miRNA-329调控血管内皮受体CD146的分子机制及其功能

密级密级: 博士学位论文博士学位论文 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 作者姓名： 王平 作者姓名： 王平 指导教师： 阎锡蕴 研究员 指导教师： 阎锡蕴 研究员 中国科学院大学生物物理研究所 中国科学院大学生物物理研究所 学位类别： 理学博士 学位类别： 理学博士 学科专业： 细胞生物学 学科专业： 细胞生物学 研究所：研究所： 生物物理研究所 生物物理研究所 二零一三二零一三 年年 十十 月月 microRNA329 suppresses angiogenesis by targeting CD146 By Ping Wang A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell Biology Institute of Biophysics, University of Chinese Academy of Sciences October, 2013 致谢 I 致致 谢谢 本论文是在阎锡蕴研究员的悉心指导下完成的。五年来，阎老师严谨的治学 态度及忘我的敬业精神令我钦佩！感谢阎老师在学习上给予我的细心指导，我所 取得的每一个进步无不参透着她的心血和智慧。 更要感谢阎老师在生活中给予我 的关怀，每当我遇到困难时，是她的开导和鼓励帮助我度过一个个难关。此外， 阎老师的“三自经” ： “自强、自信、自在”让我领悟到许多人生道理，使我终生 受益。 衷心感谢我的爸爸妈妈这二十多年来的养育之恩，他们用无私的爱一直支持 鼓励着我，成为我不断进步的源泉。我将尽我最大的努力回报他们对我的培养。 特别感谢我的爱人李冉，感谢你的一路陪伴和悉心照顾，在我失意时给我安慰， 在我得意时给我告诫，没有你也就没有我今天的成绩。 特别感谢实验室与我朝夕相处的每位成员。感谢王师傅辛勤的劳动，没有您 每天的辛苦劳动就没有我们今天的成果；感谢冯静、杨东玲、宋丽娜老师对我们 默默的支持，为我们的实验提供了坚实的基础；感谢卢迪、王志龙、董碧宇老师 为我们提供的技术支持；感谢段德民、张德玺、叶中德、梁敏敏、王兆卿老师对 我科研上的指导；感谢张莹、安云鹤、段红霞、曾启群，张锦彬、穆彬、郑超固、 罗永挺、 邢澍等师兄师姐给予我的帮助和指导。 还要感谢张令令， 姜天霞、 王飞、 范克龙、凃滔、高倩、刘丹、晏荟文、吴真真、张健林、陈佳楠等的帮助与配合， 以及你们带来的欢乐时光。 此外，感谢秦志海老师和 Zene Matsuda 教授；感谢卜鹏程师兄、Irene Gramaglia 和 Torsten Juelich 对我实验的指导和文章的修改。 感谢李振亚和刘开力 师兄对我实验上的帮助。感谢研究生处的刘勤瑞、许琰琰、熊勤、回佳菡老师对 我的指导。感谢党委办公室翟涛、姜兆林老师在党支部工作中给予我的指导。感 谢苗君叶、王璐、关小涛这 5 年来的陪伴，感谢我的朋友们，正是你们关爱与帮 助，让我在沮丧的时候感到温暖，帮我走过了人生的低谷。 最后感谢所有陪伴我走过的老师、同学、亲人和朋友，祝愿你们一生平安、 幸福快乐！ 王平 2013 年 9 月 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 II 摘摘 要要 我们实验室的前期研究发现细胞粘附分子 CD146 是新生血管的标志分子 （Blood 2003），随后又发现 CD146 是血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）的 共受体，在血管生成中发挥重要作用（Blood 2012）。然而，CD146 的表达调控 机制及其分子功能还不是很清楚。 本文是在上述工作的基础上，研究了血管内皮 CD146 的表达调控及其如何 促进血管新生的分子机理。我们以氧诱导的视网膜病变（oxygen-induced retinopathy，OIR）作为研究血管生成的疾病模型，结合生物信息学、细胞及分 子生物学等多种实验方法， 深入探讨了 miRNA 对 CD146 的表达及其介导血管生 成的调控作用。 本文主要有以下三点重要发现： （1）发现 CD146 在 OIR 小鼠视网膜的血管 内皮细胞上过度表达，并促进 OIR 疾病的发生发展。无论是 CD146 血管内皮特 异性敲除，还是 CD146 抗体均能显著抑制视网膜血管新生、迂曲和渗漏，提示 CD146 可能作为新生血管性眼部疾病的标志物。 （2）发现血管内皮 CD146 的表 达受一个新的血管生成相关 miRNA（miR-329）的转录后调控，揭示了 miR-329 通过直接靶向 CD146 的 3端非编码区而抑制其表达，在 CD146/VEGFR-2 促进 血管新生的过程中起着非常重要的调节作用。在 VEGF 和 TNF-等促血管生成 因子的刺激下， 血管内皮细胞中 NF-B 信号通路的活化抑制了 miR-329 的表达， 从而解除了 miR-329 对 CD146 表达的抑制作用，使 CD146 的表达上调。CD146 作为VEGFR-2的共受体， 它的上调又进一步促进了VEGF诱导的SKF/p38/NF-B 信号通路，并激活了 IL-8、ICAM-1、VEGF、MMP-9 等下游促血管生成基因的 表达，进而促进血管生成。 （3）发现 miR-329 不仅是调节 CD146 的关键因子， 而且有可能成为一种新的治疗试剂， 用于眼底血管性疾病的治疗。 动物实验表明， 在 OIR 小鼠的玻璃体腔内注射 miR-329，能够抑制血管内皮 CD146 的过度表达 并显著减轻了视网膜血管新生及疾病的严重程度。 上述研究结果，不仅揭示了 CD146 在血管生成中的表达调控机制，而且还 为靶向 CD146 治疗眼底血管新生等血管相关性疾病提供了新的思路和方法，为 多靶点联合治疗提供了理论依据。 关键词：CD146，microRNA-329，抗体 AA98，血管生成，新生血管性视网膜病 变 Abstract III ABSTRACT Ping Wang (Cell Biology) Directed by Xiyun Yan Our previous studies have shown that cell adhesion molecule CD146 is a biomarker of angiogenesis (Blood 2003). Thereafter, we found that CD146 is a co-receptor for vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) (Blood 2013) and plays a crucial role in angiogenesis. However, the function and regulatory mechanisms of CD146 during angiogenesis remain unclear. On the basis of above-mentioned work, our work is focused on the regulatory mechanisms of endothelial CD146. By using oxygen-induced retinopathy (OIR) as a model of pathological angiogenesis, combining with a series of bioinformatics and biochemical methods, we revealed important roles of miRNAs on the expression and function of endothelial CD146. Three important findings in this study: (1) CD146 was excessively expressed during retinal neovascularization and promoted the progression of OIR disease. Either CD146 conditional endothelial knockout or antibody AA98 targeting CD146 could inhibit the retinal neovascularization and augment the number of tortuous and dilated vessels in OIR mice， suggesting that CD146 is a biomarker of angiogenesis-associated ocular diseases. (2) We found that the expression of endothelial CD146 is regulated by a novel angiogenesis-associated miRNA, miR-329. miR-329 plays an important role in CD146/VEGFR-2-mediated angiogenesis. Under the stimulation of VEGF and tumor necrosis factor-alpha (TNF-), activated NF-B signaling down-regulated the expression of miR-329, resulting in the elevation of CD146 in endothelial cells. As a co-receptor for VEGFR-2, the upregulation of CD146 facilitated an endothelial response to VEGF-induced SRC kinase family (SKF)/p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)/NF-B activation, and subsequently resulting in the promotion of angiogenesis. (3) miR-329 presents as not only an