CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制

密级密级: 博士学位论文博士学位论文 CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制控制左右不对称发育的细胞和分子机制 作者姓名作者姓名： 高倩高倩 指导教师指导教师： 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别： 理学理学 学科专业学科专业： 细胞生物学细胞生物学 研究所：研究所： 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二零一五二零一五 年年 五五 月月 CD146 Controls Left-Right Asymmetry Development By Qian Gao A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell Biology Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences May, 2015 书脊书脊 控控 制制 左左 右右 不不 对对 称称 发发 育育 的的 细细 胞胞 和和 分分 子子 机机 制制 高高 倩倩 中中 国国 科科 学学 院院 大大 学学 3cm 左右 CD146 3cm 左右 致谢 I 致致 谢谢 本论文是在阎锡蕴老师悉心指导下完成的。 五年来， 阎老师充沛的科研热情、 严谨的治学态度和忘我的工作精神使我钦佩，催我上进。 阎老师在实验上给了我 莫大的指导与鼓励，使我的科研能力得到了良好的锻炼与提高，我工作上所取得 的每一个进步无不渗透着她的心血和智慧。 更要感谢阎老师在日常生活中对我的 关心与爱护，她的言传身教让我懂得了很多做人的道理，让我受益匪浅。 感谢孟安明老师及王兆卿老师， 两位老师对我的课题给予了悉心的指导和帮 助；感谢我的搭档张峻峰师兄，是师兄与我一路同行，完成课题；感谢安云鹤师 姐，是师姐的认真指导和帮助让我开始初次实验；感谢实验室的冯静、杨东玲、 宋丽娜、段德民、张德玺、郑继燕、刘铮、王玉春等老师，他们的努力工作为我 提供了良好的科研平台和健康向上的工作氛围；感谢实验室的各位师兄师姐，师 弟和师妹们，他们的帮助和陪伴成就了我的成绩。 感谢秦志海老师、梁伟老师、杭海英老师、蒋太交老师、杨福全老师和松田 善卫老师对我的课题研究提供的无私帮助。感谢研究生处老师们的关心和指导。 感谢我的朋友们，正是他们的关爱与帮助，让我在沮丧的时候感到温暖，帮 我走过了人生的低谷。 最后还要感谢我的父母和亲人，他们教育我踏实做人，勤奋做事。他们无私 的爱是我前行的动力、是我不断进步的源泉，唯有辛勤的学习与工作才能回报他 们对我的养育之恩。 高倩 2015 年 5 月 摘要 II 摘摘 要要 一、一、CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制控制左右不对称发育的细胞和分子机制 生物体内，所有的形态发育进程是由为数不多的信号传导通路所操控的。这 种现象在各类物种的发育进程中都普遍存在，但是，其机制却不完全清楚。脊椎 动物的左右不对称发育（或称为左右不对称模式形成）是指生物体内的某些内脏 器官在自身形态和位置取向上的左右不对称的发育模式。 该模式在脊椎动物中高 度保守，是由发育早期所形成的、暂时性的左右不对称决定器官所控制的。决定 该器官形成的分子，也最终会决定左右不对称的发育进程。斑马鱼的左右不对称 决定器官Kupffers vesicle (KV)是个球形结构，中空，内壁细胞上都长有一根 运动纤毛。 CD146 是一个 I 型跨膜受体糖蛋白， 是钙离子非依赖型的粘附分子， 属于免疫球蛋白超家族的成员，参与了胚胎发育过程中多种组织或器官的发生。 鉴于 FGF 家族在发育以及成年组织稳态维持上，都与 CD146 的功能极其相似； 并且调控左右不对称发育。因此我们推测：CD146 可能是 FGF 家族中某个分子 的受体，也极有可能参与了左右不对称发育。通过系统的配体-受体结合实验， 我们发现CD146是FGF4的独立受体。 通过体外趋化实验证明， CD146而非FGFR 是 FGF4 的趋化响应性受体。在 FGF4 的趋化下，CD146 介导了胞吞作用，这种 含有 CD146 的小泡表现出了向顶端膜 （即 FGF4 高浓度方向） 定向运输的模式。 在 FGF4/CD146 的共同作用下，通过在细胞水平介导小泡转运，细胞建立了正确 的三维空间极性。运用斑马鱼作为模式生物，我们发现，与 FGF4/FGFR 相比， FGF4/CD146 在各发育时期的表达谱极其相似，尤其在斑马鱼的 KV 上，二者表 现出了高度的重合。进一步研究发现：特异性下调 CD146 在 KV 的表达，致使 KV 纤毛变短、中央囊腔形态发育异常、体积减小为原体积的 1/4。在斑马鱼和 爪蟾中特异性地阻断 CD146 的表达，都会引起这两种模式生物左右不对称发育 严重异常。分子生物学水平发现，CD146 组成性激活 JNK 及 Ca2+依赖的转录因 子NFAT。