细胞粘附分子CD146在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能

分类号分类号 Q93 密级密级 UDC 579 编号编号 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 博士学位论文博士学位论文 细胞粘附分子细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的在早期妊娠和先兆子痫中的 表达和功能表达和功能 刘琴刘琴 指导教师指导教师 阎锡蕴阎锡蕴 博士导师研究员博士导师研究员 中科院生物物理研究所中科院生物物理研究所 申请学位级别申请学位级别 博士学位博士学位 学科专业名称学科专业名称 微生物微生物 论文提交日期论文提交日期 2004 年年 4 月月 5 日日论文答辩日期论文答辩日期 2004 年年 4 月月 12 日日 培养单位培养单位 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所 学位授予单位学位授予单位 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 答辩委员会主席答辩委员会主席 刘以训刘以训 研究员研究员 摘 要 1 摘摘 要要 自然流产和不孕症是严重危害人类生育的常见疾病。 尽管其发病机理至今 仍不太清楚，但研究表明滋养层细胞侵入，自身免疫反应和粘附分子的表达异 常可能是其发病的关键因素。本文以细胞粘附分子 CD146 为重点研究对象， 以 CD146 特异性抗体为主要研究工具，探讨了从小鼠到人， CD146 分子在早 期妊娠和相关妊娠疾病中的作用。我们发现 CD146 分子选择性地表达在妊娠期 的小鼠子宫内膜，而不表达于非妊娠期子宫内膜。而且 CD146 分子在妊娠不同 阶段呈现出动态表达，特别是在第 4 天植入窗口期的植入位点和侵入性的次级 滋养层细胞上，提示了 CD146 在胚胎植入和胎盘形成中的重要作用。 在细胞 水平，CD146 单克隆抗体 AA98 能阻断胚泡在子宫上皮细胞上的植入，抑制次 级滋养层细胞的迁移和金属蛋白酶 9 和 2 的分泌。 动物实验表明，对妊娠第 3 天的小鼠子宫角注射抗体 AA98 显著减少胚胎植入数目，而注射同型正常小鼠 IgG 的对照侧子宫角胚胎植入未受影响。进一步的机理研究表明，这和子宫内 发生过量的细胞凋亡密切相关。凋亡主要发生在脱落的子宫上皮细胞和蜕膜 中。相关的蜕膜血管生成也显著减少。这部分研究揭示了 CD146 是接受状态子 宫内膜的标志分子，在胚胎植入，蜕膜反应和滋养层细胞侵入中发挥了重要作 用，为计划生育研究和不孕症、自然流产的治疗提供了新的策略。 CD146 在小鼠妊娠中的功能促使我们进一步研究 CD146 是否也在人的妊娠 中起重要作用，在妊娠疾病先兆子痫中 CD146 是否像其它内皮细胞粘附分子一 样在中间滋养层细胞上的表达降低。我们以抗体 AA98 为手段用免疫组化分析 了从正常孕妇和先兆子痫病人获取的 42 例胎盘。结果显示在正常胎盘中， CD146 主要表达于最有侵入性和迁移性的中间滋养层细胞，而不表达于非侵入 性的细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞。然而在先兆子痫中，虽然 CD146 仍在 血管上表达，但是不再表达于中间滋养层细胞。同时，我们检测了另一个血管 内皮粘附分子 CD31，发现它在正常胎盘和先兆子痫胎盘中所有的滋养层细胞 上都不表达。本研究比较了 CD146 在正常胎盘和先兆子痫胎盘中的不同表达， 首次发现了 CD146 在先兆子痫的中间滋养层细胞上表达异常的现象，提示 CD146 在滋养层细胞的侵入中起重要作用。 关键词关键词：细胞粘附分子 CD146，胚胎植入，细胞凋亡，滋养层细胞侵入， 先兆子痫 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 2 Abstract Qin Liu (Microbiology) Directed by Professor Xiyun Yan Recurrent miscarriage and infertility seriously impair human fecundity. However, the underlying molecular mechanisms remain elusive. Here, we investigate the effect of an adhesion molecule CD146 in early pregnancy using an anti-CD146 monoclonal antibody (mAb) AA98. We observed a specific and dynamic pattern of CD146 expression during the stages of pregnancy, especially at the implantation site and in invasive secondary