important regulator of CD146, but also a potential therapeutic tool for the treatment of retinal neovascularization. Our animal experiments showed that treatment with miR-329 repressed the excessive CD146 expression on blood vessels and significantly attenuated the neovascularization in OIR mice. miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 IV Our findings not only reveal the regulatory mechanisms of CD146 in angiogenesis, but also provide a novel therapeutic route for targeting CD146 to treat retinal neovascularization as well as other angiogeneic diseases. Keywords: CD146, microRNA-329, anti-CD146 AA98, angiogenesis, retinal neovascularization 目录 V 目 录目 录 致 谢. I 摘 要 II ABSTRACT III 目 录V 文献综述 1 1. CD146 . 1 1.1 CD146 的结构 . 1 1.2 CD146 的表达与调控 . 1 1.2.1 CD146 在正常组织中的表达与调控 . 2 1.2.2 CD146 在肿瘤组织中的表达与调控 . 2 1.3 CD146 在血管生成中的作用 . 4 1.4 CD146 介导的信号通路 . 5 2. microRNA 与血管生成 . 7 2.1 miRNA 介绍 7 2.2 miRNA 在血管生成中的作用 10 2.2.1 miRNA 在血管发育中的功能 . 11 2.2.2 miRNA 与血管相关性疾病 . 11 2.2.3 miRNA 基因治疗 . 13 研究内容 15 概述 15 1. 材料与方法. 16 1.1 实验材料 16 1.2 实验方法. 17 2. 实验结果. 23 2.1 CD146 在 OIR 小鼠的视网膜血管中上调表达 . 23 2.2 CD146 内皮敲除能减轻 OIR 疾病的严重程度 . 24 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 VI 2.3 抗体靶向 CD146 可以预防及治疗 OIR 疾病 . 25 2.4 血管内皮 CD146 的表达受低氧环境的调控 . 27 2.5 内皮 CD146 的 3UTR 受促血管生成因子的调控 29 2.6 miR329 调控内皮 CD146 的表达 30 2.7 促血管生成因子通过下调 miR329 促进内皮 CD146 的表达 36 2.8 miR329 抑制 CD146 介导的下游信号通路的激活 . 39 2.9 miR329 抑制 CD146 介导的内皮细胞血管生成 . 42 2.10 miR329 基因治疗减轻 OIR 小鼠疾病的严重程度 . 44 3. 小结与讨论. 47 参考文献 52 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 69 文献综述 1 文献综述文献综述 1. CD146 1.1 CD146 的结构的结构 细胞粘附分子 CD146 最初是用抗人黑色素瘤细胞的抗体从人黑色素瘤 cDNA 文库中筛选克隆得到的1。随后，研究者又根据 CD146 的序列与功能， 将其命名为 MUC18、 A32 抗原、 S-Endo-1、 Mel-CAM （melanoma CAM） 、 MCAM （melanoma CAM） 、MET-CAM（metastasis CAM）和 HEMCAM（hemopoietic CAM）2-4。CD146 是由 646 个氨基酸组成的 I 型膜蛋白，属于免疫球蛋白超 家族 （IgSF） 成员5。 其胞外区由 V-V-C-C-C 的 Ig-like domain 组成6 （图 1-1A） ， 并且每一个 Ig-like domain 中均含有两个半胱氨酸位点。根据结构预测，这对半 胱氨酸可以形成二硫键。另外，CD146 胞外区的 Ig-like domain 在多个配体与受 体相互作用的研究中被广泛报道，提示 CD146 可以和其他细胞粘附分子或细胞 外基质结合。CD146 的胞内区较短，由 63 个氨基酸组成，有多个可能的蛋白激 酶识别位点以及与其他蛋白相互作用的元件，提示 CD146 参与细胞信号传导过 程7。 图 1-1. CD146 的编码区及启动子区。 （A）CD146 的编码区及相应蛋白结构。方形，外显子； 直线，内含子；SP，信号肽；V，可变区 Ig-like domain；C-2，恒定区 Ig-like domain；TM， 跨膜区；CYT，胞内区。 （B）CD146 启动子区的转录调节元件。图中数字标注的是 AP-2、 c-myb、Sp1 和 CREB 结合 CD146 启动子区位点的 5端位置。 （引自文献8，并得到许可） 1.2 CD146 的表达与调控的表达与调控 CD146 在不同的组织中的表达是受严格控制的。研究人员发现 CD146 在胚 胎组织的发育过程中表达并介导细胞的迁移9，在正常成熟组织中的表达则相 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 2 对较少。然而，在肿瘤组织中，CD146 的表达显著上调并促进肿瘤血管新生及 疾病的发生发展8。由此可见，CD146 在不同生长发育阶段及不同组织中的表 达调控对于其发挥生物学功能起到关键作用。因此， CD146 的表达调控机制引 起了众多研究者的关注，成为近年来 CD146 领域的研究热点之一。然而，科研 人员对 CD146 表达调控机制的研究还不是很透彻。目前，只有少数研究报道了 CD146 在成人组织和肿瘤组织受细胞外因子及转录因子的调控，其是否在转录 后水平受调空尚不清楚。在胚胎发育、生理和病理血管生成等 CD146 发挥重要 功能的组织中，其具体调控机制更是研究的空白。 1.2.1 CD146 在正常组织中的表达与调控在正常组织中的表达与调控 在胚胎发育阶段， CD146 被报道在黄素化颗粒细胞和中间滋养层细胞中表 达并促进细胞的迁移。在黄体成熟期，肿瘤坏死因子（TNF-）及白细胞介素 1 （IL-1）等细胞因子能够刺激黄素化颗粒细胞表达 CD146 并促进黄体成熟阶段 的血管发育10。 我们实验前期研究发现 CD146 在植入位点的中间滋养层细胞中 表达，并在胚胎着床及滋养层细胞浸润的过程中起到重要作用9,11。目前， CD146 在血管发育过程中的具体表达调控机制尚不清楚。 与胚胎组织中相比，CD146 在成人组织中的表达则相对较弱，并且只局限 在几种组织中，如乳腺上皮细胞、毛囊的外部基壳和激活的 T 细胞等部位12。 近年来，我们实验室和其他实验室的研究都表明 CD146 是血管内皮细胞的标志 分子，在毛细血管，淋巴血管、动脉和静脉等不同血管组织中均有表达13,14。 另外，CD146 还是内皮祖细胞和间质干细胞的标志分子15。 目前，CD146 在正常组织中的表达调控机制还不是很清楚。有文章报道在 接受促炎症因子、生长因子或渗透压变化等多种外界信号后 CD146 可以被诱导 表达并对其在正常成年人组织中行使功能起到重要作用16。细胞生长因子如内 皮素（ET-1） 、转化生长因子（TGF-）和神经生长因子（NGF） ，促炎症因子如 T 辅助 2 细胞（Th2）因子 IL-13 能够分别在黑色素细胞17、肝细胞18、施旺 细胞19和气管上皮细胞20中上调 CD146 mRNA 的表达。 细胞外环境中的高渗 透压、高葡萄糖浓度21、高钙离子浓度22和高 cAMP 水平23都可以诱导 CD146 mRNA 的表达。正常组织 CD146 受外界信号的调节而诱导表达，对细胞 的粘附、增殖及细胞通讯等功能都起着重要作用。 1.2.2 CD146 在肿瘤组织中的表达与调控在肿瘤组织中的表达与调控 CD146 最早是作为黑色素瘤的标志物被发现，因为其在黑痣等良性组织中 不表达或低表达，但在恶性程度高的原位黑色素瘤及转移瘤组织中高表达 1,6,24。1998 年，研究人员利用 CD146 的单克隆抗体 MN-4 发现 CD146 在多 文献综述 3 种肿瘤中均上调表达，如血管肉瘤、Kaposis 肉瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌、前列 腺癌、肺小细胞肺癌、卵巢癌、胎盘滋养层细胞瘤和绒毛膜癌等25,12。紧接着 有大量报道发现 CD146 的高表达能够促进肿瘤的发展和转移24,26（表 1-1） 。 我们实验室最新的研究也发现CD146在505例乳腺癌病人的临床标本中高表达， 并与乳腺癌分级高、预后差及三阴性的表型成正相关27。 表 1-1 表 1-1 CD146 在肿瘤组织中的上调表达及其与预后的关系 肿瘤类型 在肿瘤组织中的上调表达及其与预后的关系 肿瘤类型 CD146 与疾病发展的关系与疾病发展的关系 参考文献参考文献 黑色素瘤 转移和血管生成的增加 28-30 肾细胞癌 复发率的增加 31 胃癌 EMT 的增加，预后不好 32 肺腺癌 生存率的降低 33 胆囊腺癌 进展、侵袭、转移的增加 34 恶性胸膜间皮瘤 预后不好 35 腺样囊性癌 癌症发展 36 乳腺肿瘤 迁移、侵略性、EMT 的增加 37-39 婴幼儿血管瘤 肿瘤发展 40 非小细胞肺癌 生存率降低 41 腮腺癌 进展和侵袭增加 42 前列腺癌 转移增强 43-45 周围神经肿瘤 恶性转化增强 46 血液系统恶性肿瘤 肿瘤发生的增加 47 鸡输卵管腺癌 转移增强 48 研究人员发现 CD146 在肿瘤组织中的表达上调并不是由于 CD146 基因的易 位、扩增或突变造成的49,16，而是由于其启动子区受到转录因子或超甲基化修 饰的调控。1993 年，CD146 的启动子被克隆。