一个肿瘤新生血管相关性粘附分子在肝癌中表达的研究

分类号 密级 UDC 学 位 论 文 一个肿瘤新生血管相关性粘附分子在肝癌中表达的研究一个肿瘤新生血管相关性粘附分子在肝癌中表达的研究 作 者 姓 名 赵 心 刚 指导教师姓名 刘声远 教授 东北大学理学院 阎锡蕴 研究员 中科院生物物理所 申请学位级别 硕 士 学 科 类 别 工 学 学科专业名称 应 用 化 学 论文提交日期 2003 年 2 月 论文答辩日期 2003 年 2 月 学位授予日期 答辩委员会主席 苏永渤 评 阅 人 苏永渤 王林山 东 北 大 学 2003 年 2 月 A Thesis in Applied Chemistry Research on the Expression of a Tumor Neo-vasculature Related Adhesive Molecule in Hepatocellular Carcinoma by Zhao Xingang Supervisor: Professor Liu Shengyuan Professor Yan xiyun Northeastern University February 2003 声明声明 本人声明所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得的 研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 本人签名： 日 期： 东北大学硕士学位论文 英文缩略词 英文缩略词英文缩略词 aa 氨基酸(amino acid) Ab 抗体(antibody) Ag 抗原(antigen) Amp 氨苄青霉素(ampicillin) AP 过硫酸铵(ammonium persulfate) BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate) bFGF 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor) bp 碱基对(base pair) CAM 细胞粘附分子(cellular adhesive molecule) CAMAs 鸡尿囊膜实验(chicken chorioallantoic membrane assays) CD 白细胞分化抗原(分化群)(cluster of diferentiation) cDNA 互补DNA( complementary DNA) DAB 二氨基联苯胺(diaminobenzidine) DEPC 二乙基焦碳酸脂(diethylpyrocarbonate) DIG 地高辛(digoxigenin) DMSO 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide) DNA 脱氧核糖核酸(desoxyribose nucleic acid) dNTP 四种脱氧核糖核苷酸(four deoxyribonucleotides) DTT 二硫苏糖醇(dithiothreitol) EB 溴化乙锭(ethidium bromide) EC 内皮细胞(endothelial cell) ECM 细胞外基质(extracellular matrix) EDTA 乙二氨四乙酸( ethylene diamine tetraacetate) ELISA 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay) Flk-1 胎肝激酶-1(fetal liver kinase-1) Flt-1 fms 型酪氨酸激酶-1(fms-like tyrosine kinase-1) HRP 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase) HUVECs 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells) Ig 免疫球蛋白(immunoglobulin) IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖甘(isopropyl-D-thiogalactopyranoside) kb 千碱基对(kilo base) 东北大学硕士学位论文 英文缩略词 McAb 单克隆抗体(monoclonal antibody) MMP 基质金属蛋白水解酶(matrix metalloproteinase) NBT 氯化硝基四氮唑蓝(Nitro Blue Tetrazolium Chloride) -ME -巯基乙醇(-mercaptoethanol) PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PFA 多聚甲醛(paraformaldehyde) RNA 核糖核苷酸(ribose