CD146调控淋巴管生成的功能及机制研究

密级密级: 博士学位论文博士学位论文 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究调控淋巴管生成的功能及机制研究 作者姓名：作者姓名： 晏荟文晏荟文 指导教师指导教师: 阎锡蕴阎锡蕴 院士院士 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: 理学博士理学博士 学科专业学科专业: 细胞生物学细胞生物学 研究所研究所: 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 2017 年年 6 月月 The role and molecular mechanism of CD146 in lymphangiogenesis By Huiwen Yan A Dissertation Submitted to The University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Natural Science Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences June, 2017 书脊（此页仅用于制作书脊，不用单独打印放入论文） 调调 控控 淋淋 巴巴 管管 生生 成成 的的 功功 能能 及及 机机 制制 研研 究究 晏晏 荟荟 文文 中中 国国 科科 学学 院院 大大 学学 3cm 左右 黑体小四号，论文题目、作者、中 国科学院大学 3cm 左右 CD146 中国科学院大学中国科学院大学 研究生学位论文原创性声明研究生学位论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对论文所涉及的研究工作做出贡献 的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明或致谢。 作者签名： 日 期： 中国科学院大学中国科学院大学 学位论文授权使用声明学位论文授权使用声明 本人完全了解并同意遵守中国科学院有关保存和使用学位论文的规定， 即中 国科学院有权保留送交学位论文的副本，允许该论文被查阅，可以公布该论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 涉密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签名： 导师签名： 日 期： 日 期： 致谢 I 致致 谢谢 六年的研究生学习即将结束，回首过去，感慨万千。首先，我要感谢我的导 师阎锡蕴院士。 感谢阎老师在我学习的每个阶段给予的指导与帮助， 让我从科研 “小菜鸟”成长为实验“小达人” 。感谢阎老师的高标准严要求，让我在承受压 力的同时也享受着成长的快乐。 感谢阎老师 “自立、 自信、 自在” 的 “三自箴言” ， 让我学会了如何在顺境中饮水思源也教会了我如何在逆境中一往无前。 感谢阎老 师的言传身教，让我淡然面对过往的同时更加从容坚定的面对今后的生活。 然后，我要感谢实验室陪伴我成长的老师和同学。感谢王兆卿老师在我学术 论文撰写过程中给予的悉心指导与帮助，感谢实验室的冯静、杨冬玲、梁敏敏、 段德民、张德玺、王飞、郑继燕、刘铮、丁军、王玉春、宋丽娜等老师的辛苦付 出，为我提供良好的实验平台和健康向上的工作氛围；感谢姜天霞师姐，在进实 验室之初，给予我实验技术的指导；感谢凃涛师兄和段红霞师姐在我课题进展过 程中给予的中肯意见； 感谢实验室所有师兄弟姐妹， 六年来给予我的支持与帮助。 在此我还要衷心感谢中国科学院动物研究所刘峰教授和张春霞师姐作为合 作方给予的实验技术的支持和实验思路的指导；感谢蛋白质与多肽药物中心，秦 志海教授、梁伟教授、杭海英教授、杨福全教授及松田善卫教授对研究生考核及 课题的指点和建议。感谢生物物理所科研平台的所有老师对我提供的帮助。 最后， 我要由衷感谢我的父亲和母亲。 感谢他们将自己最好的一切给予了我， 让我自由快乐的成长；感谢他们兼收并蓄的教育方法，让我冷静但不冷漠、敏感 但不脆弱；感谢他们一路走来的认可与支持，让我不忘初衷走完博士求学路。二 十七年来， 他们牵着我的手为我遮风挡雨， 希望剩下的旅程由我为他们保驾护航。 晏荟文 2017 年 6 月 摘要 II 摘摘 要要 淋巴管系统是与血管系统并行的体内物质运输系统，在维持组织液稳态，输 送免疫细胞、参与免疫应答以及吸收膳食脂肪等过程中发挥重要作用。淋巴管生 成与组织水肿、肿瘤转移、肥胖以及炎症性疾病密切相关。近年来，随着淋巴管 标志物的发现，关于淋巴管生成的研究取得了突破进展，一些重要的淋巴管生成 调控分子相继被鉴定出来。 其中， 血管内皮生长因子 C （vascular endothelial growth factor，VEGF-C）及其受体血管内皮生长因子受体 3（vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR-3）被认为是淋巴管生成关键调控分子，在调控淋巴管 生成过程（出芽、增殖、迁移）中发挥重要作用。