giant trophoblasts, implying an important role of CD146 in the key events of implantation and placentation. Our in vitro studies showed that the mAb AA98 blocked the implantation of blastocysts to the uterine epithelial monolayer, and inhibited the outgrowth of secondary giant trophoblasts and their secretion of MMP2 and MMP9. Animal experiments revealed that mAb AA98 applied in mice on Day 3 of pregnancy functionally reduced the number of implanted embryo. This correlates with excessive apoptotic cells in the mAb AA98 treated uteri, mainly in excessively desquamated epithelial cells and decidua, in which angiogenesis was remarkably reduced. Our data provide new insights into the function of CD146 in embryo implantation, decidualization and trophoblast invasion. Manipulation of CD146 may provide novel strategies for contraception and for therapy of infertility and recurrent spontaneous abortion. The function of CD146 in mouse pregnancy prompts us to further investigate whether CD146 also plays an important role in human pregnancy, and whether the expression of CD146, like most other endothelial adhesion molecules, is reduced in the pregnancy disorder pre-eclampsia. We used immunohistochemical approaches and analyzed forty-two placentas from control and preeclamptic patients using an anti- CD146 monoclonal antibody. Our data shows that in normal placentas, CD146 staining was specifically detected in intermediate trophoblasts that are most invasive and migratory, but not detected in non-invasive cytotrophoblasts or syncytiotrophoblasts. However in pre-eclampsia, CD146 was no longer present in the intermediate trophoblasts, although it was detectable in the blood vessels. At the same time, we tested CD31/PECAM-1, another endothelial adhesion molecule, and found its negative staining for all kinds of trophoblasts in both normal and preeclamptic placentas. The different staining patterns of CD146 in the normal and preeclamptic placentas provide the first evidence that in pre-eclampsia, intermediate trophoblasts fail to express CD146, implicating that CD146 play an important role in trophoblast invasion. Key words: cell adhesion molecule CD146, embryo implantation, apoptosis, trophoblast invasion, pre-eclampsia 目 录 3 目目 录录 中文摘要 1 英文摘要 2 目录 3 文献综述 胚胎植入和胎盘形成的分子机理 4 一、粘附分子和胚胎植入 4 二、滋养层细胞的侵入 7 三、凋亡与胚胎植入 10 四、细胞粘附分子 CD146 及其生物学功能. 