nuleic acid) rpm 每分钟转数(rounds per minute) RT-PCR 反转录PCR(reverse transcription PCR) SDS 十二烷基硫酸钠(sodium dedecyl sulfate) TEMED N, N, N, N-四甲基乙二胺(N, N, N, N-tetra methyl ethylene diamine) Tris 三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) VEGF 血管内皮生长因子(vascualr endothelial growth factor) X-gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl- D-galactosis) 东北大学硕士学位论文 摘要 一个肿瘤新生血管相关性粘附分子在肝癌中表达的研究 摘要摘要 许多体内外实验证明了抗肿瘤血管生成疗法的有效性。 研究表明用抗体或小肽封闭 特异表达在肿瘤血管内皮细胞表面的生长因子受体， 拮抗受体和配体的结合， 能够抑制 内皮细胞的增殖和迁移，破坏肿瘤血管生成，从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。而 对这些受体特异性表达行为的研究将有助我们采取针对性的策略， 以达到治疗肿瘤的良 好效果。 模仿体内肿瘤血管内皮与肿瘤细胞生长相互刺激的状态， 用经肝癌细胞培养上清刺 激的人脐静脉内皮细胞免疫小鼠，我们制备了一株特异结合肿瘤血管的单克隆抗体 AA98。 本文以此为基础， 用免疫组织化学的方法研究了AA98 靶分子在肝癌和癌旁肝组织 血管中的分布。以抗血管内皮标志分子 CD31 的单克隆抗体标记的血管为对照，发现 AA98 结合肝癌动脉血管的内皮和内皮外平滑肌组织以及静脉血管内皮，与癌旁肝组织 的部分血管结合；AA98 不结合正常肝组织的血管。另外在实验中发现癌旁肝细胞中有 较高的抗体结合阳性反应， 结果表明是肝组织中内源性的生物素和三抗辣根过氧化物酶 标记的卵白素的结合反应产生干扰。而肝癌发生区域表现为内源性生物素表达的下调， 这是否可以作为肝癌发生的诊断依据还需要进一步的研究。 为了解决在相同肿瘤组织的石蜡切片中用免疫组化方法检测不到 AA98 靶分子信 号的问题，本文建立了最适合单抗AA98 和抗原结合反应的抗原修复条件。 从实验结果 比较得到用0.001mol/L的EDTA(pH8.0)为抗原修复液， 在微波炉中低火加热8分钟能够 达到最好的抗原修复效果。 本文对AA98 靶分子在肝癌血管中表达上调的分子机理作了有益的探索。以AA98 靶分子编码序列中的一段DNA转录得到的mRNA 的互补RNA 作为探针，进行肝癌组 织石蜡切片的原位杂交。在肝癌血管内皮和内皮周围平滑肌组织中都检测到表达AA98 靶分子的 mRNA 的转录信号，这和肝癌组织免疫组化在蛋白水平上得到的结果一致。 结果提示肝癌血管中靶分子的上调是重新合成的过程。 关键词： 抗肿瘤血管生成疗法 肝癌 免疫组化 原位杂交 抗原修复 东北大学硕士学位论文 Abstract . Research on the Expression of a Tumor Neo-vasculature Related Adhesive Molecule in Hepatocellular Carcinoma Abstract Many experiments in vivo and in vitro have verified the validity of the Tumor Anti-Angiogenesis Therapy. Research results have showed when blocking the specifically expressed receptor of the growth factor on the membrane of the vascular endothelial cells, the proliferation and migration of the vascular endothelial cells can be controlled, and the angiogenesis process in tumor can be repressed, and the volume of tumor can be restrained to a minimal degree. We mimic the process of the interaction of tumor cells and vascular endothelial cells in vivo to stimulate human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) with hepatoma cells culture supernatant in