研究人员分析发现其启动子上有 多个转录因子的结合位点，如 Sp1、CRE、AP-2、c-Myb 及 cAMP 效应原件等6 （图 1-1B） 。 后续研究发现在黑色素瘤细胞中， 内皮缩血管肽 （endothelin-1， ET-1） 可以激活腺苷酸单磷酸反应元件（CREB） ，进而诱导 CD146 的转录17。然而， 激活蛋白 2（AP-2）则抑制 CD146 的转录50,51。另外，二萜衍生物 Forskolin 可以增加细胞内 cAMP 的水平从而上调 CD146 的表达23。最近，Liu 等人发现 在前列腺癌中，CD146 的表达上调是由于其启动子区发生了超甲基化修饰。并 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 4 且，CD146 启动子的甲基化比例与前列腺癌的分期呈正相关52。由于 CD146 的启动子区为高 GC 含量区6，CD146 的这种修饰调控机制可能也存在于其他 肿瘤中。以上结果表明 CD146 的启动子区在其转录水平受到调控进而导致其在 肿瘤组织中的表达上调，但 CD146 在转录后水平的调节机制仍然不是很清楚。 另外，大量报道表明 CD146 也在肿瘤、炎性肠病53、慢性肾衰竭54和类 风湿性关节炎55等疾病的内皮细胞中过度表达并与疾病的发展密切相关。我们 实验室的研究发现 TNF-和 IL1-等促炎症因子能够促进血管内皮细胞 CD146 的表达上调，并且其表达水平与炎性肠病的发展呈正相关。然而，CD146 在病 理血管生成中高表达的机制及其表达量的变化又如何进一步促进疾病发展的具 体机理并不清楚。 1.3 CD146 在血管生成中的作用在血管生成中的作用 血管生成（angiogenesis）是指从已形成的血管中芽生出新的血管的过程。现 代术语中血管生成又细分为血管发生（vasculogenesis） ，血管生成（angiogenesis） 和动脉生成（arteriogenesis）56。生理性的血管生成在发育、伤口愈合和生殖 系统中起重要作用，是受严格控制的。然而，病理性的血管生成则导致多种疾病 如肿瘤、炎症性疾病（风湿性关节炎、多发性硬化、大肠炎等）和新生血管性眼 底疾病（早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变等）57-59。 越来越多的研究表明 CD146 在血管生成中发挥重要作用。为了探索 CD146 的功能，不同的实验室开发了靶向 CD146 的抗体，包括 S-endo 160、MUC18、 P1H1261、我们实验室自主研发的一系列抗体 AA1-AA762及 AA9814等。有 意思的是，不同的 CD146 抗体对各类血管组织的识别呈现不同的模式。抗体 S-endo 1 可以结合包括静脉、微静脉、动脉、微动脉、毛细血管和淋巴血管等不 同类型的血管内皮组织；而 MUC18 只能识别毛细血管和高内皮微静脉；抗体 P1H12 和 AA1 能够结合正常组织和肿瘤组织中的微血管，而 AA98 则只结合肿 瘤组织中处于活跃状态的新生血管，不能结合正常组织中成熟的血管。这个现象 是由于不同抗体识别的抗原表位不同引起的。特别地，AA98 和 S-endo 1 能够识 别基于二硫键的 CD146 天然构象表位63， 而抗体 P1H12 和 AA1 则识别 CD146 位于 N 端结构域的线性表位。这一现象也预示着 CD146 在不同内皮组织中存在 不同的构象，并调控不同的生理功能。 最初，研究人员利用斑马鱼作为发育的研究模型，发现 CD146 是血管内皮 细胞的标志分子。CD146 在斑马鱼胚胎发育过程中的血管中高表达，并促进血 管生成64。一方面，CD146 基因的敲除能够显著抑制斑马鱼肌节间血管的发育 65。另一方面，斑马鱼中 CD146 的过表达能够促进血管萌芽及血管生成64。 这一结果揭示了 CD146 在血管发育中的重要功能。 文献综述 5 CD146 的另一个重要角色是肿瘤血管生成的标志分子。2003 年，我们实验 室首次报道 CD146 是肿瘤血管生成的新靶标，并且抗体 AA98 能够抑制肿瘤血 管生成，进而抑制多种肿瘤的生长14。这一发现被作为封面文章发表在 Blood 上，并被 Faculty of 1000 评为新发现。我们进一步用内皮细胞血管生成实验、划 痕实验和迁移实验等证明了 CD146 在血管生成中过的重要性66。抗体 AA98 靶向 CD146 或 CD146 的 siRNA 抑制其表达， 均可以抑制肿瘤条件培养基刺激下 的内皮细胞血管生成14,63。随后，我们实验室又在 CD146 介导的血管新生机 制上取得重大进展，发现 CD146 作为 VEGFR-2 的共受体，促进血管内皮细胞中 VEGF 介导的下游信号传导，并在肿瘤血管生成中起重要作用。抗 CD146 抗体 AA98 与抗 VEGF 抗体贝伐单抗联合治疗胰腺癌具有协同作用67。以上结果都 表明，CD146 是肿瘤血管生成的标志分子，并可以作为肿瘤血管的有效治疗靶 点。 近年来，还有一些研究表明 CD146 能够促进血管生成进而促进炎症性疾病 的发展。Neidhart 等人在多种关节炎如风湿性关节炎病人的关节滑膜液中发现 CD146 的表达，并且其表达水平与血管生成呈正相关55。另外，CD146 被发现 在大肠炎病人的肠道血管中上调表达53,68。