11 材料与方法 16 实验结果与讨论 24 第一部分：CD146 在小鼠胚胎植入和滋养层细胞侵入中的作用. 24 实验一 CD146 在妊娠小鼠子宫和胚胎中的动态表达. 24 实验二 CD146 在胚胎植入中的功能. 28 实验三 CD146 对次级滋养层细胞迁移的影响. 30 实验四 CD146 单克隆抗体 AA98 引起小鼠妊娠失 败 32 实验五 CD146 单克隆抗体 AA98 引起妊娠失败的机理研 究 34 讨论 35 第二部分：CD146 在妊娠疾病先兆子痫中的表达和功能. 37 实验一 研究对象的临床特征 37 实验二 CD146 分子在正常人胎盘中的分布. 38 实验三 CD146 分子在先兆子痫胎盘中的分布. 40 实验四 定量分析 42 讨论 42 参考文献 43 博士期间发表的论文 51 致谢 52 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 4 文献综述 一、粘附分子与胚胎植入 5 文献综述文献综述 胚胎植入和胎盘形成的分子机理胚胎植入和胎盘形成的分子机理 胚胎植入和胎盘形成对妊娠建立非常重要。胚胎植入的第一步是胚泡脱透 明带后，和处于“植入窗口”的子宫内膜发生特异性粘附。这一过程对胚胎植 入非常关键，要求胚泡的发育与“植入窗口”的开放严格同步，许多妊娠失败 往往发生在这个阶段。胚胎粘附到子宫内膜并向内侵入的过程中，母体子宫在 卵巢激素的影响下发生了巨大的变化。子宫上皮选择性地调整一些粘附分子的 表达，有利于胚泡的识别和植入。同时基质细胞向上皮细胞转化并增殖(蜕膜反 应)，使得子宫壁水肿增厚。胚胎植入后，靠近内细胞侧的滋养外胚层增殖形成 外胎盘锥结构，滋养层细胞由外胎盘锥向母体内膜侵入，侵入到螺旋动脉，建 立母体/胎儿交换式循环，为胚胎发育运输物质。因此，胚泡粘附，蜕膜反应和 滋养层细胞侵入是胚胎植入和胎盘形成的三个关键步骤1-3。了解它们的分子 机理，特别是控制这些过程的关键分子，对于计划生育和妊娠疾病的研究和治 疗具有重要意义。 一、粘附分子与胚泡植入一、粘附分子与胚泡植入 细胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM) 是一类介导细胞与细胞，细胞 与细胞外基质以及某些血浆蛋白的识别与结合，并参与细胞内外的信号传导的 膜表面糖蛋白。它们主要分为五大类：即粘蛋白样家族(mucin-like family)、选 择素家族(selectin family)、整合素家族(integrin family)、免疫球蛋白超家族 (immunoglobulin superfamily)、钙离子依赖的细胞粘附素家族(Ca2+-dependent cell adhesion molecule family，简称钙粘素，cadherin)。细胞粘附分子参与胚胎 的发育与分化、正常组织结构的维持、炎症与免疫应答、伤口修复、凝血与血 栓形成以及肿瘤的浸润和转移等多种生理、病理过程，在胚泡植入过程中更是 起着关键作用。研究表明母体子宫大多数时候排斥胚泡的植入，只有在特定的 窗口期，小鼠妊娠的第 4 天1，人妊娠的第 6、7 天2， 才能接受胚泡的植 入。在植入窗口期，子宫上皮特异性地表达某些粘附分子，介导胚泡和子宫上 皮的粘附。关于粘附分子对胚胎植入的控制，John 提出了一个假设4，甾类激 素控制子宫腔上皮细胞的粘附分子表达，然后作用于胚泡产生相关受体，二者 相互识别结合介导胚泡的粘附。因此粘附分子在起始胚泡植入中发挥重要的作 用。 (1) 粘蛋白样家族粘蛋白样家族 粘蛋白是表达于许多上皮细胞表面的糖蛋白， 常在中空器官的腔面形成粘 液层，可能介导了上皮细胞和微环境之间的相互作用。目前对粘蛋白尚无明确 的生物学定义，判断粘蛋白主要有两个标准：1)大量的O糖基化：O糖链至 少占粘蛋白分子量的50；2)粘蛋白域：由前后重复的氨基酸序列组成，这些 序列一般由8-169个氨基酸组成，富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，集中了大多数 的O糖链。粘蛋白域一般占整个粘蛋白序列的50以上5。 MUC1是粘蛋白家族的典型，它属于I型跨膜糖蛋白，由三个结构域组成： 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 6 短的胞内区、高度保守的跨膜区和大型的胞外区。人的MUC1蛋白的胞外区包 含20125个前后重复的氨基酸序列，这些序列由20个氨基酸组成，富含丝氨 酸、苏氨酸和脯氨酸，极易被糖基化。据估计，MUC1核心蛋白的分子量是 120225 kDa，经糖基化后，分子量增加到250500 kDa。脯氨酸和糖基化使得 MUC1形成直的长链结构伸出胞外200500 nm，遮盖了一般的细胞表面蛋白 6。 