整体水平发现，CD146/JNK 控制了斑马鱼 KV 中纤毛的发生； CD146/NFAT 控制了斑马鱼 KV 的形态形成。 在解析 CD146 如何控制 NFAT 的激 活中发现，CD146 通过组成性地招募 PLC定位于细胞膜上，并通过与内质网上 的 Ca2+通道蛋白 IP3R 的相互作用，参与调控细胞内 Ca2+的释放过程。因此本研 究首次发现：.CD146 是 FGF4 的特异性的非同源受体，传导了 FGF4 信号； .CD146 在三维极性形成中介导了小泡转运；.CD146 以外界信号非依赖的方 摘要 III 式、组成性地激活 JNK；.CD146 通过影响 PLC的膜定位和钙离子从内质网的 释放， 提高了 CD146+细胞内 NFAT 的转录活性水平； . CD146 通过影响左右不 对称决定器官的形成， 控制了脊椎动物左右不对称发育。 同时， 我们的研究揭示： 为数不多的操控形态发育进程的信号， 可能被器官特异性的受体分子解析为器官 特异性的转录反应，从而指导各类器官的发生。 二、二、FXYD6 是是新新型型肝细胞癌的治疗靶标肝细胞癌的治疗靶标 FXYD6 (FXYD domain containing ion transport regulator 6)， 是 FXYD 家族的 第六个成员，是钠/钾-ATP 酶的调节蛋白，定位于细胞膜上。钠/钾-ATP 酶可以 激活 Src- ERK 信号通路，从而促进肿瘤的增殖和迁移。然而，FXYD6 是否在肿 瘤中高表达， 还未见报道。 我们利用自制的高特异性、 高亲和力的 FXYD6 抗体， 应用免疫组化的方法，发现 FXYD6 在肝细胞癌组织中的表达丰度明显高于正常 的对照组织。FXYD6 的表达水平与钠/钾-ATP 的酶活性、Src- ERK 信号通路的 活性水平都呈明显正相关。这样，FXYD6 在肝细胞癌中的高表达不仅促进了钠/ 钾-ATP酶的表达量升高， 而且激活了钠/钾-ATP酶的下游致癌信号Src- ERK 通路， 从而实现了促进肝细胞癌增殖和迁移的作用。 更为重要的是， 应用 FXYD6 抗体治疗荷肝癌的模型小鼠，可以明显减缓小鼠的肝癌进程，证明 FXYD6 是肝 细胞癌的新型治疗靶标，靶向 FXYD6 是肝细胞癌治疗的一条重要策略。 关键字关键字：左右不对称，FGF，CD146，FXYD6，肝细胞癌 ABSTRUCT IV Abstract 1. CD146 Controls Left-Right Asymmetry Development Diverse morphogenetic processes are coordinated by a handful of signaling pathways, but the underlying mechanisms remain elusive. In vertebrates, internal organs are positioned asymmetrically across the leftright (LR) axis, placing them in a defined area within the body. This LR asymmetric placement is a conserved feature of the vertebrate body plan and is determined by transient LR asymmetric organizer. Molecules determining morphogenesis of the LR asymmetric organizer are able to ultimately influence embryonic LR development. In zebrafish, the LR asymmetric organizer is Kupffers vesicle (KV), a fluid- filled organ with a central lumen and monocilia at the apical membrane of the cells facing the lumen. CD146 (cluster of differentiation 146) is a cell adhesion molecule (CAM), belongs to the immunoglobulin superfamily, and participate in diverse organs/tissues morphogenesis. The functional parallels between CD146 and FGF signaling in diverse processes hints an unknown interplay between the two pathways exists. Inspired by the involvement of FGF signaling in vertebrate LR organizer morphogenesis and in LR patterning, we proposed a hypothesis that