另有报道 CD146 与 II 型糖尿病并 发症引起的慢性血管炎有关69。 这些研究提示我们 CD146 参与炎症过程中的血 管生成并促进疾病的发展，虽然其机制并不清楚。 此外，CD146 也被认为是内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs） 及循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CECs）的标志物，以另一种形式 参与血管生成70。在有内皮损伤的疾病中，如心血管疾病、炎症、肾病综合症 和癌症等， CEC 的数量明显增多。 抗 CD146 的抗体被用于分离 CEC 并可能用于 多种血管生成相关疾病的诊断，如急性冠状动脉综合症71、镰状细胞血症61 和婴儿血管瘤40等。 上述研究结果表明 CD146 是血管内皮的标志分子，并在血管发育及病理性 血管生成中都发挥重要的作用。然而，CD146 分子在新生血管中上调表达的原 因及其促进血管生成的机制仍然不是很清楚。 1.4 CD146 介导的信号通路介导的信号通路 对于 CD146 介导信号通路的研究主要集中在两种细胞类型，即内皮细胞和 肿瘤细胞。对于内皮细胞，由于 CD146 的配体一直未找到，研究人员利用特异 性抗体作为工具来研究 CD146 在内皮细胞中参与的信号传导 （图 1-2A） 。 Anfosso 等人发现抗体 S-endo1 交联 CD146 分子能够引起 Src 蛋白激酶家族中 Fyn 的磷 酸化。磷酸化的 Fyn 传递磷酸基团给下游的激酶 PLC-，进一步引起钙离子的内 流72,73。激活的 p130、Pyk2、paxillin 和 FAK 对细胞骨架重排、细胞形态维持 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 6 和迁移能力等起作用。 另外， 单克隆抗体 P1H12 和 CD146 作用可以引起 FAK 的 磷酸化及 NF-B 的核转移，进而增加血管内皮的通透性61。因此，CD146 介 导的此类信号通路部分解释了 CD146 促进正常细胞运动，促进肿瘤细胞侵袭的 原因。 图 1-2. CD146 介导的信号通路。（A） 在人内皮细胞中， CD146 可以引起酪氨酸蛋白激酶 FAK 的磷酸化。 （B）在人黑色素瘤细胞中，CD146 与 AKT 的相互调控。 （C）CD146 调节 Id-1 的表达。 （D）CD146 通过 p38 的活化来激活 NF- B 转录因子以及其参与 VEGF 下游的信 号传导。 （引自文献8，并得到许可） 我们实验室的工作发现，无论是 CD146 的功能性抗体 AA98 还是特异性抑 制CD146表达的siRNA均可以阻断肝癌细胞SMMC7721培养上清诱导的NF-B 信号通路的活化进而抑制内皮细胞的迁移和血管生成63,13。 我们用荧光共振能 文献综述 7 量转移技术（FRET）发现 CD146 介导的信号通路主要是通过细胞表面 CD146-CD146 的二聚化引起的74。 进一步研究表明肿瘤分泌物中重要的促血管 生成因子 VEGF 可以诱导 CD146 的二聚化，进而活化 NF-B 信号通路，最终促 进血管生成。并且，CD146 的 C452 半胱氨酸位点对于其二聚化的形成起关键作 用75。我们最新的研究表明 CD146 作为 VEGFR-2 的共受体，促进 VEGF 介导 的 AKT/p38 MAPKs/NF-B 信号通路的活化（图 1-2D） 。CD146 的 siRNA 或抗 体 AA98 均可以阻断 VEGF 介导的信号传导67。这些研究表明 CD146 不仅仅 是一个细胞粘附分子，也作为内皮细胞表面的受体传导信号并发挥着重要的功 能。 对于 CD146 在肿瘤细胞中介导信号通路的研究，目前主要集中在黑色素瘤 细胞中。在黑色素瘤中，CD146 的表达上调激活了内源性 PI3K/AKT 信号通路， 而此通路的活化又能进一步促进 CD146 的过度表达。CD146/PI3K/AKT 形成的 这个正反馈信号通路有助于阐释 CD146 抑制黑色素瘤细胞凋亡而促进肿瘤细胞 增值和存活的原因76（图 1-2B） 。另外，CD146 介导的信号通路可以下调原癌 基因 Id-1 的转录抑制因子 ATF-3 的表达进而上调 Id-1 的表达，最终促进黑色素 瘤的远端转移77（图 1-2C） 。 我们实验室的研究发现在黑色素瘤细胞中，CD146 通过与膜突蛋白 Ezrin-Radixin-Moesin（ERM）的结合与细胞骨架连接，促进微绒毛形成及向外 伸展。CD146-ERM 形成的复合物通过招募小 G 蛋白的抑制分子 Rho-GDI 释放 并活化 RhoA，而 Rho-PI4P5K 通路的激活又进一步增强了 CD146 与 ERM 的结 合，最终促进黑素瘤细胞的迁移78。最近，我们实验室还发现 CD146 促进肿瘤 细胞的上皮向间质转化（EMT） 。在乳腺癌细胞中，CD146 的过表达能够上调转 录因子 Slug 的表达，进而诱导肿瘤 EMT 的相关基因的表达，最终促进肿瘤的 EMT27（图 1-2D） 。这些实验结果为 CD146 分子促进肿瘤的转移提供了全新的 机制。 