然而，有趣的是，VEGF-C 缺 失会阻断初始的淋巴管出芽进而抑制后续的淋巴管生成，而 VEGFR3 失活只会 影响淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，对淋巴管的出芽没有影响。那么，VEGF-C 是如何调控淋巴管的出芽的呢？这一直是本领域悬而未决的问题。 基于实验室前期研究发现敲低 CD146 造成斑马鱼严重的心脏瓣膜水肿，提 示 CD146 参与淋巴管生成。本文通过生理和病理性淋巴管生成模型证实： VEGF-C 通过 CD146 调控淋巴管的出芽并影响淋巴管的生成。CD146 作为 VEGF-C 新型独立受体， 当 VEGF-C 与 CD146 胞外端第四个 Domain 结合， 促进 CD146 发生二聚，激活其胞内区第 14-26 位氨基酸，进而刺激 p38 信号活化，促 进淋巴管出芽。CD146 缺失或特异性抗体阻断抑制生理和病理的淋巴管生成。 本文创新点如下： （1）证实 CD146 作为 VEGF-C 独立受体调控淋巴管出芽。证据如下：首先 通过体外实验，利用 CD146 特异性 siRNA 和功能性抗体 AA98，设计了免疫共 沉淀， 体外细胞功能以及相关生化实验，发现 CD146 与 VEGF-C 直接相互作用。 并且 CD146 胞外第四个 Domain 对于 VEGF-C 的结合是十分重要的。细胞功能 实验发现，不同于 VEGFR3，CD146 不仅能促进内皮细胞增殖、迁移、成管腔 等功能，更重要的是能促进内皮细胞的出芽。然后，我们以斑马鱼为模型，利用 特异性 Morpholino 分别敲低 CD146 和 VEGF-C 的表达，并对其进行实时追踪观 察，结果发现与 VEGF-C 敲低表型相似，降低 CD146 表达抑制淋巴管内皮细胞 出芽， 阻碍淋巴管前体细胞线形成， 最终导致胸导管缺失并严重的心脏瓣膜水肿。 更重要的是，选择性过表达失活型 CD146 结果发现，CD146 独立调控体内淋巴 摘要 III 管生成，这一过程不依赖于血管生成。（2）首次发现 CD146/VEGF-C 通过激活 p38 信号促进内皮细胞的出芽。体外生化和细胞实验发现，VEGF-C 不仅能激活 Erk，Akt 信号，还能刺激 p38 的活化。更重要的是，特异性信号阻断实验发现， CD146 通过特异性激活 p38 信号促进内皮细胞的出芽。 （3） 揭示 CD146/VEGF-C 通路在淋巴管生成中的重要性，为肿瘤转移靶向治疗提供新依据。我们利用 CD146 全身敲除小鼠以及特异性功能抗体 AA98， 设计了异种移植瘤以及脂多糖 （Lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症模型，结果发现，CD146 缺失或阻断会 降低肿瘤以及炎症部位淋巴管的生成， 减少免疫细胞的浸润。 有意思的是， CD146 缺失抑制哨前淋巴结中淋巴管的生成以及肿瘤远端转移但不会影响肿瘤体积的 增长，提示我们在此过程中存在其他机制调控肿瘤的生长。 本研究的科学意义在于：回答了 VEGF-C 如何调控淋巴管出芽的问题，即 不是 VEGFR3/VEGF-C，而是 CD146/VEGF-C 通过激活 p38 信号促进淋巴管出 芽进而影响后续淋巴管生成，为肿瘤转移靶向治疗提供新依据。 关键词：关键词：CD146，VEGF-C 通路，淋巴管出芽，淋巴管生成，肿瘤转移，炎症 Abstract IV Abstract Lymphatic system is a kind of transport system in parallel with the vascular system. It plays an important role in the maintenanceof tissue fluid, transportation of immune cells and absorption of dietary fat. Lymphangiogenesis is closely related to tumor metastasis,obesity and inflammatory. It is significant to reveal the mechnism of lmphangiogenesis for the treatment of these diseases. Vascular endothelial growth factor C has been regarded as the core regulator of lymphangiogenesis but our understanding of its mechnism, especially for lymphatic sprouting is limitted. In this study, we will explore the role of CD146 in physiological and pathological lymphangiogenesis in vivo and in vitro. To explore the role of CD146 in lymphangiogenesis, we search the relationship between CD146 and VEGF-C pathway at first. By using specific siRNA and