similar with FGF signaling, CD146 may act as a receptor of yet unknown FGF ligands, also exert functions in LR organizer morphogenesis and in LR patterning. Through systematic ligand- receptor binding assay, we found that CD146 is the independent receptor of FGF4. Using in vitro chemotaxis assay, we found that CD146, but not FGFR, is the responsive receptor of FGF4. Upon FGF4 chemo- attracting, CD146 mediates endocytosis and CD146+ vesicular traffic towards apical surface leads to establishment apical- basal three dimensional (3D) polarity. To study the roles of CD146 signaling in morphogenesis, we firstly chose the zebrafish model because of its high reproductivity and transparent embryos. The spatiotemporal distribution of fgf4 mRNA in DFCs and in KV was similar with that of cd146, but differed from that of fgfr1. When whole- embryo cd146 knockdowns were conducted, we found that KV lumen was decreased by 75% in cd146 morphants. The length of KV cilia was decreased by 35% in cd146 morphants relative to control embryos (3.82 vs. 5.85 m; P 0.001). The knockdown- mediated CD146 depletion in LR organizer of zebrafish and Xenopus results in global LR asymmetry failure, suggesting the conserved role of CD146 in determination of LR asymmetry across vertebrates. ABSTRACT V CD146- controlled JNK activation feeds into FGF pathway to activate FGFR substrate 2 (FRS2)- initiated cascades and promote ciliogenesis of LR organizer. The essential roles of CD146 in constitutive recruitment of phospholipase C- (PLC- ) to cell membranes and forming complex with inositol- 1,4,5- trisphosphate receptor (IP3R), provide double guarantees for prime activation of NFAT. CD146- controlled NFAT ultimately determines luminal biogenesis of LR organizer. Thus, our findings firstly provide following evidence: . CD146 is an unexpected physiological receptor of FGF4 and transmits FGF4 signals, .CD146 mediates vesicular traffic during 3D polarity, .CD146 constitutively activates JNK independent of outside signals, .CD146 influences the transcriptional activity through anchoring PLConto cell membrane and interacting with IP3R ； . CD146 controls LR asymmetry development through determining morphogenesis of LR organizers across vertebrates. In light of this study, mechanistic understanding the morphogenetic diversity of signaling output should primarily consider cell- lineage specific receptors as the preferred decoders for universal signals. 