子宫上皮的腔面大多数时间都表达高分子量的粘蛋白，如MUC1。这些粘 蛋白可能保护子宫的黏膜表面，使之免受感染和降解酶类的作用。这些粘蛋白 是抗粘附性的，可能是胚胎粘附的屏障7。在人的子宫内膜中，MUC1是上皮 腔表面的主要蛋白聚糖，表达于子宫内膜上皮细胞和腔面的糖蛋白包被，另外 表达于子宫腺体并被分泌到腺体腔内。MUC-1 mRNA 和蛋白在子宫增值期的 表达量很低，但是排卵以后大量表达8，通过空间位阻调节细胞与细胞、细胞 与胞外基质的相互作用。通过阻止细胞之间的受体的相互作用，如整合素、钙 粘素等，达到阻止胚泡植入的效果。到植入窗口期，粘蛋白在许多种属的子宫 上皮重新下调，以接受胚泡的粘附。不过，人的子宫上皮仍保持MUC1的表 达，但是MUC1的硫化角质素糖链在这段时间消失了9。研究表明不孕妇女的 MUC1基因明显小于正常妇女的MUC1基因，提示MUC1和胚泡的早期植入密切 相关10。 (2) 选择素家族选择素家族 选择素(包括E，L，和P选择素)是由三个不同结构的蛋白域构成的， 即N端钙依赖的碳水化合物识别区，和EGF第一段重复区同源的区域，即EGF样 区，以及和补体调节蛋白同源的几个重复区域。 选择素参与淋巴细胞和内皮细胞的相互作用，在炎症反应中淋巴细胞的外 渗发挥了关键作用11。虽然介导胚泡和子宫上皮粘附的分子机理尚未完全清 楚，但是胚泡植入类似于炎症反应，和淋巴细胞穿过血管，渗入到组织中的过 程非常相似，因此lectin和碳水化合物的作用可能起始了胚泡粘附到子宫内膜的 最初过程。胚泡受发育调控表达多种碳水化合物，包括选择素的配体唾液酸化 的LewisX12。最近的研究表明，L-selectin在植入窗口期起始人胚泡与子宫上皮 的粘附。在植入窗口期，子宫上皮特异性上调选择素的多糖配体，而胚泡滋养 外胚层则特异性表达Lselectin。Lselectin和配体之间的结合介导了胚泡和子 宫上皮之间的粘附，可能对人的妊娠建立极为关键13。目前发现，在子宫内 膜异位症患者中参与合成Lselectin配体的N乙酰氨基葡萄糖6-O磺基转 移酶表达比正常妇女的低，这可能部分解释了由于子宫内膜异位症造成的不孕 14。 (3) 整合素家族整合素家族 整合素是细胞外基质 ECM 的一类公共受体，均由和 两个亚基构成。 和 亚基 40%-50%氨基酸序列相同，互相组合成种类繁多的整合素分子，使得 细胞能够识别大量的胞外基质，与 I 型胶原、纤粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白 (LN)、玻连蛋白(VN)、凝血酶蛋白(thrombospondin)、骨桥蛋白(osteopotin)、巢 蛋白(Entactin)及人补体 C3的 RGD(arginine-glycine-aspartic acid)序列发生特异性 结合15。 文献综述 一、粘附分子与胚胎植入 7 整合素是子宫内膜接受性的特异性标志蛋白16，在胚胎植入期高表达， 对胚泡植入颇为重要。Lessey 等研究表明，1、4、v和 3在子宫内膜上皮呈 阶段性表达17,18。v3是波连蛋白受体，从排卵后 5-6 天开始出现在人子宫 内膜上皮，以后在整个黄体期持续表达，被认为是子宫内膜接受性的标志。 41是纤粘连蛋白受体，在植入窗口期人子宫内膜中强烈表达，植入结束后， 表达明显减少。某些妇女不孕症和整合素的缺失表达密切相关。 例如在子宫内 膜异位和不孕妇女中，整合素 3的表达经常延迟和缺失，这可能是导致不孕的 重要原因17,19-21。另外胚泡也表达整合素， 51、64及v3的 mRNA 和 蛋白质在胚泡上持续表达，它们分别是 FN、LN 和 VN 的受体，在植入阶段的 表达很大程度决定了胚泡滋养层与母体子宫胞外基质的相互作用和胚泡的植入 22。 整合素及其配体的相互作用在胚胎植入起关键作用。L-selectin 和其碳水 化合物配体的作用起始胚泡的粘附，然后这种粘附通过整合素与细胞外基质中 的配体结合而进一步的牢固。动物实验证明，对妊娠小鼠子宫角注射v3的阻 断抗体显著降低胚泡植入率23。表 1 列出了在胚胎植入过程中起重要作用的 整合素。 表表 1：胚胎植入过程中重要的整合素及其配体和功能：胚胎植入过程中重要的整合素及其配体和功能 整合素 配体 功能 41 胶原(Collagens) 人子宫内膜窗口期的标志分子 层粘连蛋白(laminins) 51 纤连蛋白(Fibronectin) 在胚泡上表达，可能介导了胚泡滋养层与母体子宫 胞外基质的相互作用和胚泡的植入 纤维蛋白(Fibrin) 64 层粘连蛋白(laminins) 在胚泡上表达，可能介导了胚泡滋养层与母体子宫 胞外基质的相互作用和胚泡的植入 v3 玻连蛋白(Vitronectin) 处于接受状态的人子宫内膜标志，其表达异常和不 孕症的发生密切相关。 v3在子宫内膜和胚胎上 都有表达，它和配体的相互作用可能介导胚胎的植 入过程。 