antibody targeting CD146, we found that CD146 interacted with VEGF-C directly to promote proliferation,migation, tube formation and sprouting of lymphatic endothelial cells (LECs) via activation of ERK1/2 and p38 pathway. Further study showed that CD146 bound with VEGF-C by the forth domain in extracellular and using the 14-26 amino acids in the intracellular region to active the downstream pathway. Interestingly, by the use of inhibitor of related signaling, results showed that CD146 regulated LECs sprouting via activation of p38 pathway. Then, we used zebrafish as a model to explore the role of CD146 in physiological lymphangiogenesis. By using specifi Morphilino of CD146 and VEGF-C, we found that knockdown of CD146 resulted in reduction of lymphatic sprouting, defect of PL, inhibition of TD formation and sever edema. More importantly, our results showed that CD146 regulated lympangiogenesis independent of angiogenesis by use of a heat-shocking system. finally, we explore the role of CD146 in pathological lymphangiogenesis by xenograft tumor and acute inflammation model. Our results showed that blockage of CD146 inhibited the lymphangiogenesis in tumor and inflammatory areas and redued the infiltration of immune cells. Interestingly, defect of CD146 inhibited the lymphangiogenesis in sentinel lymph node and the distant metastasis of tumor cells but has no effect on the Abstract V size of primary tumors, suggesting existence of other mechanisms in this process to regulated tumor growth. The novelty of this study includes: (1) first discovery CD146 as a novel receptor of VEGF-C and revealing the underlying mechanism of lymphatic sprouting; (2) uncovering the important role of CD146/VEGF-C in physiological lymphangiogenesis; (3) providing a new basis for tumor metastasis therapy. Key words：CD146, VEGF-C pathway, lymphatic sprouting, lymphangiogenesis, tumor metastasis, inflammation 目录 VI 目 录 致 谢 I 摘 要. II Abstract IV 目 录 VI 文献综述 1 1. 淋巴管生成及调控机制 1 1.1 淋巴管系统概述. 1 1.2 淋巴管生成时间轴. 4 1.3 淋巴管生成调控机制. 7 2. 淋巴管生成与疾病 15 2.1 淋巴管与肿瘤转移. 15 2.2 淋巴管与炎症性疾病. 19 2.3 淋巴水肿. 19 3. CD146 的结构与功能 . 20 3.1 CD146 的结构与表达 . 20 3.2 CD146 的生物学功能 . 22 3.3 CD146 相关的信号通路 . 24 研究内容 27 概 述. 27 1. 材料与方法 29 1.1 实验材料. 29 1.2 实验方法. 30 2. 实验结果 41 2.1 VEGF-C 上调淋巴管内皮上 CD146 表达. 41 2.2 CD146 参与 VEGF-C 促进的淋巴管内皮细胞的活化. 