2. FXYD6: a Novel Therapeutic Target toward Hepatocellular Carcinoma FXYD6 (FXYD domain containing ion transport regulator 6) is the sixth defined member of the FXYD family. FXYDs are regulators of Na+/K+- ATPase, which is located on the cellular membrane. It is noteworthy that, besides its major role as the Na+/K+ pumps, Na+/K+- ATPase is involved in tumor proliferation and migration through activating its downstream Src- ERK signaling components. However, whether or not FXYD6 is up- regulated and involved in tumor progression, particularly in HCC, remains elusive. Here, we demonstrate that FXYD6 is up- regulated in hepatocellular carcinoma (HCC) and enhances the migration and proliferation of HCC cells. Up- regulation of FXYD6 not only positively correlates with the increase of Na+/K+- ATPase but also coordinates with the activation of its downstream Src- ERK signaling pathway. More importantly, blocking FXYD6 by its functional antibody significantly inhibits the growth potential of the xenografted HCC tumors in mice, indicating that FXYD6 represents a potential therapeutic target toward HCC. Altogether, our results establish a critical role of FXYD6 in HCC progression and suggest that the therapy targeting FXYD6 can benefit the clinical treatment toward HCC patients. Key words: leftright asymmetry, FGF, CD146, FXYD6, hepatocellular carcinoma 目录 VI 目目 录录 致 谢 I 摘 要. II Abstract IV 文献综述 1 一 脊椎动物左右不对称发育研究进展 1 1 左右不对称发育概述 1 1.1 斑马鱼左右不对称发育机制 1 1.2 爪蟾左右不对称发育 8 1.3 问题与展望 10 2 CD146 蛋白的结构与功能 10 2.1 CD146 蛋白结构 10 2.2 CD146 介导的信号通路 11 2.3 CD146 在发育过程中作用 12 2.4 问题与展望 14 3 FGF 信号转导机制及其生物学功能 15 3.1 FGF 的组成与结构 15 3.2 FGFR 的组成与结构 15 3.3 硫酸乙酰肝素多糖的结构与功能 16 3.4 FGF 信号转导机制 17 3.5 FGF 信号的生物学功能 20 3.6 问题与展望. 23 二 FXYD 在肿瘤中的表达及生物学功能 25 1 FXYD 家族的结构与功能 . 25 2 FXYD6 的分布与功能 . 27 3 Na+/K+- ATP 酶与肿瘤 . 27 研究内容 31 第一部分 CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制 . 31 1 材料与方法 31 1.1 实验材料. 31 1.2 实验方法 33 2 实验结果 42 目录 VII 2.1 CD146 是 FGF4 的独立受体 . 42 2.2 CD146 控制的 JNK 活化参与 FGF 信号通路 . 