纤连蛋白(Fibronectin) 层粘连蛋白(laminin) 血小板结合蛋白 (Thrombospondin) 非 纤 维 性 胶 原 (Nonfibrillar collagen) 变性胶原(Denatured collagen) 金属蛋白酶 2(MMP2) 碱性成纤维生长因子(bFGF) von Willebrands Factor 血小板 (4) 免疫球蛋白超家族免疫球蛋白超家族 免疫球蛋白超家族是一类在结构上具有与 Ig 可变区和恒定区类似的折叠结 构，其氨基酸组成上也有一定同源性的细胞粘附分子，作用不依赖于 Ca2+离 子。免疫球蛋白超家族既包括介导同嗜性粘附的成员，如神经细胞粘附因子 (NCAM)和血小板内皮粘附分子 1(PECAM-1)，又包括介导异嗜性粘附的成员， 如细胞间粘附分子(ICAM)和血管细胞粘附分子(VCAM)。 免疫球蛋白超家族成员在胚泡植入和发育中起着重要作用。ICAM1 是最 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 8 早发现的免疫球蛋白超家族粘附分子之一，它分布广泛，与胚胎植入有密切关 系。ICAM1 的受体是白细胞粘附受体 LFA1(CD11a/CD18， L/2)。研究 表明，对妊娠小鼠注射 ICAM1 和其受体 LFA 的特异性抗体能导致胚胎的流 产24。 免疫球蛋白超家族的另一位成员血管细胞粘附分子(VCAM/CD106)一 般在 IL1、TNF等细胞因子活化的血管内皮细胞上表达，但研究发现 VCAM1 也表达于早期妊娠的蜕膜组织，而其受体(CD49d/CD29， 4/1)在 卵母细胞上高表达，胚泡孵育以后则特异性表达于胚泡极性滋养外胚层上， VCAM1 和受体之间的相互作用介导了胚泡和母体蜕膜的相互作用，对胚泡 的发育和早期生存重要25。CD146 是免疫球蛋白家族的新成员，在妊娠过程 中它特异性表达于侵入性滋养层细胞。虽然目前它的配体尚未鉴定，但是研究 证明 CD146 和表达于平滑肌细胞上的配体的结合对于控制滋养层细胞在子宫肌 层的侵入和迁移有重要作用。 (5) 钙粘素钙粘素 钙粘素分子均为单链糖蛋白，属于 I 型跨膜糖蛋白，由胞外区，跨膜区和 胞内区三部分组成，其胞外区有结合钙离子的作用，胞内区高度保守，与细胞 骨架相连。钙粘素负责细胞骨架重组并介导细胞之间的粘附。钙粘素的配体是 与自身相同的钙粘素分子。钙粘素有 3 种，分别为 E 钙粘素(Ecadherin)、P 钙粘素(Pcadherin)和 N 钙粘素(Ncadherin)，它们之间在氨基酸水平上有 4358的同源性。 Ecadherin 和胚泡植入密切相关。Ecadherin 在早期胚胎，特别是在胚泡 上有高表达26。研究发现 Ecadherin 介导小鼠胚胎的早期发育，敲除 E cadherin 基因导致胚胎不能分化形成滋养外胚层和胚泡腔，使得胚胎在植入期 死亡27,28。在母体方面，Ecadherin 在植入前在子宫上皮细胞连接处有高表 达，但是在植入启动后它的表达转至子宫基质细胞29。 植入前 Ecadherin 的表达对于维持上皮细胞的完整性非常重要，然而植入开始后，Ecadherin 在 子宫上皮上的表达在激素 calcitonin 的调控下降低30，使得上皮细胞间的粘附 连接改变，这可能有利于胚胎的植入。在胚胎植入过程中，Ecadherin 在基质 细胞上的表达29，可能介导胚胎与母体蜕膜之间的相互作用，从而为胚胎的 早期发育提供保护和营养。 子宫内膜在大多数时间是拒绝胚泡植入的，只有在特定时期才能接受胚泡 植入，而粘附分子在子宫内膜由非粘附状态到粘附状态的变化中起关键性作 用，介导胚泡粘附到子宫内膜，以及侵入过程中和胞外基质的相互作用。因此 粘附分子在胚胎植入发挥了关键的不可取代的作用。 二、滋养层细胞的侵入二、滋养层细胞的侵入 (1) 滋养层细胞的分化和调控滋养层细胞的分化和调控 在胚泡植入过程中，与子宫内膜直接接触的滋养外胚层细胞大量增殖，分 化为内外两层，内层是具有分裂能力的细胞滋养层细胞(cytotrophoblast，CT)， 外 层 是 由 细 胞 滋 养 层 细 胞 分 裂 融 合 而 来 的 多 核 的 合 体 滋 养 层 细 胞 (syncytiotrophoblast，ST)。随后内层的细胞滋养层细胞不断增殖，突破外围的 文献综述 二、滋养层细胞的侵入 9 合体层，形成小突起，成为初级绒毛。随着胚胎发育，初级绒毛逐渐分化为两 种，一种直接浸泡在母体血液中，被称为漂浮绒毛(floating villi)，一种固定在 母体蜕膜组织上，将胚胎和母体的蜕膜组织紧密联系在一起，被称为锚定绒毛 (anchoring villi)。在锚定绒毛中，绒毛内的细胞滋养层细胞继续分裂增殖突破外 围合体层，形成细胞柱。细胞滋养层细胞逐渐分化为中间滋养层细胞 (intermediate trophoblast， IT)，从细胞柱向子宫蜕膜和肌层迁移，进而侵入母 体螺旋动脉，替代其内皮细胞和平滑肌细胞，使得血液从动脉流入血管外空 间，建立母体/胎儿交互式循环，为胚胎的发育提供营养 31,32。 这个过程对 妊娠至关重要。如果螺旋动脉不能被滋养层细胞侵入，就会导致一系列的妊娠 疾病，包括先兆子痫，胎儿宫内生长迟缓和自然流产。 图图 1 滋养层细胞的分化和侵入示意图滋养层细胞的分化和侵入示意图 (2) 滋养层细胞粘附表型的转化滋养层细胞粘附表型的转化 中间滋养层细胞在侵入子宫内膜和血管，替代血管内皮细胞的过程中，会 调节其表面粘附分子的表达，模拟内皮细胞的粘附表型以替代其功能33。 