42 2.3 CD146 与 VEGF-C 直接相互作用. 46 2.4 鉴定 CD146 与 VEGF-C 的相互作用位点. 47 2.5 鉴定 CD146 胞内端的活化位点 . 49 2.6 CD146 调控斑马鱼淋巴管出芽 . 50 2.7 CD146 调控斑马鱼淋巴管生成 . 52 2.8 CD146 调控淋巴管生成独立于血管生成 . 53 2.9 CD146 缺失抑制肿瘤淋巴管生成 . 54 2.10 靶向 CD146 抗体治疗抑制肿瘤淋巴管转移 . 56 2.11 CD146 缺失抑制炎症环境中淋巴管生成 . 57 3. 小结与讨论 59 参考文献 62 作者简介及在读期间发表的学术论文与研究成果 75 文献综述 1 文献综述文献综述 1. 淋巴管生成淋巴管生成及调控机制及调控机制 1.1 淋巴管淋巴管系统系统概述概述 1.1.1 淋巴管淋巴管系统系统研究简史研究简史 淋巴管系统的概念出现于 1627 年，由意大利科学家 Gasparo Aselli1首次提 出。受限于淋巴管本身透明不易观察、示踪成像技术落后等原因，淋巴管功能一 直被人们所忽视，直到 1875 年法国科学家 Sappey2绘制出第一张相对完整的淋 巴管结构分布图，才使人们逐渐意识到淋巴管系统在维持机体稳态中的重要性。 然而在随后 100 多年里， 由于缺少指征淋巴管的特异性标志物，关于淋巴管系统 的研究停滞于解剖学层面且进展缓慢。直到 21 世纪初，随着分子克隆技术的发 展，芬兰科学家 Kari Alitalo3克隆鉴定出第一个淋巴管标志物血管内皮生长因子 受体 3（vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR3）。淋巴管系统的 研究才进入到了细胞和分子生物学研究阶段。最近 10 年，淋巴管系统的研究取 得了突出成果：建立了成熟的研究技术和方法 4，鉴定出了重要的淋巴管生成调 控分子并揭示了淋巴管系统在肿瘤转移、肥胖、炎症 5,6 等疾病中的重要作用。 尽管如此，淋巴管系统作为一个古老而又年轻的研究领域，依然存在许多未 解之谜和亟待解决的问题，例如：淋巴管从何而来，淋巴管生成如何被调控，肿 瘤细胞如何通过淋巴管发生转移等。 解决这些问题对于我们更好的认识机体稳态 调节和相关疾病的治疗，都具有十分重要的意义。 1.1.2 淋巴管的分布淋巴管的分布 淋巴管系统是与血管系统并行的体内运输系统，一般认为，有血管的地方都 有淋巴管伴行。浅层淋巴管与浅层静脉并行，广泛分布于皮肤真皮层和皮下组织 中。 深层淋巴管与深层动脉并行， 主要分布于肌肉组织以及免疫和消化器官周围， 尤其在淋巴结、脾脏、肠系膜和小肠绒毛中分布密集 7-9。科学家们一度认为血 管含量丰富的骨髓和中枢神经系统中不含有淋巴管。然而，弗吉尼亚大学 Jonathan Kipnis10教授在关于免疫细胞进出脑膜途径的研究中，意外地在硬脑膜 窦中发现了与血管并行的 CD31-的管腔结构， 进一步组织原位染色和活体荧光成 像实验证明这条新发现的管道不仅表达淋巴管特异性标志物并且具有将脑脊液 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究 2 引流到颈部淋巴结的功能，第一次揭示了中枢神经系统中淋巴管的存在。这一重 大发现于 2015 年发表于 Nature 杂志，随即引起了神经和免疫学界的广泛关注， 被认为是对神经免疫学基本假设的一次挑战， 为神经炎症和神经退行性疾病的治 疗提供的了新策略。 1.1.3 淋巴管的淋巴管的结构结构和功能和功能 虽然淋巴管与血管并行存在，但二者在结构和功能上有很大的区别。与血管 连续且循环不同，淋巴管是开放且单向的运输体系。前者负责将营养和氧气运输 到组织，而后者主要将组织间隙的废物回收并输送回血液循环。 淋巴管回流与运 输的功能由各级淋巴管间协作完成。根据管腔周围壁细胞覆盖率的多少， 淋巴管 分为 3 级：毛细淋巴管，预收集淋巴管和收集淋巴管。 毛细淋巴管是淋巴管系统的盲端，主要负责物质的重吸收。它由单层内皮细 胞以“瓦片状”叠加而成，相邻细胞间缺少紧密连接，呈现出“纽扣样”结构。 内皮细胞外缺少壁细胞的包裹和基底膜的固定， 主要通过锚定蛋白丝与周围基质 相连。这些特殊结构使得毛细淋巴管具有很强的物质通透性和液压调节能力 11。 人体循环过程中， 组织间隙中 10%的渗漏液和几乎所有生物大分子、 抗原微生物 都是通过毛细淋巴管的内皮间隙进入淋巴管形成淋巴液 12。当组织出现肿胀时， 内皮细胞外与基质相连的锚定蛋白丝绷紧，导致管腔体变大、液压降低，形成较 大的内外液压差，促进组织液的回流和肿胀的消退（图 1.1）。 预收集淋巴管是连接毛细淋巴管和收集淋巴管的管道， 内皮细胞连续且紧密 相连，外壁被平滑肌细胞和周细胞部分包裹，具有较为稳固的管腔结构。预收集 淋巴管通透性差，不具有回流吸收能力，主要负责将毛细淋巴管吸收的淋巴液输 送到淋巴结或收集淋巴管 13。 收集淋巴管由预收集淋巴管汇合而成，终端与静脉相连，负责将汇聚的淋巴 液输送到淋巴结、脾脏等淋巴器官过滤，或输送回血液循环重新利用。其结构具 有以下三大特征：1、管腔内出现大量“双瓣膜”。“双瓣膜”是收集淋巴管特 有的结构。 