薄层色谱汇编.ppt

三、常用色谱指纹谱实验技术 薄层色谱(TLC) 高效液相色谱(HPLC) 气相色谱(GC) 毛细管电泳(CE),（一）薄层色谱 1.概 述 快速、简单、灵敏鉴别、含量分析 器械、仪器、计算机化、自动化快速发展 指纹谱特点： 结果直观 离线操作的灵活性,2.薄层色谱操作规程,自动多次展开,全自动定量点样,薄层指纹图谱报告,简单操 作组合,供试品溶液制备,手工半定量点样,玻璃双槽展开箱展开,显色,直观观测(可见光及紫外光)判断样品指纹谱相似度,拍摄色谱图像照片记录,复杂操作组合,供试品溶液制备,计算机控制半自动或全自动定量点样,玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开,显色,直观观测(可见光及紫外光),拍摄色谱图像照片记录,数码成像及数据处理,薄层扫描-积分数据,计算机相似度评价,3.薄层色谱的规范化 (1)器材的规范化 固液萃取小柱；定量微升毛细管；标准展开箱或双槽展开箱；预制薄层板；展开条件控制槽；紫外光灯；显色喷雾器或浸渍显色用玻璃缸；薄层色谱扫描仪。 半自动薄层点样器；计算机控制、参数可与薄层扫描仪共享的全自动薄层点样器；自动展开箱；薄层色谱成像及图像处理系统。,(2)操作规程的规范化 点样展开显色 (3)供试品溶液的预处理 “杂质”对待测的活性成分或指标成分形成干扰。不经预处理，很难得到清晰明确的结果。例 方法：A.加热回流 B.超声提取 C.液液萃取 D.固液萃取样品的提取液通过固相小柱处理。吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。,如雪莲花, 甲醇提取液，不经净化处理，色谱的可见光或荧光图像与经预处理(18小柱洗脱)的图像比较，很显然经过预处理将杂质去除后色谱图像质量明显提高。,(4)展开溶剂的选择 展开剂薄层色谱的关键 展开剂优化依靠经验 展开剂要求分离度高，斑点多。 展开剂最优化模式难以计算： （1）样品中多类别成分共存，优化模式难以外延。 （2）溶剂蒸气在展开中起着举足轻重作用，但又难以获得可测量的参数。,鉴别判断信息多,(5)溶剂蒸气对色谱行为的影响 薄层色谱“开放”环境下展开，展开剂蒸气也参与展开全过程。 展开前蒸气预平衡 调整蒸气浓度 保持展开溶剂新鲜度,改善色谱质量,黄 连 溶剂系统：苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-28氨水(6：3：1.5：1.5：0.25，S1)。 检测：置紫外光灯(365nm)下检视,图 黄连的荧光薄层色谱图 1.巴马汀；2.小檗碱；3.表小檗碱；4.黄连碱；5、6.味连；7、8.雅连；9、10.云连；11、12.商品黄连；13.药根碱；14.非洲防己碱,S1中浓氨液的蒸气相在色谱中起了关键作用： A 仅用S1预平衡15min，氨蒸气量不足，药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均不能分开； B 改用浓氨水5ml在一侧槽中预平衡15min后展开，则药根碱+非洲防己碱、巴马汀、小檗碱均得到分离； C S1中除去浓氨水，仅用浓氨水预平衡，色谱分离度仍很差； D S1中浓氨水改为水，一侧槽中用浓氨水平衡，分离效果同B。,大 黄 游离蒽醌薄层色谱分析, 展开剂为石油醚(3060)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)，用新鲜开瓶的甲酸乙酯时，5种游离蒽醌分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酯时，由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或少分解而导致色谱的分离度大大降低。 或配好的展开剂 反复多次使用， 各溶剂比例改变， 色谱重现性差。,1.芦荟大黄素 2.大黄酸 3.