45 2.3 CD146 控制的 NFAT 活化参与 FGF 信号通路 . 47 2.4 CD146 调控斑马鱼和爪蟾左右不对称发育 52 2.5 CD146 控制的 JNK 信号是决定纤毛长度的充分条件 . 57 2.6 CD146 控制 KV 器官的囊腔形成 59 2.7 CD146 控制 NFAT 信号决定 KV 囊腔形成 61 2.8 CD146 响应 FGF4 浓度梯度的极性运动决定囊腔形成 . 63 3. 小结与讨论. 66 第二部分 FXYD6 是新型肝细胞癌的治疗靶标 68 1.1 实验材料. 68 1.2 实验方法 70 2.实验结果. 74 2.1 鉴定单克隆抗体 FD10 的高特异性和亲和力 74 2.2 FXYD6 在多种人类肿瘤上表达上调 . 75 2.3 FXYD6 能够促进肝癌细胞迁移和增殖 . 76 2.4 在 HCC 细胞中 FXYD6 与 Na+/K+- ATP 酶存在相互作用 78 2.5 FXYD6 可以活化 Na+/K+- ATP 酶下游信号通路 79 2.6 FXYD6 抗体可以抑制肝移植瘤生长 . 81 3 小结与讨论 82 作者简介及在学期间发表的学术论文 84 参考文献 85 文献综述 1 文献综述文献综述 一一 脊椎动物左右不对称脊椎动物左右不对称发育发育研究进展研究进展 1 左右不对称发育左右不对称发育概述概述 脊椎动物的躯体外观上呈现出近乎完美的双侧对称结构。然而，其内部器官 的结构及位置却呈左右不对称分布。例如：左侧含有大部分的胃、胰腺、脾脏和 心脏组织，右侧含有大部分的胆囊和肝脏的组织；左侧的肺分叶少于右侧；肠道 以逆时针的方向进行卷曲。 这种左右不对称模式在各个物种中都普遍存在，该模 式的正常形成是器官正常发育、行使功能的保证1。例如：左右不对称的心脏才 能够实现快速供血2。在脊椎动物胚胎发育过程中，这种左右不对称模式的形成 过程被称作左右不对称发育3。 图 1.1 脊椎动物左右不对称发育过程1。 （a）在胚胎发育的早期，前后 AP 体轴 及背腹体轴已经建立。 （b）左右不对称 信号起始。 （c）左右不对称信号传向左 右不对称控制器官 Node。 （d）Node 左 侧表达分泌性的信号分子建立局部左右 不对称。 （e）通过 Nodal 信号分子沿左 侧板中胚层特异性表达。 （f）左侧及右 侧特异性基因表达，建立左右不对称信 号。 （g 和 h）器官原基接受不对称信号 发育成特定左右不对称形态。 左右不对称发育是生命科学领域的重要问题。 在过去的十几年里， 通过对鸡、 爪蟾、 小鼠及斑马鱼胚胎的研究， 左右不对称发育研究领域已经取得了许多突破， CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制 2 将其形成过程概括为三个阶段（如图 1.1 所示）。基本的左右不对称发育过程包括 早期左右对称模式的打破以及不对称信号的起始； 中期左右不对称信号的传递与 放大；末期器官原基在左右不对称信号的指导下进行特定的形态发育1。 在左右不对称发育过程中，众多分子及细胞机制参与其中。下面以斑马鱼和 爪蟾的左右不对称发育为例介绍脊椎动物左右不对称发育的调控机制。 1.1 斑马鱼斑马鱼左右不对称发育左右不对称发育机制机制 斑马鱼（Danio rerio，常用名 zebrafish）是原产于南亚的鲤科短担尼鱼属的 硬骨鱼。斑马鱼作为经典的研究发育的动物模型，具有以下优势： 1) 体形小巧，成体 35 cm 长，水质要求低，便于大量养殖； 2) 生长速度快，受精卵发育至性成熟仅 3 个月，便于培育突变体； 3) 产卵量大而产卵周期短，且可通过人为改变光周期控制产卵时间； 4) 体外受精，胚胎透明且体外发育，利于观察和研究发育过程； 5) 相关实验技术如特异性反义吗啉环寡聚核苷酸（Morpholino，MO）抑 制基因表达，细胞标记，组织移植技术，基因诱变及突变体构建等已经 成熟，且已建立大量斑马鱼突变体品系4； 6) 与人类基因相似度高， 大约有 70%的人类基因有至少一个斑马鱼直系同 源基因5。 斑马鱼已经成为最重要的- 发育生物学模式动物之一，以其为对象的研究加 深了对于脊椎动物左右不对称发育的了解。 1.1.1 早期早期左右左右不对称信号起始不对称信号起始 在斑马鱼胚胎中，左右不对称信号最早出现于胚胎发育的卵裂时期，而 H+/K+- ATPase 对于胚胎左右对称模式的打破及左右不对称信号的起始有着重要 作用。利用 H+/K+- ATPase 抑制剂处理位于卵裂时期的胚胎，能够破坏斑马鱼的 左右不对称模式6。研究发现，亚型 H+/K+- ATPase 虽然在斑马鱼胚胎中表达量 最高，但其 mRNA 及蛋白的分布却是左右对称。由此推测，H+/K+- ATPase 可能 是通过亚型的翻译后修饰水平的左右不对称性，或者其它亚型 H+/K+- ATPase 的分布偏向性，来起始左右不对称信号。 1.1.2 中期左右不对称器官传递与放大中期左右不对称器官传递与放大左右左右不对称信号不对称信号 Kupffers vesicle（KV）是硬骨鱼类中左右不对称发育的保守的决定性 器官，由 Kupffer 博士在 1868 年发现并命名。