vitro. By using the stimulated HUVECs to immunize mice, a hybridoma secreting mouse monoclonal antibody named as AA98, which specifically bind to tumor vessels, has been generated. This paper has made a conclusion of the distribution of the targeted molecule of AA98 in hepatocellular carcinoma (HCC) based on immunohistochemistry. The results have showed that AA98 specifically bind to the endothelium and smooth muscle tissue of artery and the endothelium of vein in HCC and pericancer region. AA98 dont bind to the vessels in normal liver tissues. We also find that there are expression of endogenic biotin in normal liver tissue, and a down-regulation expression of endogenic biotin in HCC. Can the endogenic biotin be a diagnostic marker of the occurrence of HCC? It also calls for detail research work. It is odd that there is no signal can be detected in the formaldehyde-fixed、 paraffin-embebed cancer tissue section while there are intensive signals can be sensed in the frozen-sections. Its a result of the crosslink of proteins in the tissue that block the epitope of the antigen; therewith the antibody cannot bind to the antigen. In order to solve the problem, we established an optimum method of antigen retrieval named heat-induced epitope retrieval (HIER) for the AA98 immune reaction. By boiling the section in 0.001mol/L EDTA (pH8.0) solution in a microwave oven with low-fire heating for 8 min, an ideal antigen retrieval effect can be attained. This paper makes a basic research in the molecular mechanism of the up-regulation of the monoclonal antibodys targeted molecule in HCC. We transcript a segment of DNA of the known antigens coding sequence from 180 to 538 to a digoxigenin-labeled 东北大学硕士学位论文 Abstract . antisense RNA probe. By using this probe, we detected the signal of the transcription of the antigens mRNA in the vessels endothelium and smooth muscle tissue in HCC. The results of in situ hybridization are consistent with the results of immunohistochemistry well. It shows that the up-regulation of the targeted molecule of AA98 in the vessels of HCC is a result of a process of de novo synthesis. Key words: tumor anti-angiogenesis therapy hepatocellular carcinoma immunohistochemistry in situ hybridization antigen retrieval 东北大学硕士学位论文 目录 . 