大黄素 4.大黄素甲醚 5.大黄酚,(6)环境因素的影响 相对湿度分离度 （牛胆汁：RH72，四种分不开） 温 度分离度和Rf值 三七药材中的三七皂苷R与人参皂苷Re只有在低温(10)才能分开。,实例人参类药材薄层色谱指纹图谱 1.试验材料及仪器 (1) 对照品 人参皂苷Ro、Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rgl、Rg2、F2、伪人参皂苷F11、三七皂苷-Rl。 (2)薄层板 自制硅胶板；预制硅胶60F254板(20cm20cm)；高效板10cm10cm(Merck)。 (3)仪器 Nanomat-、-点样器及全自动点样器、双槽展开缸、VARIO-KS展开槽、HPTIC VARIO展开槽、薄层色谱条件控制槽、薄层扫描仪(均为瑞士CAMAG产品)、HP9482薄层色谱扫描软件、CATS薄层色谱扫描及评价软件(CAMAG)、薄层色谱摄像仪(Reprostar，CAMAG)。,（4)试药 氯仿(精制、重蒸)、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析纯)。 (5)供试品 吉林生晒参、吉林红参、新开河红参、三七、高丽红参、高丽白参、高丽曲参、美国西洋参、加拿大西洋参、国产引种西洋参。 2.样品预处理 (1)供试液1 样品+甲醇回流提取提取液 浓缩至近干水溶解 正丁醇萃取正丁醇液 减压蒸干五氧化二磷真空干燥器中干燥 总皂苷 加甲醇溶解，使成每1ml含总皂苷8mg(西洋参、三七为4mg)，作为供试液。,(2)供试液2 甲醇回流液适当浓缩碱性氧化铝小柱50甲醇洗脱洗脱液减压蒸干残渣加水溶解水溶液 Sep-Pak C18小柱甲醇洗脱甲醇液蒸干 残渣甲醇溶解，使每1ml含8mg(人参总皂苷)或4mg(西洋参或三七总皂苷)，作为供试液。（除去人参皂苷Ro，特别因用预制板时，人参皂苷Ro与人参皂苷Rbl或Rb2重叠。） 3.点样 用微升毛细管分别吸取人参皂苷混合对照品甲醇液(4mgml)，人参、西洋参、三七供试液各1l，点样于硅胶板上，原点直径2mm或各吸取0.2l点样于高效板上，,原点直径1mm。或Linomat点样设备或全自动点样器(ATS3)条带状喷雾点样于预制板上或高效板上。置五氧化二磷真空干燥器放置过夜，展开前置薄层板于Vario-KS槽中于相对湿度4248条件下预平衡15min。 4.展开 于双槽展开箱的一侧加入展开溶剂氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10；810放置过夜，分取下层；S-1)20ml(20cm20cm)或8ml(10cm10cm)预平衡15min，放入薄层板展开，常规板展开14cm，高效板展开7cm；展开温度1025，(Merck预制板2528)；展开箱内相对湿度控制在4245。,5.显色及扫描 用5硫酸乙醇液喷雾或浸渍(预制板)，100105加热至斑点显色清晰为度。于可见光下观察红色至红紫色斑点(或条带)；紫外光灯(366nm)下观察紫红色荧光(人参二醇型皂苷)或橙色荧光(人参三醇型及奥可梯隆型皂苷)斑点(或条带)。为了加强荧光强度，可于显色后，再喷雾或浸渍液体石蜡-己烷(1：1)混合溶剂。 扫描：荧光方式，ex366nm，滤光片K400。,6.关于方法学 (1)溶剂系统的优选 文献报道最常用的溶剂系统有：氯仿-甲醇-水(65：35：10；下层)(S-2)；正丁醇-乙酸乙酯-水(4：l：5；上层)(S-3)；氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(2：4：2：1；下层)(S-4)；氯仿-正丁醇-甲醇-水(20：40：15：20；下层)(S-5)。5种展开溶剂系统比较试验结果：S-1及展开条件得到的人参皂苷色谱分离度好、斑点容量大(18)、斑点相对位置重现性好(RSD1.3) 。