研 究表明，滋养层细胞降低介导细胞粘附的 E 钙粘素的表达，导致细胞的粘附性 下降，能动性提高34,35。同时滋养层细胞提高内皮细胞特异性的血管内皮钙 粘素(VEcadherin)、血管细胞粘附分子 1(VCAM-1)、整合素4和V3的表 达33。粘附分子的表达调节对滋养层细胞获得侵入性状非常重要。功能实验 显示33，整合素V3和 VEcadherin 的表达提高中间滋养层细胞的侵入 性，而 E 钙粘素则抑制其侵入性。有趣的是，中间滋养层细胞表达的整合素4 是 VCAM1 的配体，在体外可与固定的 VCAM1 结合，提示着这两个分子 在体内滋养层细胞侵入到母体血管的过程中，可能介导中间滋养层细胞和内皮 细胞，中间滋养层细胞和中间滋养层细胞的相互作用。 先兆子痫是一种严重的妊娠疾病。在先兆子痫中滋养层细胞的侵入能力不 足，对母体蜕膜和血管的侵入非常浅，这可能是先兆子痫发病的关键因素 36。研究发现，在先兆子痫中，侵入能力缺陷的滋养层细胞几乎不表达内皮 细胞特异性的粘附分子，如整合素V， VE-cadherin 和 VCAM-1，而仍保持细 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 10 胞滋养层干细胞的表型37，提示粘附表型的转变对滋养层细胞侵入母体血管 和正常的胎盘建立至关重要。 (3) 金属蛋白酶和滋养层细胞的侵入金属蛋白酶和滋养层细胞的侵入 金属蛋白酶(MMPs)是滋养层细胞分泌的唯一能降解胞外基质中各种胶原的 蛋白酶，对滋养层细胞的侵入非常关键38。金属蛋白酶是一类结构功能相似 的蛋白水解酶家族，它们具有以下特性：(1)以酶原的形式分泌到胞外基质中， 并在适当的条件下在该部位被激活发挥生理作用。(2)活性都依赖于锌离子的存 在，钙离子对其活性和稳定性也发挥一定的作用。(3)结构上有 4050的同 源性。(4)体内存在他们天然的激活剂和抑制剂。(5)至少能水解一种胞外基质。 MMPs 家族的成员分为五大类，第一类为胶原酶，包括 MMP1， 8， 13 和 18，它们主要水解纤维类胶原。第二类为明胶酶，包括明胶酶 A(MMP2)和明胶 酶 B(MMP9)，他们主要水解变性胶原和基底膜。第三类为基质水解酶，包括 MMP3， 10 和 11。其水解底物比较广泛。第四类为模型 MMPs，包括 MMP14 到 17，其 MMP14 和 16 能水解 MMP2。第五类为其他 MMPs 39。 研究证明，明胶酶，特别是 MMP9(明胶酶 B)在胚胎植入和滋养层细胞侵 入中发挥了尤其重要的作用40。体外实验表明，滋养层细胞能合成和分泌 MMP9，MMP9 的抑制剂和特异性抗体能完全抑制滋养层细胞降解胞外基质和 迁移侵入的行为41,42。而体内 MMP9 的表达和滋养层细胞的侵入行为具有协 调性。在人妊娠的前 3 个月，滋养层细胞的侵入性最强，MMP9 的分泌也同时 达到高峰41。在小鼠中，滋养层细胞的侵入和 MMP9 的分泌都是在妊娠第 7。5 天达到高潮42。 研究表明，滋养层细胞的侵入受子宫内膜和滋养层细胞分泌的因子调控， 炎症因子，如白介素 1，6 或 15(IL1，IL6，IL15)和肿瘤坏死因子 alpha(TNF) 在体外都能刺激 MMP 的表达和滋养层细胞的侵入。相反，抗炎症因子和分化 因子，如转化生长因子(TGF)，IL10 或白细胞抑制因子(LIF)则抑制 MMP 的表达和滋养层细胞的侵入。另外有些因子如胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP1)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，和炎症因子一样能刺激 MMP 的表 达，但是孕酮被证明抑制 MMP 的表达40。 (4) 滋养层细胞的侵入与肿瘤细胞浸润的相似处滋养层细胞的侵入与肿瘤细胞浸润的相似处 滋养层细胞的侵入机制和肿瘤细胞的浸润机理颇为相似。这主要表现在以 下几点上：(1)能动性：中间滋养层细胞和肿瘤细胞一样，能侵入邻近的组织。 中间滋养层细胞的侵入性是内在固有的，不受妊娠子宫微环境的影响调控，这 在正常细胞中是非常独特的31。中间滋养层细胞的侵入能力与肿瘤细胞相 当，甚至更高。它的这一特性对胚泡植入和胎盘形成有着决定性意义。(2)蛋白 水解酶的分泌：中间滋养层细胞侵入和肿瘤浸润转移都要多次穿过 IV 型胶原 (collagen IV)、层粘连蛋白(Laminin， LN)、纤粘连蛋白(Fibronectin， FN)等组 成的基膜或基膜样细胞外基质。相似的侵入过程，预示着它们可能表达相似的 蛋白水解酶。实验证明，中间滋养层细胞产生金属蛋白酶和纤溶酶源激活因子 41,43，而这些同时也是转移性肿瘤的重要产物，是肿瘤细胞侵入基底膜所必 需的。其中尿激酶型纤溶酶源激活因子和 MMP9 在滋养层细胞和肿瘤的侵入中 起着尤为重要的作用41,42,44-47。(3)免疫逃脱机制：肿瘤细胞表达多种胚胎 文献综述 二、滋养层细胞的侵入 11 性抗原，提示在胚泡植入和肿瘤浸润转移中滋养层细胞和肿瘤细胞具有共同的 免疫逃脱机制。