目 录 声明I 英文缩略词.II 摘要.IV Abstract .V 第一章 文献综述：抗肿瘤血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用.1 1 抗肿瘤血管生成疗法的提出1 2 以内皮细胞为靶点的抗肿瘤血管生成2 2.1 以血管生长因子 VEGF 和它的受体为靶点3 2.2 以内皮细胞上表达的粘附分子为靶点.3 3 展望.5 第二章 前言.8 1 立题依据.8 2 实验设计.8 2.1 肝癌及癌旁肝组织的免疫组化.8 2.2 肝癌及癌旁肝组织的原位杂交.8 3 课题的意义10 第三章 肝癌组织的免疫组化.11 1 实验材料和主要仪器.11 2 实验方法.12 2.1 肝癌组织冰冻切片的免疫组化.12 2.2 肝癌组织冰冻切片的免疫荧光.12 东北大学硕士学位论文 目录 . 3 实验结果与讨论.12 第四章 石蜡切片的抗原修复.16 1 实验材料.18 2 实验方法.18 2.1 玻片的处理.18 2.2 切片.18 2.3 抗原修复和免疫组化.19 3 实验结果与讨论.19 第五章 肝癌组织的原位杂交.20 1 实验材料和主要仪器20 2 实验方法22 2.1 用于原位杂交的 cRNA 探针的制备.22 2.2 肝癌组织的石蜡包埋和切片.27 2.3 肝癌组织石蜡切片的原位杂交.28 3 实验结果与讨论.28 第六章 结论32 参考文献.34 致谢39 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 1 - 第一章 文献综述 抗肿瘤血管生成疗法在肿瘤治疗中应用的进展 1 抗肿瘤血管生成疗法的提出 实体瘤的生长和转移依赖于血管生成(angiogenesis)1-4。在肿瘤生长前期(无血 管生成)，肿瘤仅能维持较小体积。一旦肿瘤血管形成，肿瘤细胞即可以从宿主获 得氧和营养，使肿瘤迅速生长、浸润(infiltration)。肿瘤细胞侵入血管，通过血液 循环，定植于转移靶器官，并诱导新一轮血管生成。无血管期的肿瘤没有转移能 力。 血管生成是一个复杂的过程，有许多生长因子(growth factor，GF)及其受体、 胞外基质(extracellular matrix，ECM)组分、蛋白水解酶(proteolytic enzymes)和细胞 粘附分子(cellular adhesive molecule，CAM)等参与反应，其步骤包括5：(1)维持血 管正常代谢的刺激因子和抑制因子之间的平衡被打破，促血管生成因子的活性上 调，使得血管内皮细胞被激活，细胞分裂和增殖加快6,7；(2)血管基底膜(basal membrane)中的金属蛋白酶(metalloprotein)、丝氨酸蛋白酶(serine proteinase)、组织 血纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator)、尿激酶型血纤溶酶原激活剂 (urokinase-type plasminogen activator)等多种水解酶类水平上调8，降解血管基底膜 与细胞外基质；(3)血管内皮细胞膜上的粘附分子表达上调，导致内皮细胞侵入周 围组织的基质层并增殖和迁移；(4)各种促血管内皮生长因子的受体分子表达量也 相应增加，这些受体与生长因子结合，促进内皮细胞组装形成管腔、管攀和血管 网；(5)在血管生成调节因子作用下，通过促进或松弛内皮细胞与其周围支持细胞 的相互作用，完成新生微血管重塑，细胞外基质的重新沉积形成新血管。 根据形态学观察，与正常血管相比，肿瘤新生血管处于快速增殖状态，血管 管腔膨胀形成囊状，血管内皮细胞之间间隙大，基底膜不完整，缺乏血管平滑肌， 渗漏性高9。 基 于 以 上 事 实 ， Folkman 提 出 了 抑 制 肿 瘤 血 管 生 成 疗 法 (tumour anti-angiogenesis therapy)的抗癌新策略，即通过抑制肿瘤血管生成，来控制肿瘤的 生长和转移10。主要有三个目标11：(1)刺激内源性抑制因子的大量产生和发生作 用，中和内源性血管生成刺激因子；(2)抑制血管内皮细胞的增生、趋化和迁移； (3)防止血管基底膜被破坏和细胞外基质的降解，释放贮藏在细胞外基质中的生长 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 2 - 因子。 从理论上讲，血管生成的每一个环节，都可能作为抑制肿瘤血管生成疗法的 靶点。例如通过拮抗血管内皮细胞上的受体和配体的作用，抑制内皮细胞的增生 和迁移；通过抑制金属蛋白酶活性保护血管基底膜不被降解，从而抑制血管内皮 细胞的迁移；通过干扰细胞内信号通路，抑制细胞的生长。