KV 仅在发育早期暂时性地存在于 脊索的后部，为封闭性球状囊腔器官，内部充满液体7，内腔衬有一层长有单纤 毛的细胞8。斑马鱼 KV 的发育过程，早在 1996 年就被阐明。其前体细胞（背 文献综述 3 部前驱细胞， dorsal forerunner cells， DFCs） 出现在 50%外包期9； 在 1S 体节期， 汇聚组成 KV 器官； 在 10S 体节期 KV 器官囊腔体积达到最大10。 其内腔壁上纤 毛的逆时针运动，能够产生逆时针的左侧液流。移除 KV 的前体细胞（即 DFC 细胞） 、或者切除 KV 器官，都可以导致斑马鱼胚胎左右不对称发育异常7。 左右不对称控制器官在脊椎动物中广泛存在，小鼠的同源器官称为 ventral node、 鸡的同源器官称为Hensens node、 爪蟾的同源器官称为GRP （gastrocoel roof plate） 17。虽然参与左右不对称发育的分子以及细胞生物学机制众多，不同学术 观点之间存在较大分歧，但是，左右不对称器官在脊椎动物左右不对称发育中的 保守性是广为认可的。因此，研究左右不对称发育器官的发育过程，能够加深对 于脊椎动物左右不对称发育机制的了解。 与其它脊椎动物左右不对称器官相比， 斑马鱼 KV 发育过程更便于进行左右 不对称发育的研究。在斑马鱼发育至 32 细胞时期（受精后 2 小时左右）之前， 所有的胚胎细胞都可以通过其与卵黄细胞间存在的胞质连接， 从卵黄中吸收外源 注射的物质18。2 小时后，胚胎中大部分的胞质连接关闭，仅 KV 器官的前体细 胞 DFC 和卵黄的连接还存在。受精 4 小时后，DFC 和卵黄间的胞质连接也完全 关闭。所以在受精后 2 小时和 4 小时之间，DFC 细胞仍然可以从卵黄中吸收外 源注射的物质10，而其它的胚胎细胞却不能。根据此特点，2004 年，Yost 等人 报道了一种中囊胚注射方法， 能够特异性抑制 DFC 细胞中基因的表达10。 这样， 在斑马鱼胚胎发育到中囊胚期（受精后 3 到 4 小时） ，如在卵黄中注射靶向特定 基因反义核酸Morpholino（MO） ，那么，MO 就只能被 DFC 细胞吸收，而 不影响胚胎其它细胞。这样，使仅在 DFC 细胞及其 KV 器官内特异性地阻断某 些目标基因的表达（而不影响其它细胞中该基因的表达）成为可能。反之亦然， 中囊胚注射 mRNA， 能够特异性只在 KV 器官中过量表达目标蛋白19, 20。 因此， 中囊胚注射法被广泛应用于左右不对称研究中。 因为该方法巧妙地避免了由于全 身性的缺陷引发的左右不对称发育异常问题，特异性地展现了：目标基因如何通 过影响 KV 器官的发育而参与调控左右不对称发育进程。 斑马鱼 KV 器官同时也是后生动物多细胞器官发育研究的理想的体内模型。 多细胞器官的常见形态为管腔样或者囊腔样。管腔类器官，如血管、气管、消化 道，有着重要的生理功能，如运输液体或者气体、以及消化吸收。千差万别的管 腔类器官，包括 KV 器官，实则有着保守的分子以及细胞发育机制 21。纤毛也 并非左右不对称控制器官所独有，它广泛存在于各类细胞以及其它器官上，是脊 椎动物中遍在化的细胞器22。运动纤毛可以通过运动产生液流、感觉纤毛可以 通过偏转感受外部信号，维持器官的正常生理活动23。纤毛形成过程的异常能 够导致严重并发症，如多囊性肾病，脑积水及视网膜退化22。因此，由纤毛细 CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制 4 胞组成的 KV 器官，其囊腔形成、以及纤毛发生，代表了脊椎动物器官发育过程 中的两个重要部分。研究 KV 器官的发育进程，可以同时了解发育过程中细胞重 排、纤毛发生的机制，对其它多细胞器官的发育机制的研究具有普遍的意义。加 之，中囊胚注射法使研究特定基因在 KV 器官发育中的功能成为可能，斑马鱼的 KV 器官被公认为是一个可以量化的、便于操作的、体内的器官发育模型。 1.1.2.1 KV 器官的囊腔形成过程 图 1.2 DFC 细胞的分化及会聚运动24。 （A- B）植物极在下方，斑马鱼背侧图（A 和 B）及 虚线位置的纵截面（A和 B）免疫荧光显示 DFC 细胞（星号标记）分化及其与 EVL 的连 接（PKC- 富集区域，箭头标记） 。 （C- D）斑马鱼胚胎背侧图（C 和 D）及虚线位置纵截面 （C和 D）免疫荧光显示 DFC 细胞（绿色荧光标记）的会聚运动及 DFC 细胞群内顶端核 （箭头标记）的出现。在 80%外包期时，细胞会聚已会聚成椭圆形结构，并出现若干顶端 核（C 和 C） 。而在 bud 时期，细胞会聚运动进一步形成莲花座结构，并脱离包被层 EVL， 细胞群中心出现一个较大的顶端核（D 和 D） 。 斑马鱼胚胎中 KV 器官囊腔形成主要包括 DFC 细胞分化、细胞汇聚运动、 定向运动、以及囊腔扩张四个过程。胚胎发育至 50%外包期时，背部表面上皮 （dorsal surface epithelial，DSE）细胞受 Nodal 信号诱导开始分化，成为 KV 器 官前体细胞 DFC（如图 1.2A）24。随着胚层细胞外包运动的进行，DFC 细胞群 逐渐同背部边缘细胞（dorsal marginal deep cell）分离，但始终与背部包被层 （enveloping layer，EVL）保持接触，随着包被层向植物极进行定向迁移26。