胚胎对母体而言是不相容的半抗原，它能顺利植入子宫内膜不 被排斥，滋养层细胞对主要组织相容性抗原(HLA)的表达调节起着重要作用。 滋养层细胞不表达刺激免疫反应的 HLA-A，-B 基因，主要表达 HLA-E，G 等 多态性基因48。类似的，肿瘤细胞也选择性地抑制 HLA-A，-B 的表达， 表 达 HLA- G 等多态性基因49,50。 (4)粘附分子的动态表达。滋养层细胞和肿瘤 细胞的侵入都依赖于粘附表型的改变33,51。研究表明，在妊娠过程中 E- cadherin 在侵入性滋养层细胞上的表达下调，导致细胞的粘附性下降，能动性 提高34,35。同样在大多数恶性实体瘤中 E-cadherin 表达下调甚至丢失，促进 了肿瘤的浸润和转移52-55。 另外滋养层细胞在侵入母体蜕膜和血管的过程 中，选择性表达一些血管特异性的粘附分子，如整合素V3和免疫球蛋白家 族的 CD14633,56。而这些分子往往和肿瘤的生长和转移密切相关。例如 CD146 在黑色素瘤，前列腺癌细胞等的侵入和转移中起着重要作用57-60。 虽然滋养层细胞侵入与肿瘤浸润存在惊人的相似之处，但是二者之间存在 本质的区别。主要表现在妊娠过程中，滋养层细胞对子宫内膜的侵入是受到精 确调控的，只能发生在特定的时间和部位。例如，虽然中间滋养层细胞象恶性 肿瘤细胞一样产生蛋白水解酶降解胞外基质，但是这些蛋白水解酶的分泌和活 性受到多方面的严密调节，使得胞外基质的水解有控制有步骤的进行，而不象 肿瘤细胞的无控性。另外，滋养层细胞是短命的，不能像肿瘤细胞一样无限增 殖。具有侵袭能力的滋养层细胞被接种到裸鼠体内时，不具有致瘤性。 三、凋亡与胚胎植入三、凋亡与胚胎植入 (1) 胚胎植入胚胎植入过程中的细胞凋亡过程中的细胞凋亡 细胞凋亡是一个生理性细胞自杀现象。它是胚胎植入过程中在子宫内膜中 所发生的一种非常普遍的现象。 在胚泡植入的起始阶段， 胚泡特异性粘附植 入位点后， 子宫上皮发生凋亡，这可能有利于胚泡的植入。随着胚胎的植入， 最接近胚泡植入室的子宫基质细胞最先转化为蜕膜细胞，然后为了给快速发育 的胚胎制造空间，迅速发生凋亡。到妊娠晚期，蜕膜细胞发生由凋亡介导的衰 退61。因此，在妊娠过程中，子宫内膜发生时空特异性的凋亡是保证胚胎正 常植入和发育的关键。 (2) 凋亡的信号通路凋亡的信号通路 虽然凋亡已被认为是胚胎成功植入的关键性决定因素，但是我们对这个过 程的细胞和分子水平的调控机理的了解远落后于对其它系统凋亡调控的了解。 不同部位的凋亡可能由不同的凋亡通路介导。研究表明，在胚胎植入过程 中子宫上皮和蜕膜的凋亡分别是由两条不同的通路介导的。子宫上皮的凋亡由 TNF 受体 1 介导，TNF 受体 1 和半胱天冬氨酸蛋白酶 Caspase3 偶联，介导凋 亡通路62。而在妊娠晚期，蜕膜有控制的衰退并没有检测到上述的凋亡受 体，但是发现了 Bax 和 Bcl2 ，以及 Caspase962,63，这说明上皮细胞和蜕 膜细胞的凋亡分别受不同通路的控制。 凋亡信号的级联多重性使得诱导细胞凋亡和抑制细胞凋亡的信号之间存在 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 12 一个精细平衡。Bcl2 是能抑制多种细胞凋亡的原癌基因，它同 Bax 结合形成异 源二聚体，能抑制 Bax 的作用，从而抑制凋亡。实验证明在大鼠妊娠后期(第 14 天起)的基蜕膜的衰退，是由 Bax 和 Bcl2 控制的内在凋亡通路介导的63。 Bax 在妊娠期一直保持低水平表达，而 Bcl2 的表达则根据不同的妊娠阶段，呈 现动态性变化。在基质细胞活跃增殖和发生蜕膜反应的高峰时期(妊娠第 8 天到 第 10 天)， Bcl2 高表达;此后， Bcl2 迅速降低至几乎不可检测的水平。 Bax： Bcl 的比例在妊娠第 17 天是第 8 天的 12 倍。如果在妊娠第 9 天，注射孕酮拮 抗剂 RU486 ，会增加 Bax 的表达，而抑制 Bcl2 的表达，使得 Bax：Bcl2 的比 例提高了 6 倍，从而促进了蜕膜凋亡的发生，导致流产。因此孕酮可能通过 Bax 和 Bcl 的表达来控制基质细胞的凋亡63。 (3) 凋亡与疾病凋亡与疾病 适当的凋亡保证胚胎植入和发育的顺利进行，但是不正常凋亡往往是导致 妊娠失败和疾病的直接原因。在正常妊娠的早期，除了胚泡植入室附近的部 位，人的子宫蜕膜内极少发生凋亡61。然而在自然流产中，子宫内的凋亡大 大加强，尤其是蜕膜细胞发生了过多的不正常凋亡64，使得蜕膜组织无法正 常地行使营养保护的作用， 从而导致胚胎流产。许多导致流产的药物，如 RU486，脂多糖(LPS)和环磷酰胺，通过控制 Bax：Bcl2 的比例变化，导致蜕膜 非正常凋亡，引发流产 63,65。 在妊娠疾病先兆子痫中，胎盘内发生的凋亡大大增加66。具有侵入能力 的细胞滋养层细胞大规模地发生凋亡，这可能是直接导致滋养层细胞在母体子 宫中侵入过浅的一个重要原因67。另外研究表明，在先兆子痫中，中性粒细 胞的凋亡落后于正常妊娠，增强了母体对胚胎的免疫排斥性， 可能是导致先兆 子痫临床症状的原因之一68。 