,自左至右：Rbl、Rb2/b3、Rc、Re、NR-1、 Rd、Rg1、Rf、F11、F2、Rg2、混合对照品； 西洋参、人参、人参,Rbl Rb2 Rc Re NR-1 Rd Rg1 Rf F11 F2 Rg2 混 西 人参人参 b3、,Rf,Rg1,Rc,(2)相对湿度(RH)及温度(AT)对人参皂苷色谱行为的影响 取硅胶板纵向等距离分隔成5列，点样后在展开箱内分别以RH32、42、47、58、65、72六种条件预平衡20min，S-1展开，结果分离度随RH降低而提高，RH32时最佳。,RH 32,42 47 58 65 72,展开时温度，用S-1于10及28分别展开，温度高，斑点位置抬高，斑点扩散。溶剂系统配制时放置分层的温度也很重要，25以上放置混合溶剂不分层，展开效果很差。如在低于分层温度下展开，则溶剂系统脱混，色谱扭曲变形。经比较510分层。1025展开为宜。,28不分层,10以下,10 28,10 18 27,(3)显色及扫描方式的选择 文献多用305O硫酸喷雾显色，经改进为510硫酸乙醇液喷雾或浸渍后，立即加热显色，以免斑点在原位扩散。Merck预制板用浸渍法显色。 扫描方式由通常用的可见光扫描改为荧光扫描，灵敏度提高9倍以上。Rbl，Re，Rgl的最低检出量为0.020.04g。,A荧光扫描 B可见光扫描,7.指纹图谱分析,生晒人参,高丽红参,西洋参,人参皂苷指纹图谱分区段图 以B区：5Re、6未知峰、7Rd C区：8、9、10F11、11F2、12Rg2：13三七皂苷R1,Rbl,Ra,Rb2 Rb3,Rc,Rg1,Rf,微量皂苷1418号峰,(1)总体分析 西洋参指纹谱较人参简单，主要皂苷斑点很明显，荧光强，微量皂苷斑点不易察见。人参指纹谱斑点多，微量皂苷易察见，尤以红参为明显。西洋参皂苷扫描图的各峰的总积分面积高于人参皂苷各峰的总面积。三七的指纹图谱以Rbl、Re(重叠三七皂苷R1)、Rgl最突出。 (2)群组分析 薄层色谱扫描图可分辨出18个以上的峰(斑点)，将各个人参皂苷峰分四个区段。宏观比较，以峰高计，西洋参色谱中A、B区占优势，D区较难察见；林生参之C区较园种参明显,D区斑点极弱。人参(生晒参、红参、高丽参)四个区段的峰均可察见，D区峰较西洋参明显，尤以红参明显。吉林生晒人参一般A区B区C区；红参A区B区C区，D区的峰比生晒参更明显。,生晒参 红参 高丽参 西洋参,微观分析，西洋参色谱均呈一高(2-Rbl)一低(4-Rc)的二重峰，B区A区，一高(5-Re)一低(7-Rd)的二重峰(林生参)或三重峰(5、6、7) ；C区特点是有8-Rgl、10-F11 、11-F2，无9-Rf 、12-Rg2；D区峰明显少而弱，比较稳定的是15号及17号弱峰。,西洋参,人参A区均呈四重峰(1-Ra、2-Rbl、3-Rb2+Rb3、4-Rc)；B区均为二重峰(5-Re 、7-Rd),无6号峰；C区有8-Rgl、9-Rf、12-Rg2，无10-F11、11-F2；D区较西洋参峰多而明显(1418号，微量皂苷), 未检出16号峰。 吉林红参D区的4、15号峰较明显，检出16号峰(可能是Rh)。 高丽红参样品中1418号峰较为明显而稳定。,高丽参,(3)个体分析 人参、西洋参所共有：Rbl、Rc、Rd、Re、Rgl。 人参特征：Ra、Rf、Rg2，无F11、F2； 西洋参特征：拟人参皂苷F11、F2，无Ra、Rb2、Rb3、Rf、Rg2； 红参特征：微量皂苷(D区)较生晒参高加工过程中主要人参皂苷部分水解而造成； 三七指纹图谱简单，主要是2号峰(Rbl)、5号+13号峰(Re+三七皂苷R1；未分开),8.结语 (1) 人参、西洋参、三七的共有成分人参皂苷Rbl、Re、Rgl。 人参特征性成分人参皂苷-Rf 西洋参特征性成分拟人参皂苷-F11 三七特征性成分三七皂苷-R1 人参和西洋参： Rb1、Rd、Re 木质部皮部 Rg1 木质部皮部。,2人参不同部位(主根、侧根、须根、芦头)人参皂苷的具体分布和相互比例不尽相同 总人参皂苷： 须根主根 主皂苷Rbl：须根主根 C-20