在 迁移过程中 DFC 细胞的数目也在逐渐增加，当胚胎发育至 80%外包期时已增至 50 个左右24。而在定向迁移的同时，DFC 细胞也在向背部方向发生聚合运动， 形成一个紧实的椭圆形结构（如图 1.2C） 。在此运动阶段中，DFC 细胞群与包被 层的物理连接作用逐渐加强，因此被 EVL 带动着向植物极进行定向运动24；而 文献综述 5 其会聚运动则是由受 FGF 信号调控的细胞间连接作用而驱动19。在外包期的后 期，已经到达胚胎植物极的 DFC 细胞群接受非经典 Wnt 信号的刺激能够进一步 会聚成酒瓶底的结构（如图 1.2D）27。外包期结束时 DFC 细胞逐渐同 EVL 细 胞脱离，并进一步的进行会聚压缩运动，围绕着 ZO- 1 蛋白（细胞间紧密连接成 分）高表达的顶端核形成三维的莲花座结构。接下来，细胞团内部出现囊腔（如 图 1.3A 及 D） 。最初，多个小囊腔出现在 ZO- 1 富集的顶端核处，随后小囊腔快 速会聚成中央囊腔（如图 1.3B 及 E） 。在体节期时，中央囊腔扩张，体积迅速增 长（如图 1.3J- L） 。10 体节期时，KV 囊腔扩张完成，囊腔的体积达到最大。而 在 KV 囊腔扩张的过程中能够观察到，细胞内囊泡向内表面方向的快速运动，暗 示了小泡顶端定向运动对于囊腔扩张的重要作用。 这一细胞机制也广泛存在在哺 乳动物细胞体外培养形成囊腔的过程中28，表明了囊腔形成机制的保守性，也 验证了斑马鱼 KV 器官用作体内模型研究囊腔形成机制的可行性。 图 1.3 KV 器官的囊腔扩张24。 （A- C）多光子定时拍摄记录 KV 器官囊腔形成过程中细胞的运动。 在 bud 时期，DFC 细胞群围绕两个 顶端核（箭头标记）形成莲花座紧 密结构（A） 。随后，顶端核会聚成 一个（B）并在此形成一个中央大 囊腔（C） 。 （D- I）免疫荧光图片显 现 KV 细胞（绿色）形成囊腔过程 及其中顶端极性 （zo- 1 标记， 红色） 变化。bud 时期，DFC 细胞团中存 在若干顶端核 （箭头标记）（D 和 G） 。 1 体节期时，在顶端核区域出现若 干小囊腔（箭头标记） （E 和 H） 。2 体节期时，在中央形成大囊腔（F 和 I） 。 （J- L）体节期时，囊腔体积 迅速扩大，并伴随着纤毛形成 （ac- tubulin 标记，红色） 。 总结上述研究发现，KV 器官囊腔发育过程受 Nodal 信号，FGF 信号及非经 典 Wnt 信号的精细调控。 众多基因被发现能够调控 KV 器官囊腔发育的过程 （如 表 1.1 所示） 。虽然这些基因缺失或功能失活后，所致 KV 器官发育异常的表型 各有不同，但都可致使斑马鱼左右不对称发育异常，进一步说明 KV 器官在左右 CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制 6 不对称发育过程中不可取代的地位。 表 1.1 调控 DFC/KV 器官形成的基因 基因名称 蛋白功能 功能缺失后性状 参考 文献 DFC 分化 会聚 运动 定向 运动 囊腔 扩张 KV 具体形态 oep Nodal 受体的 共受体 无 DFC 细胞 - - - 缺失 7 cas/sox32 Nodal 信号激 活的转录因子 无 DFC 细胞 - - - 缺失 7 Ttrap 竞争性结合 Nodal 受体 存在 DFC 细胞 未知 未知 未知 缺失或者变小 20 rock2b 介导非经典 wnt 信号 细胞形态 异常 正常 正常 正常 体积正常 29 prickle1a 介导非经典 wnt 信号 正常 减弱 正常 未知 多个小囊腔，或者细 胞组成数目减小的小 KV 30 no tail FGF 信号激活 的转录因子 正常 正常 正常 减弱 体积减小的异形囊腔 18 sdc2 介导FGF信号 正常 减弱 正常 未知 细胞组成数目减小的 小 KV 31 tbx16 FGF 信号激活 的转录因子 正常 减弱 正常 未知 体积减小的异形囊腔 或者多个小囊腔 31 canopy1 正调控FGF信 号 正常 减弱 正常 未知 未知 19 ire1 介导FGF信号 正常 减弱 未知 未知 未知 31 fibp1 介导FGF信号 正常 减弱 未知 未知 未知 31 atx 介导 Ca2+离子 信号 正常 减弱 正常 未知 异形 KV 或者周围围 绕着散在DFC 细胞的 小 KV 32 lpar3 介导 Ca2+离子 信号 正常 减弱 正常 未知 异形 KV 或者周围围 绕着散在DFC 细胞的 小 KV 32 ace/fgf8 FGF 配体 未知 减弱 未知 未知 缺失 33, 34 cadherin1 粘附分子 正常 减弱 正常 未知 未知 20, 34 connexin43.4 间隙链接组分 未知 未知 正常 减弱 缺失 35 miR-92 靶向 Gata5 未知 未知 未知 未知 组成 KV 的细胞数目 减少 36 integrin 5 粘附分子 正常 减弱 正常 未知 体积减小的异形 KV 37 integrin1b 粘附分子 数目正 常，但形 态异常 减弱 正常 未知 体积减小的异形 KV 37 nde1 中心粒蛋白 未知 未知 未知 