许多体内体外实验证 实了这种肿瘤治疗方法的有效性。最为直接的证据是血管生成抑制剂 Angiostatin 的抑瘤实验。 Angiostatin 发现于 1994 年，它是血纤溶酶原的降解片段，包含了血纤溶酶原 N 端的四个由二硫键连接的 loop 环结构12。体外实验证明 Angiostatin 能够特异地 抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，而对肿瘤细胞以及其它非血管内皮细胞无作用。 通过体内实验发现 Angiostatin 能够抑制原发性肿瘤的生长和转移，可使肿瘤转移 灶的大小保持在无血管状态。此时，尽管肿瘤细胞仍快速增殖，但同时也在快速 凋亡，使肿瘤体积不再长大10。关于 Angiostatin 抑瘤机理，有人认为 Angiostatin 是作为组织血纤溶酶原激活剂tTPA催化的血纤溶酶原活性的非竞争性抑制剂而降 低了内皮细胞的增殖和迁移能力，体外的结合实验也发现 Angiostatin 的确能够结 合血纤溶酶原13；有的研究者通过实验提出了相反的机理，认为 Angiostatin 并不 是通过抑制血纤溶酶原活性而对内皮细胞的增殖和迁移产生负作用，而是通过结 合内皮细胞表面的 ATP 合成酶的亚基而使 ATP 合成受阻，从而对内皮细胞产生 不可逆的破坏作用14。 2 以内皮细胞作为靶点的抗肿瘤血管生成 在以上提到的抑制肿瘤血管生成的机理中，抑制血管内皮细胞的增生、迁移 和粘附成为了抑制肿瘤血管生成疗法的首要靶标。因为在肿瘤新生血管内皮细胞 上表达有很多肿瘤血管特异性的分子，这些分子很多都参与了血管生成，而针对 这些分子的药物使得该治疗手段具有很高的肿瘤特异性，使得这种抗肿瘤疗法具 有很多优越性：具有肿瘤特异性，副作用小，药物通过静脉注射可以直接到达靶 位点，很少产生抗药性，而且药物用量少、疗效高。通过拮抗在肿瘤血管内皮细 胞表面特异性表达的受体蛋白与其配体的作用，抑制内皮细胞的迁移，诱导内皮 细胞的凋亡，破坏新生血管的形成，来达到抑制肿瘤生长和转移的目的，成为抗 血管生成疗法常用的手段。 在血管生成起始阶段，肿瘤细胞分泌的一些血管生长因子包括血管内皮生长 因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors, bFGF)等和血管内皮细胞上受体的结合是激活内皮细胞的 重要因素，结果是导致内皮细胞的增生和迁移，因此拮抗生长因子配体和内皮细 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 3 - 胞上受体的结合成为抑制肿瘤血管生成的重要策略。 2.1 以血管生长因子 VEGF 和它的受体为靶点 血管内皮生长因子 VEGF 是一类内皮细胞特异性有丝分裂原，在很多肿瘤中 它都有高水平分泌，已经有许多实验结果证实它在血管生成中的重要作用，如果 将 VEGF 的等位基因敲出，小鼠胚胎将因为血管发育不良而死亡。发展一株抗 VEGF 的单克隆抗体成为了一个显而易见的想法。 在这方面遇到的一个技术难题是 找不到具有人抗鼠 VEGF 或者鼠抗人 VEGF 交叉活性的单克隆抗体，所以就很难 评价人源化的 VEGF 抗体在荷鼠源性肿瘤小鼠模型中所具有的作用，解决的办法 是建立荷人瘤双缺陷小鼠模型，进行临床前实验 15。结果发现，抗 VEGF 的鼠源 单抗A.4.1.6能够完全抑制包括前列腺癌、 卵巢癌等在内的许多肿瘤的血管生成16。 目前人源化抗 VEGF 单抗 rhuMAbVEGF 已经进入二期临床实验， 从一期临床实验 来看，rhuMAbVEGF 能够能够抑制肿瘤内血管生成，而且长期使用无毒附作用， 只对妇女的正常月经周期产生比较明显的影响17。从以前的实验结果来看，该抗 体具有很诱人的前景。 比起用抗体来中和肿瘤细胞产生的大量的 VEGF， 用单克隆抗体或者是小分子 封闭激活的血管内皮细胞上表达上调的 VEGF 受体与 VEGF 结合位点则显得明智 的多，因为只要用很小的剂量就能达到很好的疗效。DC101 是一株大鼠抗小鼠血 管内皮生长因子 2 型受体(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)的 单克隆抗体，在荷人瘤小鼠模型实验中，DC101 能够完全抑制肿瘤的生长18,19,20。 在一些肿瘤模型中，DC101 持续介入治疗后 200 天内没有发现肿瘤的复发，并且 没有观察到有任何的不良毒副作用，因为低量的 VEGFR-2 的表达对于正常的血管 生成，包括创伤愈合、骨髓生成等过程是必需的，这可能提示处于静息期的血管 内皮细胞对于 VEGFR-2 的依赖性很小；而对照组即达到抑瘤效果后停止 DC101 的介入治疗，肿瘤很快又恢复生长。实验中还观察到 DC101 能够抑制内皮细胞增 生，诱导内皮细胞的凋亡，结果导致血管的退化，DC101 介入治疗两周后，可以 观察到肿瘤中的坏死区域的扩大。这也很好的说明了实体瘤的生长需要血管提供 营养。 