它是内皮细胞于管腔中央形成的两个半月形小叶，其一端经锚定蛋白 丝与胞外基质相连固定于管腔内壁，另一端朝心脏方向开口。 这种特殊的结构是 防止淋巴倒流，维持淋巴液单向流动的重要保障；2、内皮细胞紧密连接呈“锌 指样”。不同于疏松的“纽扣样”连接，“锌指样”结构是一种极其紧密的细胞 文献综述 3 间连接方式（图 1.1）。当大量淋巴液汇聚于收集淋巴管，管腔内压力急剧上升 时，“锌指样”连接起到稳定管腔结构、防止淋巴液外渗的作用，是维持淋巴管 形态的关键因素；3、外壁包裹有平滑肌、骨骼肌细胞层且具有完整的基底膜。 收集淋巴管内液流量大，对管腔内壁产生向外的压力，引起外壁平滑肌和骨骼肌 细胞收缩，进而引起淋巴管的收缩，促进淋巴液的快速流动。可见，平滑肌、骨 骼肌细胞层是推进淋巴液流动、促进淋巴循环的动力保障 14-16。 图 1.1 淋巴管的结构与功能。（A）淋巴管的分类。（B）毛细淋巴管的“纽扣结构”。（C） 收集淋巴管中的“锌指结构”。 1.1.4 淋巴管标志物淋巴管标志物 自 2000 年第一个淋巴管内皮标志物 VEGFR3 被发现后，LYVE-1，Prox-1， Podoplanin 等其他标志物相继被发现。这些标志物的发现推动了淋巴管系统的研 究进程，然而遗憾的是由于表达时相的多变性和表达部位的多样性，这些标志物 在使用时都存在局限性，两种标志物联用具有更高的特异性。 1.1.4.1 血管内皮生长因子受体血管内皮生长因子受体 3（Vascula endothelial growth factor receptor 3） VEGFR3 是第一个被发现的淋巴管内皮分子标志物， 是血管内皮生成因子受 体（vascular endothelial growth factor receptor family，VEGFR ）家族成员之一。 胚胎发育早期广泛高表达于各种内皮细胞。成年后主要表达于淋巴管内皮，但在 视网膜上皮，穿孔或渗漏的血管以及一些活化的免疫细胞 17 上也能检测到 VEGFR3 的表达。 由于在静息状态下的淋巴管内皮上表达量低， 随着其它标志物 的发现，在进行淋巴管标志时 VEGFR3 很少被使用。 1.1.4.2 淋巴管内皮透明质淋巴管内皮透明质酸受体酸受体 （lympgaticvessel endothelial HA receptor） LYVE-1 是由 322 个氨基酸组成的膜蛋白，是 CD44 同家族成员，可以与胞 外基质的葡萄糖透明质酸结合，从组织摄取并转运透明质酸盐到细胞内 18。成年 体内，LYVE-1 在收集淋巴管上表达量低但毛细淋巴管上表达量高。肝、脾的窦 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究 4 状内皮细胞，巨噬细胞，淋巴结中毛细血管后微静脉（high endothelial venule， HEV，也称之为高内皮小静脉）也都检测到 LYVE-1 的表达 19,20。LYVE-1 是唯 一一个不参与淋巴管功能和生成调控的标志物 21， 但却是目前应用最为广泛的用 来标记淋巴管的标志物。 1.1.4.3 果蝇果蝇 prospero 同源异型核转录因子（同源异型核转录因子（Prospero related homeobox gene-1prox-1） Prox-1 是最早出现于淋巴管内皮的标志物， 也是最为重要的淋巴管内皮命运 决定因子 22,23。成年后虽然在晶状体、心脏、肝脏、胰腺和神经系统等多种组织 的非内皮细胞上检测到表达， 但在内皮细胞上仅表达于淋巴管内皮细胞 24。 Prox-1 一般与其它内皮细胞标志物联合使用，表征淋巴管位置与形态。 1.1.4.4 肾小球足突细胞膜黏蛋白（肾小球足突细胞膜黏蛋白（Podoplanin） Podoplanin 是一种膜表面糖蛋白，因最初发现于肾小球足突细胞而得名。主 要表达于正常组织以及良性血管肿瘤、血管肉瘤的淋巴管内皮细胞上，角化细胞 和肺泡细胞也检测到表达 25。由于在一些乳腺癌，肝癌，甲状腺癌等肿瘤淋巴管 上尚未检测到 Podoplanin 的表达 26。因此，Podoplanin 作为肿瘤淋巴管的标志物 还存在争议。 1.1.4.5 肿瘤胚胎性抗原肿瘤胚胎性抗原 M-A 的单克隆抗体（的单克隆抗体（D2-40） D2-40 与表达在胎儿睾丸和肿瘤淋巴管内皮上的氧连唾液酸糖蛋白反应。最 近研究发现，D2-40 在多种肿瘤细胞上也有表达，如非小细胞型肺癌、食管鳞状 细胞癌等，是一种特异的肿瘤淋巴管内皮标志物 27。 1.2 淋巴管生成时间轴淋巴管生成时间轴 淋巴管生成是指内皮细胞从主静脉剥落向外出芽延伸形成淋巴管的过程 4,28。虽然随着淋巴管研究动物模型（小鼠、斑马鱼）的建立，淋巴管生成时间 轴逐渐清晰，但关于淋巴管内皮细胞来源依然存在争议。 1.2.1 小鼠小鼠 小鼠淋巴管生成开始于胚胎期第 9 天（E9）。一群位于锁骨下动脉和前主 静脉（Arterior Cardinal Vein, ACV）连接处的内皮细胞，开始表达淋巴管内皮标 志物（Prox-1），在 Prox-1 等转录因子的驱动下，血管内皮开始向淋巴管内皮发 生转化。E9.5 天时，分化的内皮细胞在周围组织分泌的 VEGF-C 的诱导下，向 文献综述 5 外出芽并逐渐从主静脉上剥落。E10 天，剥落下来的内皮细胞在颈部形成第一个 淋巴液囊，即淋巴管内皮细胞发生中心，并以此为起始向皮下、背部、腹部等区 域扩散形成更多淋巴液囊。