四、细胞粘附分子四、细胞粘附分子 CD146 及其生物学功能及其生物学功能 CD146 又名 MUC18、MCAM、Mel-CAM69、A32 抗原70和 S-Endo- 171，是 Ig 基因超家族的新成员。 (1) CD146 的结构的结构 CD146 的基因序列与 Ig 基因超家族内许多细胞表面粘附分子高度同源，包 括 HEMCAM72、B-CAM 73、gicerin 74、BEN/DM-GRASP/SC1 75、 ALCAM 76和 KG-CAM 77。CD146 是一个细胞表面跨膜蛋白，有单链的跨 膜区，胞质部分相对较短，拥有潜在的蛋白激酶识别位点，胞外区有一个典型 的 V-V-C-C-C 的类 Ig 结构区 (图 2)。CD146 高度糖基化，大约 35的分子量 是由碳水化合物组成，包括唾液酸及其他的碳水化合物半糖，并且 CD146 碳水 化合物半糖的组成具有细胞特异性 70。 文献综述 四、细胞粘附分子 CD146 及其生物学功能 13 图图 2 CD146 分子的结构分子的结构 (2) CD146 的表达分布的表达分布 CD146 分子分布在有限的正常和恶性肿瘤组织中56,78-81，主要在内皮细 胞、植入位点中间滋养层细胞、毛囊的外部基壳、乳腺上皮、激活 T 细胞等正 常部位，和黑色素瘤、前列腺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤组织上表达。 Shih 用单克 隆抗体 NM-4 检测了 CD146 在石蜡包埋的人正常和肿瘤组织中的分布78。表 2 归纳了 CD146 在正常和肿瘤组织中的分布。 表表 2：CD146 分子在正常和肿瘤组织中的表达分布分子在正常和肿瘤组织中的表达分布 组织器官 正常 肿瘤 组织器官 正常 肿瘤 间充质 神经系统 平滑肌 + + 神经元 - 心肌 - 神经胶质细胞 - +/- 骨骼肌 - - 室管膜 - 成纤维细胞 - - 神经节细胞 + + 肌成纤维细胞 + 脑膜 - - 内皮细胞 + + 施旺氏细胞 + - 脂肪细胞 - - 淋巴细胞 -3 -3 上皮细胞 树突细胞 + 乳腺 + -/+1 内分泌系统 前列腺 - + 垂体 - - 子宫颈 - - 甲状腺 - - 卵巢 -/+ + 副甲状腺 -/+4 -/+4 胰腺 - - 胰岛 - - 结肠 - - 肾上腺皮质 - - 食管 - - 肾上腺髓质 - - 肾 - - 肝 膀胱 - - 肝细胞 - - 呼吸系统 胆管 - - 上呼吸道 - - 软骨细胞 - - 支气管 -/+ -/+2 间皮 - - 肺部 - -/+ 胚胎外组织 皮肤 细胞滋养层细胞 - - 角质层细胞 - - 合体滋养层细胞 - - 黑色素细胞 - + 中间滋养层细胞 + + 毛囊 + 卵黄囊 - - 细胞粘附分子 CD146 在早期妊娠和先兆子痫中的表达和功能 14 符号：，阴性；/+，变化表达；，阳性。 1 多数乳癌是 CD146 阴性，只有 17的乳癌表达 CD146；2 基细胞是 CD146 阳性，一些鳞片细胞癌 CD146 局部阳性；3 激活的特定的 T 细胞群和某些白血病表达 CD146；4 某些情况下，表达 CD146。 我们实验室用肝癌培养上清刺激的人脐带静脉内皮细胞免疫小鼠，进行筛 选得到一株特异识别 CD146 分子的单克隆抗体 AA98。表 3 总结了抗体 AA98 和多种细胞系的结合情况82。 表表3: CD1463: CD146分子在正常和肿瘤细胞中的表达分布分子在正常和肿瘤细胞中的表达分布 正常细胞 AA98结合 肿瘤细胞 AA98结合 人脐静脉血管内皮细胞 + 人结肠癌细胞LS174 - 人微血管内皮细胞HMEC-1 + 人胰腺癌细胞SW1990 - 小鼠成纤维细胞3T3 - 人肝癌细胞HepG2 - 人成纤维细胞3T3 - 人肝癌细胞ALEX - 人乳腺上皮细胞HBL100 - 人前列腺癌细胞PC-1 - 人上皮细胞A431 - 人黑色素瘤细胞A375 + 人T淋巴细胞Jurkat - 人肺癌细胞A549 - 人B淋巴细胞KG-1 - 人膀胱癌细胞T24 - 人外周血淋巴细胞 - 人胰腺癌细胞SW1990 - 人骨髓细胞 - 人结肠癌细胞LS-174-7 - 人成纤维细胞 人结肠癌细胞SW1116 - 人胚肾细胞293 人乳腺癌细胞T47D - 人骨肉瘤细胞Saos-2 人黑色素瘤细胞SBcl - 人平滑肌肉瘤细胞293 人绒毛膜癌细胞JAR 人肝癌细胞SSMC 7721 - 人肌肉瘤细胞Saos-2 注： 人纤维肉瘤细胞HT1080 + AA98结合阳性；- AA98结合阴性 人纤维肉瘤细胞HT1080 (3) CD146 的生物学功能的生物学功能 3.1 在肿瘤发展中的作用在肿瘤发展中的作用 CD146 广泛表达于黑色素瘤细胞中， CD146 的表达和黑色素瘤的转移潜 力直接相关57,58。转移性的恶性黑色素瘤细胞通常高表达 CD146 分子，而侵 入性差的良性黑色素瘤细胞往往缺失 CD146 的表达。研究表明，原本 CD146 阴性的黑色素瘤若表达 CD146 会引起肿瘤的快速生长和转移 58。而在转移性 的黑色素瘤细胞中下调 CD146 的表达会导致黑色素瘤细