2.2 以内皮细胞上表达的粘附分子为靶点 内皮细胞的生长很大程度上依赖于和细胞周围基质的相互作用。在迁移、入 侵和血管生成过程中，内皮细胞必须能够粘附于胞外基质成分，以此而获得锚定 和生存；而且内皮细胞还必须能够互相识别，以此来组装和保持血管的管腔结构； 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 4 - 最后内皮细胞还需要和其他的一些细胞，例如周细胞和平滑肌细胞互相作用以形 成成熟的血管，和一些炎症细胞作用以激活内皮细胞和再起始血管生成。 粘附分子(adhesive molecule)是由细胞产生、存在于细胞表面、介导细胞与细 胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合的一类分子。粘附分子大多为糖蛋白， 少数为糖脂，以配体受体相对应的形式发挥作用，参与细胞的信号转导与活化、 细胞的伸展和移动、细胞的生长及分化、创伤愈合、炎症、血栓形成、肿瘤转移 21,22,23,24等一系列重要生理和病理过程。按结构特征将粘附分子分为四类：整合素 家族(integrin family)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)、选择素家 族(selectin family)和钙粘蛋白家族(cadherin family)。 在肿瘤血管生成过程中，一些粘附分子特异性的表达在内皮细胞上，如血管 内皮细胞钙粘连素(vascular endothelium-cadherin, VE-cadherin)，或者在激活的内皮 细胞上表达上调，如整合素(integrin)v3，具有肿瘤血管相关性或特异性。这些粘 附分子在肿瘤细胞浸润、转移和肿瘤血管生成过程中发挥着重要作用。这些特异 性表达在肿瘤血管内皮细胞上的粘附分子可以作为抑制肿瘤血管生成疗法的很好 的靶标。 血管内皮细胞表面粘附分子表达数量的调节方式主要有诱导贮存在细胞内的 粘附分子转移到细胞表面和诱导粘附分子的重新合成两种方式。转移形式的过程 发生迅速，只需数秒钟，但维持时间短暂。重新合成过程发生较为迟缓，一般需 数小时，但维持时间较长。当细胞受到细胞因子的刺激，位于细胞膜上的受体把 信号传导到胞内，通过一定的信号通路，引起细胞的应答，开始转录一些在静态 被抑制的基因，或者放大基因的转录量。在研究细菌感染的心血管内皮细胞粘附 分子表达上调的机理时发现，用细菌脂多糖(bacterial lipopolysaccharide，BLP)和肿 瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)共刺激培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，引起核因子 kappaB(nuclear factor-B， NF-B)的内流和p38有丝分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase) 的活化，放大了相应粘附分子基因的转录量，从而引起表达量的上调25。NF-B 因子家族含有锌指结构，能够与靶基因上的增强子序列位点结合，其中结合能力 最强的是蛋白 p65 和 p55 形成的二聚体。NF-B 因子家族的共同特点是除 B 淋巴 细胞外， 在未经激活的其他细胞中， NF-B 都通过锚蛋白重复序列与抑制蛋白 I-B 的氨基酸重复顺序 ankyin repeats 结合，而以非活化形式存在于细胞质内。细胞在 受到外部信号的刺激，如上提到的 TNF 以及佛波脂、白介素等，从而激活细胞内 的蛋白激酶 C(protein kinase C)、 血红素调节的 HR1 等信号途径， 导致 I-B 的磷酸 化，使胞质内的 NF-B 与 I-B 解离。NF-B 内流与核内靶基因增强子序列位点结 合并发挥转录调控作用。 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 5 - 整合素(integrin)是一类粘附分子家族， 是由 和 两个亚基组成异源二聚体跨 膜糖蛋白，现在发现在哺乳动物体内由至少 16 种 亚基和 8 种 亚基组成的 24 种整合素分子中，在内皮细胞上主要表达 3、5和 3126。整合素胞外部分通 过和配体包括纤连蛋白、胶原和蛋白聚糖结合形成复合体，胞内部分通过衔接蛋 白(adaptor protein)和细胞骨架相连，构成了细胞内外信号传递的结构基础。整合素 参与细胞的增殖、分化、细胞周期和淋巴细胞的归巢等多种细胞活动，所有这些 功能都是整合素通过介导细胞外基质配体与细胞内的骨架蛋白的信号传递实现 的，如释放 Ca2+进入细胞质、肌醇第二信使的合成、胞内蛋白酪氨酸残基的磷酸 化等，有意思的是，很多通过激活整合素引起的细胞内外信号传导旁路，也是由 一些生长因子引起的信号传导，这提示由整合素和生长因子调节的细胞反应是一 个协作的生化反应27。 