2. microRNA 与血管生成 与血管生成 2.1 miRNA 介绍介绍 经典的中心法则指出，核糖核酸（RNA）是传递遗传信息的使者。越来越 多的研究表明 RNA 在生命过程中扮演着更为多样而重要的角色。microRNA （miRNA） 是一类长度约为 2224 个核苷酸 （nt） 的单链非编码小 RNA。 miRNA 在转录后水平调节基因的表达，它通过与靶基因的 3端非翻译区（3UTR）不完 全互补配对而介导基因 mRNA 的降解或抑制基因的翻译79。并且，miRNA 通 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 8 过调节多个靶基因的表达在动植物的生长、发育、生理、代谢、衰老和疾病诸多 方面都发挥着重要的作用。而 miRNA 的表达则受到内外因素的调控，具有组织 （空间）和时间的特异性。miRNA 的发现为基因的表达调控开辟了新的天地， 也使人们对非编码 RNA 的功能有了全新的认识。 1993 年，Lee 等人首次在秀丽线虫中发现能使个体发育延迟的 lin-4 基因不 编码任何蛋白质，而是产生具有茎环结构（stem-loop）的转录产物并最终被加工 为约 22 个核苷酸的 RNA 分子。lin-4 通过与 lin-4 mRNA 的 3UTR 结合而抑制 其表达80。然而此时这种非编码 RNA 的产生及调控机制尚不明确。时隔七年， Reinhart 等人又在线虫中发现了一个与 lin-4 结构和作用机制相似的非编码小 RNA， let-781。 这种后来被称为 miRNA 的分子与其他小 RNA 如 siRNAs （short interfering RNAs） 、 smRNA （small modulatory RNA） 、 scnRNAs （small scanRNAs） 、 tncRNAs（tiny non-conding RNAs）以及 rasiRNAs（repeat associated siRNAs）等 在序列长度、 生物合成、 作用机制和功能等多个方面有很大的关联和相似性82。 迄今为止， 研究人员利用分子克隆和生物信息学等方法已经在 193 种不同物 种中发现了 25000 多个 miRNA。其中，已经有超过 1000 个人类的 miRNA 被发 现（miRBase version 18，）83。miRNA 在基因组中的分布主 要位于蛋白编码基因或非编码基因的内含子中.并且，大约有 1/3 的人类 miRNA 以基因簇（cluser）的形式存在于基因组中。一个基因簇一般以一个初级转录本 的形式转录，因此其中包含的 miRNA 可能受到协调调控的作用84。然而，从 一个基因簇中转录出的 miRNA 往往其成熟体的表达水平却并不同， 提示 miRNA 在转录后水平也被调节。 经过多年的探索，研究人员阐释了内源 miRNA 的生成过程，有助于了解 miRNA 在细胞内的形成和调控机制（图 1-3） 。具体来说，基因组上的 miRNA 主要由 RNA 聚合酶（部分由 RNA 聚合酶）转录为 miRNA 的初级转录本 （ primary miRNA，pri-miRNA ）85。pri-miRNA 则被位于细胞核内的 Pasha/DGCR8 蛋白和 Drosha 酶切割成约 70 nt 大小的具有发夹结构的 miRNA 前 体（precursor miRNA，pre-miRNA） 。接下来，pre-miRNA 与 Exportin5 及辅助因 子 Ran-GTP 三者形成复合体，并被转运到细胞质中，从而实现 pre-miRNA 的成 熟过程。 RNA 聚合酶家族成员 Dicer 酶在其中扮演着重要的角色。 在细胞质中， Dicer 酶将 pre-miRNA 的两条臂剪切得到约 22nt 核苷酸长度的双链 RNA。 此时， 双链 miRNA 形成 miRNA:miRNA*的双螺旋结构， 并被解螺旋酶等解螺旋为单链 RNA 86。成熟的单链 miRNA 为双链中 5端相对不稳定的序列，而另一条链 （miRNA*）则被降解。 成熟的 miRNA 主要通过两种方式调控靶基因的表达。一种方式是 miRNA 文献综述 9 和靶基因 mRNA 的 3UTR 形成完全匹配， 使靶 mRNA 被降解。 这种类似于 RNA 干扰的基因沉默方式多见于植物中， 而在脊椎动物和病毒的 miRNA 中并不多见。 另一种方式是 miRNA 和靶 mRNA 形成不完全配对来抑制蛋白质的翻译87。这 是多细胞动物 miRNA 发挥功能的常见方式。与 RNA 干扰不同，miRNA 和靶基 因的配对不仅限于“一对一”，而是“一对多”、“多对一”和“多对多”等多种方式。 因此，在多细胞动物中形成复杂的调控网络既可以通过一个 miRNA 来经济地调 控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNA 的组合来精细调控某个基因的表 达。 图 1-3.microRNA 的产生与基因沉默机制。 （引自文献88，并得到许可） miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 10 2.2 miRNA 在血管生成中的作用在血管生成中的作用 近年来，大量的研究表明 miRNA 在血管生成中起到重要作用。