E11.5 天，淋巴液囊中的细胞向外迁移，增殖形成淋 巴管丛。E14.5 天起，淋巴管丛开始在相关基因的调控下开发生成熟和重构形成 各级淋巴管 29,30。小鼠淋巴管生成可以一直持续到出生后一个星期，这段时间主 要发生的是小肠绒毛和皮肤下的淋巴管生成， 前者形成的淋巴管又被称作乳糜管 主要负责食物中脂质的吸收，后者主要参与皮肤的更新 31。（图 1.2） 图 1.2、小鼠淋巴管生成时间轴 1.2.2 斑马鱼斑马鱼 斑马鱼体节间淋巴管由后主静脉(Posterior Cardinal Vein, PCV)分化而来。具 有接近体表，结构简单，易于观察的特点 32。 其中，附脊索线（Parachordal Line, PAC 或 PL），一群位于主干两侧纵向延 伸的浅层内皮细胞，被认为是躯干淋巴管的前体细胞。从 PL 延伸出来的细胞经 过迁移、增殖形成包括节间淋巴管（Intersegmental Lymphatic Vessels, ILV）、背 侧纵淋巴管（Dorsal Longitudinal Lymphatic Vessels, DLLV）、肋间淋巴管 （Intercostals Lymphatic Vessels, ICLV）、胸导管（Thoracic Duct, TD）在内的所 有躯干淋巴管。其中，胸导管是斑马鱼最大的收集淋巴管，负责汇聚淋巴液并输 送回血液循环 33,34。 斑马鱼淋巴管生成开始于受精后 36 小时 （36 hpf， 36 hours post fertilization） ， 由 PCV 中靠近后主动脉的一群内皮细胞以极化形式发生出芽。这群出芽的细胞 依附节间血管纵向延伸，到达体节中间转而向头部和尾部横向延伸，于 48hpf 时 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究 6 连接形成 PL，即淋巴管内皮祖细胞。PL 进一步沿节间动脉朝背侧和腹侧纵向延 伸， 于 DA （Dorsal Aorta） 和 PCV 的中间形成胸导管 （TD ， Thoracic Duct） （5dpf， days post fertilization）；于背纵吻血管腹侧形成背侧纵淋巴管（DLLV ，Dorsal Longitudinal Lymphatic Vessels）（5dpf）。停留于体节间与节间动脉相邻的内皮 细胞形成节间淋巴管（ILV ，Intersegmental Lymphatic Vessels）（3dpf）35,36。 （图 1.3） 图 1.3、斑马鱼淋巴管生成时间轴 1.2.3 淋巴管内皮淋巴管内皮来源假说来源假说 关于胚胎期淋巴管的来源目前存在3种假说。其中最早的一种假说是1902年 由美国科学家Sabin提出37， 她认为淋巴管来源于胚胎发育中期锁骨下动脉和前主 静脉之间的一群血管内皮细胞。这群细胞在相关转录因子的作用下，血管内皮标 志物表达下降而淋巴管内皮标志物表达上升， 导致血管内皮逐渐向淋巴管内皮细 胞发生转化。这一假说得到了分子生物学研究结果的支持，而被广泛接受。另一 种假说认为，淋巴管的来源与血管内皮无关，它是由间充质中一群被称为“成淋 巴管母细胞” （Lymphangioblasts）的前体细胞分化而来38。这群细胞先后在鸟类 间充质，小鼠皮下组织39和非洲爪蟾中胚层40中被报道，然而受限于早期落后的 示踪成像技术，这群细胞的存在一直备受争议。直到2015年以色列科学家 Nicenboim利用Pan-Kaede荧光转换技术证明了斑马鱼后主静脉Niche中一群既可 分化成血管也可分化成淋巴管的“成血管母细胞”（Angioblasts）的存在41， “Lymphangioblasts”假说才被人们所重视。同年Klotz等发表于Nature的另一篇 文章揭示了淋巴管内皮细胞的另一种来源卵黄囊38。他们利用细胞谱系追踪技 术证明小鼠心脏淋巴管来自于胚胎周围包裹的卵黄囊。 这一假说为淋巴管来源研 究提供了新视野，但其在各组织器官中的普适性依然有待证明。 除了以上三种假说，还有观点认为淋巴细胞也参与了淋巴管组成。 小鼠胚胎 期淋巴管中存在CD45+的细胞， 进一步研究发现巨噬细胞缺失的op/op小鼠中淋巴 文献综述 7 管发育明显滞后8。淋巴细胞参与淋巴管组成可能与淋巴管是淋巴细胞主要运输 通道且淋巴管内皮间缺少紧密连接有关。 淋巴细胞可能通过掺入内皮间隙参与淋 巴管组成。 淋巴管内皮细胞来源途径多样，任何单一假说无法概括其全貌。目前研究认 为， 胚胎期淋巴管主要由静脉周围的成血管母细胞分化而来，但在淋巴管生成的 不同时期，不同组织里也会有其他的类型细胞参与。 了解淋巴管的来源不仅有利 于我们认识淋巴管发育的过程也为肿瘤转移、 炎症性疾病等疾病的联合治疗提供 新策略。 1.3 淋巴管生成调控机制淋巴管生成调控机制 1.3.1 分化调节机制分化调节机制 淋巴管内皮的分化主要受相关转录因子的调控。 Prox-1 是最早表达于淋巴管 内皮细胞的标志分子也是调控血管内皮向淋巴管内皮分化最关键的转录因子。 E9 天，Prox-1 开始表达于主静脉一侧的内皮细胞，并上调 LYVE-1、VEGFR3 等淋巴管内皮标志蛋白的表达，进而促进血管内皮向淋巴管内皮的转化。Prox-1 基因敲除小鼠因全身缺少淋巴管出现严重水肿，并于 E10 天死亡。