整合素 3在肿瘤血管生成中的作用，现在已经有了一个比较系统的研究结 果28。在静息期血管内皮细胞有 3的低水平表达，在生长因子和细胞因子的刺 激下，表达量上升。3的配基都含有一个识别序列 Arg-Gly-Asp(RGD)。研究表 明29，bFGF 能刺激内皮细胞表达 2 类基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-2， MMP-2)，MMP-2 能够降解血管周围 ECM 中的胶原蛋白，使胶原蛋白的三螺旋结 构暴露出隐藏着的 RGD 位点，3与该位点结合引导内皮细胞向血管外基质的迁 移。设想通过一种物质(如单克隆抗体或短肽)封闭 3胞外羧基端的 RGD 识别位 点，使之不能与 ECM 结合，是否就可以抑制内皮细胞的迁移？回答是可能的。研 究表明30,31，用荷人乳腺癌联合免疫缺陷小鼠模型，通过静脉注射抗 3的抗体 LM609，与阴性对照相比，不仅肿瘤体积大大缩小，而且血管生成也大为减少； 鸡胚尿囊膜实验显示 LM609 能够诱导新生血管内皮细胞的凋亡，而对已经生成的 血管内皮细胞不起作用。经过人源化改造的 LM609，即 Vitaxin，已经进入临床 II 期32。在临床 I 期实验中，按照 4mg/kg 的药剂量，给 14 个肿瘤患者通过静脉给 药的方式注射 Vitaxin，结果有 8 个患者的肿瘤发生明显的退化，而给药时间超过 22 个月也没有发现有任何不良反应。 这也就提出了一个问题，即整合素的 和 两个亚基在血管生成中各自的作 用如何？基因敲除小鼠模型实验发现，亚基基因敲除的对小鼠的发育是致命的， 很多脏器都发生了出血现象33；而敲除 3亚基或者 5亚基，则小鼠的血管还是能 够正常的发育34,35。 这提示了 亚基在血管生成过程中可能起了较为直接的作用。 3 展望 由于抑制肿瘤血管疗法的诱人成效，国际上很多大公司在相关药物研制方面 投入了大量的人力物力。现在在开发的抑制肿瘤血管生成药物主要是一些小分子 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 6 - 拮抗剂和抗体。表 1 列举了一些处于临床前实验阶段和已经进入临床的抑制血管 生成药物36，其中很多是用于肿瘤治疗目的的。 表 1 部分正在开发研制的抑制血管生成药物（截至 2000 年） Table 1 several under-development drugs of anti-angiogenesis (expired 2000) 药物 靶标 研制阶段 公司 PD0174073 bFGFR 临床前 Parke-Davis SU5416 VEGFR 3 期临床 Sugen SU6668 VEGFR/bFGFR 1 期临床 Sugen ZD4190 VEGFR 临床前 Zeneca PTK787 VEGFR 1 期临床 Novartis Anti-VEGF mAb VEGF 3 期临床 Genentech Anti-KDR mAb VEGFR 临床前 Imclone AG3340 MMP 3 期临床 Agouron Marimastat MMP 3 期临床 British Biotech Bay 12-9566 MMP 3 期临床 Bayer Neovastat MMP 3 期临床 Aeterna BMS 275291 MMP 临床前 BMS CGS 27023A MMP 二期临床 Novartis D1927 MMP 1 期临床 Chiroscience D2163 MMP 1 期临床 Chiroscience Vitaxin Integrin 2 期临床 IXSYS S-137 Integrin 临床前 Searie S-836 Integrin 临床前 Searie SM256 Integrin 临床前 Dupont SG545 Integrin 临床前 Dupont Angiostatin ATP synthase 临床前 EntreMed Endostatin EC 临床前 EntreMed CM-101 EC 2 期临床 CarboMed U-955 EC 临床前 Gwo-Chyang GMP bFGF:碱性成纤维生长因子，VEGF(R):血管内皮细胞生长因子（受体） ，MMP:金属蛋白酶， Integrin:整合素，ATP synthase:三磷酸腺苷合成酶，EC:内皮细胞。 抗体治疗在抑制肿瘤血管生成疗法中占有很大的比重。抗体一般是作为配体/ 东北大学硕士学位论文 第一章 文献综述 - 7 - 受体结合反应的拮抗剂介入肿瘤的治疗，而抗体结合靶细胞后引起的补体作用也 会对细胞产生毒作用，从而杀伤靶细胞。在抗体的非结合区域偶联细胞毒素、化 疗试剂、放射性同位素等杀伤细胞的药物，然后让抗体引导药物去杀伤靶细胞， 可以获得很高的杀伤特异性，因此也被称为“魔弹” ，较之一般的化疗和放疗手段， 只要用上少量的试剂就可以产生很好的效果，而且不会对非靶位点的细胞产生毒 副作用。 