转移及预后呈负相关，本研究结果与文献报道一致【7】，提示胃癌患者外周血Tregs细胞诱导作用增高。肿瘤发生的早期和肿瘤低负荷状态下，CD4+CD25+CD127-Tregs的比率较进展期肿瘤和肿瘤高负荷状态下显著增高，并影响到全身。肿瘤病人Tregs诱导增高与病情及预后相关联。胃癌患者中Tregs数目越多，预后越差，生存率越低。切除癌瘤后外周血中Tregs数目明显减少，当肿瘤复时发外周血中Tregs数目又明显增高，这些现象说明肿瘤增长及恶性程度与Tregs细胞数目之间存在密切关系。Tregs细胞数目增高导致肿瘤微环境中CCR4+天然Tregs细胞数目增高，从而抑制效应T细胞的产生，导致机体抗肿瘤耐受13。；我们对本研究结果及文献资料进行综合分析发现，肿瘤患者Tregs诱导增高和免疫抑制性调控作用增强是一种普遍现象，不具备肿瘤类型特异性，而Tregs诱导增高的程度可能受多种综合因素影响，但肿瘤负荷大小、病情轻重及分期是其中重要的影响因素。另外，由于Tregs诱导增高和抑制性免疫调控作用增强是肿瘤免疫耐受的重要因素，下调Tregs比例或抑制其功能将必然有助于提高机体抗肿瘤的免疫力，在肿瘤治疗特别是肿瘤免疫学治疗中的价值将受到日益关注。胃癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg增多可能是导致机体免疫低下的原因之一，降低胃癌患者体内CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg或逆转其表型，增强机体免疫监视功能，可成为胃癌治疗的新方法。深入研究Tregs细胞在肿瘤免疫机制中的作用和外周血Tregs细胞的比率变化，对预后判断和指导临床免疫治疗具有十分重要的意义，选择性去除血液中的Tregs细胞，同时联合使用抗肿瘤的免疫治疗，将成为未来肿瘤治疗研究的一个非常可行的方法【8-12】。参考文献：【1】王学野，韩梅，陈琳等 胃癌患者外周血CD4+CD25highCD127 low调节性T细胞的检测及临床意义J. 中国免疫学杂志,2009, 25 (5):459-461.【2】Sakaguchi S， Sakaguchi N， Asano M， et al Immunologic self tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptoralpha-chains （CD25） Breakdown of a single mechanismof selftolerancecauses various autoimmune diseases J J Immunol，1995， 155 （3） ： 11511164【3】王会平，翟志敏，张爱梅，等 CD4+CD25+CD127low 识别人外周血CD4CD25调节性T 细胞的优势J 中国免疫学杂志，2008， 24（12）： 10591062【3】Albanesi C ,Scarponi C ,Sebastiani S et al . IL24 enhances keratinocyte ex2pression of CXCR3 agonistic chemokines J . J Immunol ,2000 ;165 (3) :1395-1402【4】Xiao T,Kagami S ,Saeki H et al .Both IL24 and IL213 inhibit the TNF2al2pha and IFN2gamma enhanced MDC production in a human keratinocytecell line ,HaCaT cellsJ . J Dermatol Sci ,2003 ;31 (2) :111-117【5】Hermann C ,Assmus B ,Urbich C et al . Insulin2mediated stimulation ofprotein kinase Akt :a potent survival signaling cascade for endothelial cellsJ . Arterioscler Thromb Vasc Biol ,2000 ;20 (2) :402-409【6】 Molenaar E T,Vaskuyl A E ,Familian A et al . Complement activation in patients with rheumatoid arthritis mediated in part by C2reactive protein J . Arthritis Rheum ,2001 ;44(5) :997-1002【7】 Liu L, Yao JX, Ding Q, et al. CD4 + CD25 highRegulatory Cellin Peripheral Blood of NSCLC. Acta of HuazhongUni of Sci and Tech2nology Med Sci , 2006, 26 (5) : 548 -550【8】Dannull J., Su Z., Rizzieri D., Yang BK., Coleman D., Yancey D., Zhang A., et al., Enhancement of vaccine-mediated antitumor immunity in cancer patients after depletion of regulatory T cells. J Clin Invest. 2005.115:3623-3633【9】Lutsiak C., Semnani RT., Pascalis RD., Kashmiri SV., Schlom J., Sabzevari H., Inhibition of CD4+25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cy