调控血管生 成的 miRNA 被称作“angiomiR” （表 1-2） 。促血管生成的 miRNA 被称作 “pro-angiomiR” ，而抑制血管生成的 miRNA 被称作“anti-angiomiR” 。通常情况 下， pro-angiomiR 是通过靶向血管生成过程中的抑制因子而促进血管生成。 相反， anti-angiomiR 则通过靶向促血管生成的基因而发挥抑制血管生成的作用89。在 血管生成因子或微环境的刺激下，angiomiR 的表达水平发生变化，进而影响了 一个甚至多个靶基因的表达，最终影响血管生成、血管收缩、血管完整性、血压 和新生内膜损伤等血管系统各个方面的功能（图 1-4） 。 图 1-4.miRNA 在血管系统中的功能。 （引起文献90，并得到许可） 文献综述 11 表 1-2. 参与血管生成的 miRNA （引自文献91，并得到许可） 2.2.1 miRNA 在血管发育中的功能在血管发育中的功能 miRNA 在血管发育中的作用是通过将其产生过程中重要的酶分子 Dicer 酶 和 Drosha 酶敲除的方法发现的。这两种酶被敲除后（Dicer EC-KO） ，细胞内的 miRNA 前体将不能成功被加工成成熟的 miRNA。Dicer EC-KO小鼠表现为胚胎发 育期不能生成血管，在怀孕第 12.5 至 14.5 天死亡92。Poliseno 等人发现在内皮 细胞中抑制 Dicer 酶和 Drosha 酶的表达能够抑制多种血管生成相关 miRNA 的表 达，如内皮高表达的 miR-221/222、miR-21 和 let-7 家族83,93,94及内皮特异性 表达的 miR-126 等95,96， 进而抑制内皮细胞的血管生成能力94。 其中， miR-126 被认为是血管发育过程中必不可少的基因。 内皮细胞特异性敲除 miR-126 导致了 50%的小鼠胚胎致死，而存活下来的小鼠也表现为视网膜血管发育缺陷97,98。 在斑马鱼中敲除 miR-126 则导致胚胎发育过程中血管完整性的缺失和出血95。 由此可见，miRNA 在血管发育中起关键作用。 2.2.2 miRNA 与血管相关性疾病与血管相关性疾病 利用 Dicer 酶内皮细胞特异性敲除小鼠（Dicer EC-KO） ，研究人员首次在体内 直接证明了在病理条件下，内皮 miRNA 在血管生成中的重要性。Suarez 等人发 现在 VEGF 刺激、后肢缺血或伤口愈合等状态下，Dicer EC-KO小鼠均表现出明显 的血管生成的减少。并且，Dicer 酶内皮特异性敲除能够明显抑制肿瘤血管的数 miRNA-329 调控血管内皮受体 CD146 的分子机制及其功能 12 量进而抑制肿瘤生长，提示 miRNA 在肿瘤发展中的作用99。机制研究表明， Dicer 基因沉默使 miRNA 的生成受阻，可以直接或间接导致多种血管生成关键 基因表达量的变化，如 Tsp-1、TEK/Tie2、VEGFR-2、Tie1、eNOS 和 IL-8 等93， 进而影响内皮细胞的功能。例如：Dicer 内皮细胞敲除使 Let-7 和 miR-1792 等 miRNA 表达的下调，进而使它们共同的靶基因凝血酶致敏蛋白（Tsp-1）94和 结缔组织生长因子（CTGF）的表达上调100。Tsp-1 和 CTGF 作为血管生成抑 制因子，它们的上调能够抑制内皮细胞的增殖进而抑制血管生成。因此，Dicer 基因的沉默使 miRNA 的表达异常能够导致内皮细胞复杂蛋白信号网络的一系列 改变，最终导致内皮细胞萌芽和血管生成的减少，提示 miRNA 在血管生成中发 挥重要作用。 miRNA 在血管内皮中的表达是受严格控制的，具有组织特异性和时序性。 然而，研究人员发现在肿瘤、炎症和眼底血管新生等血管相关性疾病中，miRNA 的表达会发生异常，进而导致促/抑血管生成相关靶基因的变化，对血管生成及 疾病的发生发展都起到重要作用。因此，miRNA 的表达异常也将为疾病诊断提 供新的理论依据。研究发现，多种机制可以引起 miRNA 的表达异常，如基因扩 增、 缺失或突变； 表观遗传调控； 转录因子调控； Drosha、 Dicer 酶介导的 miRNA 可变剪切；靶基因结合位点的变化等101。但是，在内皮细胞中 miRNA 的具体 调节机制尚不清楚。 有文章报道内皮细胞 miRNA 受促/抑血管生成因子或低氧等 微环境的调控。 例如： 促血管生成关键因子 VEGF 可以诱导 HUVEC 中 miR-191、 miR-31、miR-17-5p 和 miR-20a 等的表达，并具有时序性99；低氧微环境可以 诱导 miRNA 如 miR-210 和 miR-424 等的表达，进而促进血管生成102,103。另 外，只有几个 miRNA 被报道受抑血管生成因素的调控，如活性氧可以上调 miR-200c 的表达而抑制 ZEB1 的表达，进而促进内皮细胞的凋亡104。总的来 说，目前只有少数血管生成相关 miRNA 的调控机制被揭示。并且，大多数文章 报道的 miRNA 是在病理条件下被诱导表达，并且发挥促进血管生成的作用。然 而，研究人员对于哪些 miRNA 在血管相关性疾病中表达下调并对血管生成起关