解剖的组织 染色结果发现，E9.5 天时，Prox-1-/-小鼠的静脉内皮依然可以出芽，只是这种出 芽是非极化的并且这群出芽的细胞保留血管内皮的特性而不表达淋巴管内皮标 志物 42,43。更重要的是，在已经分化的血管内皮中过表达 Prox-1，会导致血管内 皮标志物表达消失而淋巴管内皮标志物表达上升， 发生血管内皮向淋巴管内皮的 转化 23。 这些结果都说明 Prox1 对于淋巴管内皮细胞的命运决定是必须的， 但它 并不影响细胞的出芽和迁移。 目前关于 Prox-1 是如何被胞外信号激活的尚不清楚。但是 Prox-1 的表达是 如何被调控的已有研究报道。Francois 等研究发现 Prox1 基因启动子区域包含 Sox18（Sox 转录因子 F 亚家族一员）结合位点，Sox18 与 Prox1 基因启动子结 合上调其表达 44。与 Porx-1 不同，Sox18 只表达于淋巴管生成早期，只在淋巴管 内皮分化的准备阶段发挥作用而对正在进行的分化没有影响。Sox18 同源缺失或 其竞争抑制型突变体纯合过表达时，小鼠胚胎会出现与 Prox-1 缺失相似的表型， 即胚胎因严重水肿而死亡。然而，仅一条染色体缺失或突变体杂合表达时，小鼠 可以正常出生， 只是出生后淋巴管的重构受到影响，即皮下毛细淋巴管缺失而收 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究 8 集淋巴管管腔变大 45。除了 Sox18，Sox 家族的另外两个成员 Sox7 和 Sox17 也 被发现在淋巴管分化过程中发挥作用 46。 但它们只是在 Sox18 缺失时起到部分代 偿的作用。 另一个被报道参与淋巴管内皮分化的转录因子是 Coup-TF（Chichen ovalbumin upstream promotor transcription factor）。Coup-TF是决定静脉内皮 命运的关键调控因子，它也可以与 Prox-1 相结合（蛋白水平）调控 LYVE-1， VEGFR3 和 Podoplanin 的表达进而调控淋巴管内皮的分化 47。 有趣的是，斑马鱼体内被鉴定出存在 Prox-1 的两种亚型，Prox1a 和 Prox1b。 然而这两种 Prox-1 在斑马鱼淋巴管生成中的功能却存在争议。Karina Yaniv 和 Luca Del Giacco 等发现 Prox1a 和 Prox1b 特异性 Morfolino 敲低表达都会导致胸 导管缺失和心脏瓣膜水肿 48,49。然而，Shijie Tao 等50 在筛选到的 Prox1b 失活突 变体prox1bhu3510中并没有发现水肿或淋巴管缺失等现象。 我们猜测造成前后结 果不一致的原因是 Morpholino 的脱靶效应，而 Prox1a 在淋巴管生成中的作用仍 需要突变体结果加以证明。Sox18 和 Coup-TF44,51,52等都被证明是斑马鱼淋巴 管生成所必须的， 然而一直没有体内直接证据证明这些转录因子对于斑马鱼淋巴 管内皮的分化是必须的。 2015 年， Nicenboim 等 41 利用体内细胞谱系追踪的方法 发现 Wnt5b 通过经典 -cantenin-TCF/LEF 信号调控成血管母细胞向淋巴管内皮 的分化，进一步机制研究发现 Wnt5b 通过活化 Coup-TF和 Prox-1 上调淋巴管 内皮标志物表达，促进血管内皮向淋巴管内皮转化。 1.3.2 出芽的调节机制出芽的调节机制 出芽是指淋巴管内皮细胞从静脉起始以极化方式向外延伸形成淋巴液囊的 过程。 这是淋巴管生成的起始阶段也是整个过程的决定步骤，淋巴管出芽异常会 导致全身淋巴管缺失。VEGF-C 是目前已知的调控淋巴管出芽的核心分子 53，其 他调控因子都是通过直接或间接影响 VEGF-C 的表达来影响淋巴管的出芽。然 而，关于 VEGF-C 如何直接调控淋巴管出芽依然知之甚少。这也是本论文要解 决的科学问题。 1.3.2.1 血管内皮生长因子及其受体血管内皮生长因子及其受体 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factors，VEGFs）及其受体 （VEGFRs）是血管生成和淋巴管生成过程中重要的调控因子。VEGF 家族包括 五个成员： VEGF-A、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D和PIGF （Placenta growth factor） 。 文献综述 9 除此以外，羊痘病毒中得到的同源物被命名为 VEGF-E，蛇毒液中分离出的同系 物被称作 VEGF-F。VEGF 主要与内皮细胞上 3 种受体酪氨酸激酶受体结合，它 们分别是： 血管内皮生长因子受体 1 （VEGFR1/fms-like tyrosine kinase 1 （Flt1） ） 、 血管内皮生长因子 2（VEGFR2/human kinase insert domain receptor (KDR),mouse foetal liver kinase 1(Flk1)、血管内皮生长因子 3（VEGFR3/fms-like tyrosine kinase 4（Flt4）。所有受体都由胞外端七个免疫球样结构域以及保守的酪氨酸激酶 胞内端组成。 不同的生长因子与不同的受体结合在血管生成和淋巴管生成中扮演 不同的角色 54。