未知 细胞组成数目减少的 小 KV 38 文献综述 7 表 1.1（续） 调控 DFC/KV 器官形成的基因 基因名称 蛋白功能 功能缺失后性状 参考 文献 DFC 分化 会聚 运动 定向 运动 囊腔 扩张 KV 具体形态 cftr 控制液体分泌 正常 正常 正常 减弱 KV 囊腔体积减小 39 lgl2 调控细胞粘附 能力 正常 正常 正常 减弱 KV 囊腔体积减小 40 wdr18 调控 integrin 信号 正常 减弱 减弱 未知 异形 KV 41 ctnnb1 介导 wnt 信号 正常 未知 未知 未知 细胞组成数目减少的 小 KV 42 ctnnb2 介导 wnt 信号 正常 未知 未知 未知 细胞组成数目减少的 小 KV 42 1.1.2.2 KV 器官的纤毛形成过程 KV 器官中的纤毛形成于在体节期时 KV 囊腔开始扩张时，同样经过有序的 阶段。首先，在细胞中心粒处，基体（basal body）结构开始形成，并逐渐迁移 至 KV 器官内表面细胞的顶端膜（面向囊腔）处锚定，进而同细胞膜融合；以基 体为反应中心装配微管，伸出细胞膜，形成纤毛22。 近年来， 对于调控纤毛形成的分子机制研究有所突破。 Forkhead 家族转录因 子 foxj1a 被发现是纤毛形成的主调控者44。研究发现 foxj1a 能够直接激活纤毛 形成所必须的基因表达， 如 lrdr1 或者 centrin2， 敲低 foxj1a 的表达或者影响 foxj1a 表达的基因操作都将导致纤毛生成异常45。纤毛形成的所有相关蛋白都在胞浆 中合成，所以纤毛的延伸需要鞭毛内运输蛋白（intrafl agellar transport，IFT）介 导的定向运输43。敲低 IFT 蛋白将导致纤毛形成异常，纤毛变短16。此外，还 有众多信号通路被发现能够调控纤毛形成过程， 从而控制斑马鱼左右不对称发育， 例如 aei/deltaD 介导的 notch 信号46，vangl2 介导的非经典 Wnt 信号47，fgfr1 介导的 FGF 信号48。同时这些研究发现也证实，纤毛的正常形成是斑马鱼左右 不对称发育所必需。 1.1.3 不对称信号由不对称信号由 KV 器官器官传向侧板中胚层传向侧板中胚层 斑马鱼左右不对称信号的传递依赖于Nodal信号49。 最初在4到6体节期时， spaw（斑马鱼中 nodal 同源基因）在 KV 器官的双侧对称表达50。随着 KV 器官 的发育成熟，KV 内的纤毛运动产生逆时针液流，刺激 KV 左侧细胞的 Ca2+离子 释放，引起 CaMK- II 磷酸化，激活内质网中 Ca2+释放，进一步升高左侧细胞中 Ca2+离子浓度51。高浓度的 Ca2+离子能够上调左侧 Spaw 蛋白表达。此过程中， Spaw 的拮抗剂 Charon 也参与建立 KV 器官中 spaw 左侧不对称表达模式52。在 CD146 控制左右不对称发育的细胞和分子机制 8 8 体节到 10 体节期间，KV 内左侧液流能够将 Charon 从双侧对称表达转变为右 侧不对称表达46。 右侧高表达的 Charon 分子能够结合 Spaw 分子， 抑制其活性。 因此， spaw 就实现了左侧的不对称分布。 而在左侧活跃的 Spaw 又能够通过正反 馈诱导表达机制进一步刺激周围细胞中 spaw 的表达，将 Spaw 信号沿着左侧侧 板中胚层（lateral plate mesoderm，LPM）向前端传递49。 左侧 LPM 表达的 Spaw 可以引起下游基因的特异性表达， 包括 Spaw 的拮抗 因子 Lefty1 和 Lefty250。而这两个拮抗因子能够抑制 Spaw 引发的信号，使得其 在程度及空间上得以适当分布。 其中10s到18s体节期时lefty1表达在中线位置， 能够阻止左侧的 Spaw 在右侧扩散表达，进一步建立起了严格的蛋白水平的左右 不对称表达模式53, 54。 1.1.4 后期后期左右不对称信号从左右不对称信号从 LPM 传向器官原基传向器官原基 胚胎中器官原基能够响应Nodal信号在左侧LPM激活后产生的不对称信号， 在体内进行不对称发育。研究发现，心脏作为典型的不对称器官，其器官原基在 胚胎发育 18s- 20s 体节期时，在 LPM 的前段是对称分布。随后，心脏器官原基 受 Nodal 信号下游基因 lefty1， lefty2 和 pitx2 调控， 逐渐发育成左右不对称模式。 研究还发现肺及内脏的左右不对称发育也同样依赖于 pitx255, 56。 1.2 爪蟾爪蟾左右左右不对称发育不对称发育 爪蟾的左右不对称发育同斑马鱼的大体类似， 但有其种属特异性的发育过程， 因此具有其特殊的研究意义。 虽然不对称器官中纤毛运动产生左侧液流决定左右 不对称的机制同样适用于爪蟾胚胎57。但研究还发现，在爪蟾胚胎中，左右不 对称蛋白分布模式在受精后不久大概卵裂时期就已经产生。在纤毛产生之前， 由 血清素 （serotonin） 在右腹侧的活跃信号就可诱导 xnr-1 （爪蟾中 nodal 同源基因） 在胚胎左侧的不对称表达。 但尚不能确定此早期左右不对称建立机制能否独立于 液流决定机制控制爪蟾左右不对称发育58。 爪蟾左右不对称控制器官 GRP 也并非封闭球形囊腔状，而是一狭长的面向 原肠腔的三角形