抗体治疗现在碰到的问题是：鼠源性的单克隆抗体在人体中会产生人抗鼠抗 体反应；抗体片段过大，体内不稳定；抗体产量低，制备昂贵。解决途径是通过 鼠源性抗体的人源化改造，制备人鼠嵌合单克隆抗体，或者用噬菌体展示技术制 备完全人源化的单克隆抗体；只保留抗体的结合片段和效应片段，运用基因工程 技术制备小分子量的基因工程抗体，同时提高抗体亲和力；寻找抗体高表达的系 统，或运用转基因技术让哺乳动物分泌得到人源化的抗体。 相信在不久的将来会有越来越多的抗肿瘤血管生成的药物投放到市场中，最 终攻克癌症的日子不会太遥远。 东北大学硕士学位论文 第二章 前言 8 第二章第二章 前言前言 1 立题依据 本实验室用肝癌细胞培养上清刺激人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)免疫小鼠， 得到一株单克隆抗体 AA98。 经过十几种上百 例的肿瘤组织和正常组织冰冻切片免疫组化检测， AA98 特异性地结合肿瘤新生血 管而不与许多正常组织血管结合；荷人肿瘤裸鼠实验结果表明，和对照组相比， 抗体 AA98 能够明显抑制肿瘤生长； 取下肿瘤进行切片镜下观察， 发现 AA98 组单 位面积内肿瘤微血管数明显低于对照组；鸡胚尿囊膜实验(chicken chorioallantoic membrane assays, CAMAs)也证实单抗 AA98 具有抑制血管生成的作用。从以上结 果来看，AA98 具有发展成为一种抗肿瘤血管生成的新型单克隆抗体的巨大潜力。 前期实验结果表明，单抗 AA98 靶分子是一种新型粘附分子，属于免疫球蛋 白超家族(immunoglobulin superfamily, IGSF)，氨基酸测序结果显示该靶分子的蛋 白质序列与一种表达在人黑色素瘤细胞上的粘附分子极为相似。目前对于这种粘 附分子的结构与功能了解的很少，与其相互作用的配基至今未知37。 本论文是在上述工作基础上, 从基因和蛋白水平集中研究 AA98 靶分子在肝 癌以及癌旁肝组织表达情况，探索 AA98 靶分子在肿瘤血管中高表达的机理。 2 实验设计 2.1 肝癌及癌旁肝组织的免疫组化 选取新鲜的肝癌组织，做冰冻切片的免疫组织化学，观察 AA98 靶分子在肝 癌组织中的分布。因为根据以往经验，AA98 主要和肿瘤的血管结合，所以应该设 立一个阳性对照，对血管进行标记，以判断 AA98 结合区域是否是肝癌的血管。 决定使用小鼠抗人 CD31 作为 AA98 的阳性对照。CD31 是血管内皮细胞的标志分 子。另外在实验中设立阴性对照，以 PBS 代替一抗加入。 2.2 肝癌及癌旁肝组织的原位杂交 原位杂交方法常用于检测细胞中目的基因的转录情况。以目的基因的一段反 义 DNA(antisense DNA)序列或者是由目的基因 DNA 片段正义链在体外转录获得 东北大学硕士学位论文 第二章 前言 9 反转录生成cDNA 以cDNA为模板PCR扩增目的片段 目的片段和T载体连接 转化 挑选单克隆菌株， 判断目的片段插入方向 质粒酶切，目的片段体外转录和标记 从肝癌组织中提取Total RNA 新鲜肝癌4%PFA, 4 oC固定过夜 脱水至蜡后包埋 行8m切片 42 oC烘烤过夜 原位杂交 的反义 RNA(antisense RNA)为探针，根据碱基互补配对的原理，和组织细胞内目 的基因反义链转录的 mRNA 进行杂交，探针上带有可检测的标记物，如地高辛 (Digoxigenin)、生物素(Biotin)等，所以可以根据标记物信号的强弱，来判断目的基 因的转录量。 因为从氨基酸序列比对知道 AA98 的靶分子与人黑色素瘤上表达的一类粘附 分子具有很高的同源性， 我们从 Genebank 中直接可以找到这种粘附分子的 mRNA 序列，并以此设计引物，从新鲜肝癌组织中扩增出 AA98 靶分子的基因序列片段， 然后按照常规的探针制备方法获得用地高辛标记的反义 RNA 探针。地高辛是一类 植物表达的小分子化合物，因为表达地高辛的生物少，所以用它作标记物不会引 起和组织内其他化合物的交叉反应。之所以用反义 RNA 作为探针是因为 RNA/RNA 的杂交具有比 DNA/RNA 更高的亲和性。 具体的实验步骤设计如图 1 所 示： 图 1 肝癌及癌旁肝组织的原位杂交实验步骤 Fig.1 procedure of in situ hybridization of HCC and peri-cancer tissue 东北大学硕士学位论文 第二章 前言 10 3 课题的意义 目前在国内只有很少的几个课题组在进行肿瘤治疗性单克隆抗体的研究，获 得成功的例子也很少，只有第二军医大等单位的少数几株肿瘤治疗性抗体正在进 行临床或临床前实验。这与国际上正在兴起的第二次单克隆抗体研究热潮很不协 调，一冷一热，凸显出我国在这一科研领域力量的薄弱。为了在肿瘤治疗性抗体 研制中有一些自己的知识产权的产品和技术，而不必完全依赖于国外，我们所做 的工作就显得十分有意义。为了研究 AA98 这株肿瘤血管相关性单克隆抗体在肿瘤 治疗方面的作用，我们得到了国家 863 项目和中科院重大项目资金的支持。 我