其中 VEGF-A、E/VEGFR2 被认为是血管生成中最重要的调控通 路 55,56。VEGFR1 可以与 VEGF-A、B、E、F 结合，在生理性血管生成过程中拮 抗 VEGFR2 的作用，抑制血管生成 57-59，肿瘤血管生成过程中与 VEGFR2 协同 作用，促进血管生成 60,61。目前为止只有 VEGF-A、C/VEGFR262,VEGF-C、 D/VEGFR363-65通路被报道在淋巴管生成中发挥作用。其中 VEGF-C 被认为是调 控淋巴管出芽的最重要的调控因子。（图 1.4） 1.3.2.2 VEGF-C 的结构的结构及功能及功能 与同家族其它成员相同的是， VEGF-C 也是一种分泌型二聚体糖蛋白生长因 子，包含一个半胱氨酸 knot motif，即 8 个有规律间隔排列的半胱氨酸残基构成 一个单体。与其它成员利用可变剪切达到成熟不同的是，VEGF-C 的成熟经历的 是蛋白质水解的过程。VEGF-C 的前体是一种由二硫键连接的二聚体，只与 VEGFR3 结合。 被分泌到细胞外的前体蛋白， 在血纤维蛋白溶酶和其他蛋白酶的 作用下，发生蛋白水解变成非二硫键连接的同源二聚体，这种成熟状态的 VEGF-C 与 VEGFR2 和 VEGFR3 之间都具有很高的亲和力 66。为了研究 VEGF-C/VEGFR3 通路在淋巴管生成中的作用， Alitalo 等构建出一种 VEGF-C 的 突变体VEGF-C156S，即将 VEGF-C 第 156 位的半胱氨酸（C）突变成丝氨酸 （S），使得前体状态的 VEGF-C 不会被胞外蛋白酶识别水解，从而保留其只结 合 VEGFR3 的特性。这种突变体被广泛应用于 VEGF-C 诱导的淋巴管生成的研 究 64。（图 1.3） 1.3.2.3 VEGF-C 调控淋巴管出芽调控淋巴管出芽 小鼠胚胎组织染色结果发现，VEGF-C 主要表达于正在出芽的主静脉、淋巴 液囊以及新生淋巴管周围。成年小鼠皮下过表达 VEGF-C，会导致淋巴管大面积 CD146 调控淋巴管生成的功能及机制研究 10 增生和管腔增大 67,68。条件诱导肺上皮过表达 VEGF-C 模型中，小鼠主气管、肺 血管以及胸膜周围的淋巴管数量增多，出现类似人肺淋巴管扩张症的表型 69。条 件诱导 Vegf-c 敲除模型中，小鼠小肠淋巴管（乳糜管）数量减少，脂质吸收降 低且葡萄糖代谢升高 70。 受损的收集淋巴管会在 VEGF-C 的刺激下引起毛细淋巴 管的固有成熟程序。这些结果都揭示了 VEGF-C 在淋巴管生成过程中的重要性。 然而，更重要的发现是，两条染色体上 Vegf-c 缺失，不影响主静脉内皮向淋巴 管内皮的分化，但是，分化的淋巴管内皮只停留在主静脉的周围而无法进一步出 芽向外延伸形成淋巴液囊。胚胎于 E14.5-17.5 天时因淋巴管发育异常而死亡 53。 非洲爪蟾和斑马鱼的研究中也发现同样的表型 71。进一步研究证明，单条染色体 上 Vegf-c 缺失不会导致小鼠胚胎致死，但会导致成年小鼠淋巴管数量减少和局 部组织的水肿， 并且这种缺陷可在过表达 VEGF-D 后得到改善。 然而， 只是 Vegf-d 缺失不会影响淋巴管的出芽和发育 72， 只导致成年小鼠淋巴管异常和轻微组织水 肿 73。 以上结果表明 VEGF-C 是调控淋巴管生成尤其是出芽的关键分子， VEGF-D 在淋巴管生成过程中起到部分代偿作用 74。 1.3.2.3 VEGF-C 的受体及其功能的受体及其功能 1.3.2.3.1 VEGFR3 VEGFR3 是公认的 VEGF-C 的酪氨酸激酶受体。VEGF-C 与 VEGFR3 胞外 D1-D3 结构域结合引起 D5-D7 的二聚，进而引起胞内激酶区域酪氨酸自磷酸化， 促进下游信号的激活。胚胎发育早期 VEGFR3 表达于各类内皮细胞，随着发育 的进行， 逐渐特异性表达于淋巴管内皮。 VEGFR3 可以与其同家族成员 VEGFR2 形成异源二聚体，参与 VEGF-A 促进的血管生成。Vegfr3 全身敲除小鼠因早期 血管发育异常而死亡 75。Vegfr3+/-小鼠出生后会因为淋巴管生成降低而导致严重 的组织水肿和乳糜胸 76。腺病毒载体过表达可溶性的 VEGFR3（sVEGFR3， VEGF-C/D 阻断剂）导致胚胎期淋巴管生成异常但不影响小鼠的正常发育，进一 步观察发现，出生两周内已经生成的淋巴管出现衰退和减弱，但是这种衰退在出 生后第四周就会消失，第五周起淋巴管又开始正常生长 77。斑马鱼中过表达 sVEGFR3 同样会导致淋巴管生成减少 71。这些结果说明，VEGFR3 参与胚胎期 淋巴管的成熟与重构但不影响出生后淋巴管功能的维持。 文献综述 11 1.3.2.3.2 VEGFR2 VEGFR2 是血管生成过程中最重要的膜受体。 它在淋巴管内皮上表达水平很 低但可与 VEGFR3 形成异源二聚体调控淋巴管生成 78。腺病毒载体或条件性皮 下过表达 VEGF-A 的小鼠，淋巴管出芽不受影响但会导致淋巴管管腔变大 79,80。 小鼠角膜血管生成诱导模型中， VEGF-A 不仅能促进血管生成也能促进淋巴管的 生成，但淋巴管的生成滞后于血管生成 81。虽然 Vegfr2-/-小鼠会因血管缺失而于 胚胎期死亡，但是 Vegfr2+/-小鼠却没有发现明显的血管或淋巴管生成异常 55。这 些结果表明，VEGFR2 参与出生后淋巴管的形成但对胚胎期的出