肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究

博士学位论文博士学位论文 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 作者姓名：作者姓名： 董董 兵兵 指导教师指导教师: 朱毅敏朱毅敏 研究员研究员 中科院苏州纳米所中科院苏州纳米所 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中科院生物物理所中科院生物物理所 学位类别学位类别: 理理 学学 博博 士士 学科专业学科专业: 生物物理学生物物理学 培养单位培养单位: 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二零一二年五月二零一二年五月 Screening of specific targeting peptide for lung caner cells and application of peptides in cancer diagnosis and therapy By Bing Dong A Dissertation Submitted to Graduate University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Biophysics Suzhou Institude of Nano-Tech and Nano-Bionics, Chinese Academy of Sciences May, 2012 关于学位论文使用权声明 任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人，未经著作权人授权，不得将 本论文转借他人并复印、抄录、拍照、或以任何方式传播。否则，引起有碍著作 权人著作权益之问题，将可能承担法律责任。 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 （中国科学院生物 物理研究所）有关保存、使用学位论文的规定，即：中国科学院苏州纳米技术与 纳米仿生研究所（中国科学院生物物理研究所）有权保留学位论文的副本，允许 该论文被查阅；中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所（中国科学院生物物 理研究所）可以公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存该论文。 （涉密的学位论文在解密后应遵守此规定） 签 名： 导师签名： 日 期： 关于学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成 果不包含任何他人享有著作权的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其 他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 签 名： 导师签名： 日 期 目 录 中文摘要 Abstract 第一章 绪论 1.1 肺癌的诊疗现状 1 1.2 癌症分子靶向治疗的研究进展 3 1.3 肺癌的生物标记物研究 13 1.4 靶向分子研究现状 18 1.5 细菌展示技术进展及应用 20 1.6 药物载体进展及纳米技术的影响 25 1.7 课题设计思路及研究目标 29 第二章 实验部分 2.1 实验材料 31 2.2 实验设备 31 2.3 溶液配制 32 2.4 实验方法 2.4.1 共沉淀法筛选特异性细菌的方法 33 2.4.2 流式细胞仪筛选特异性细菌的方法及流程 34 2.4.3 单克隆细菌分离方法 36 2.4.4 单克隆细菌结合效率比较实验 37 2.4.5 单克隆细菌结合效率及特异性表征 38 2.4.6 乙醇法固定细胞及细菌 40 2.4.7 多聚甲醛法固定细胞细菌 41 2.4.8 固定细菌的结合效率及特异性表征 41 2.4.9 固定细菌识别鼠肺癌组织实验 42 2.4.10 多肽体外靶向功能验证 43 2.4.11 超声法合成脂质体及表征 44 2.4.12 挤压法合成脂质体及表征 45 2.4.13 STEM对脂质体的表征 45 2.4.14 脂质体包裹荧光分子成像实验 46 2.4.15 脂质体包裹siRNA效率表征 46 2.4.16 转染实验 48 2.4.17 RNA的提取 48 2.4.18 RT-PCR 48 2.4.19 Western Blot 49 第三章 实验结果分析 3.1 筛选肺癌特异性多肽 3.1.1 构建所得细菌表面展示多肽库特点 51 3.1.2 具有特异结合能力的细菌的富集过程 51 3.1.3 特异性单克隆细菌的选择 54 3.1.4 分析得到特异性多肽序列 54 3.1.5 单克隆细菌结合效率及特异性 56 3.2 特异性多肽在肺癌诊断方面应用研究 59 3.2.1 细胞固定对结合效率的影响 60 3.2.2 细菌固定对结合效率的影响 61 3.2.3 固定细菌的结合效率及特异性 63 3.2.4 固定细菌保存时间对结合效率的影响 65 3.2.5 固定细菌识别肺癌组织 65 3.2.6 小结及讨论 67 3.3 多肽在肺癌靶向治疗方面的应用研究 68 3.3.1 特异性多肽具有体外靶向的能力 68 3.3.2 粒度均一的长循环脂质体的合成 70 3.3.3 不同成分对脂质体稳定性的影响 73 3.3.4 PEG 对脂质体稳定性的影响 74 3.3.5 电镜下脂质体的大小及形态 74 3.3.6 脂质体包裹荧光分子效果 77 3.3.7 siRNA 包裹效率 78 3.3.8 siRNA 抑制基因及蛋白表达 78 第四章 总结讨论 81 参考文献 85 附录 103 致谢 105 发表论文及专利 107 个人简历 109 中 文 摘 要 I 中 文 摘 要 肺癌是严重危害人类的恶性肿瘤， 面对目前临床上缺乏早期诊断方法及特异 性的治疗手段的现状，本课题主要以筛选特异性结合多肽为基础，研究针对肺癌 的诊断及靶向治疗方法。 本课题以细菌展示技术和流式细胞分选术为基础， 经过 6 轮筛选从细菌展示 的多肽库中得到 60 个单克隆细菌，单克隆细菌同肺癌 A549 细胞特异性结合率 高达 80%，测序得到 7 条靶向肺癌细胞的多肽序列。使用 4%多聚甲醛对细菌进 行固定，固定后细菌和 A549 细胞结合达到极好结合效率(70%)及特异性，并 且可以维持这种能力 30 天以上。同样的结论也经由小鼠的 A549 组织切片来验 证。以多肽特异性识别和细菌荧光为基础，我们首次提出固定后的细菌作为诊断 试剂在临床上应用的可能。 在利用多肽进行靶向治疗上应用方面我们使用连接多肽的微球去验证特异 性多肽单独作为靶向引导分子的靶向功能，结果显示出明显的靶向效果。我们合 成了中性长循环脂质体作为药物载体，使用挤压法控制粒度分布在 80-120nm， 大小均一，保存 40 天后仍能保持结构的完整；借助包裹 siRNA 来验证脂质体介 导的 RNAi 效果， 无论是 PCR 结果还是 Western Blot 的结果， 都显示明显的 RNAi 效果，表明合成的脂质体适合作为基因药物载体。 课题筛选得到针对肺癌细胞 A549 的特异性的多肽，开发一种应用固定的荧 光细菌作为诊断试剂的新方法， 在肺癌的靶向治疗方面完成了药物载体的构建及 靶向分子的表征工作， 为肺癌的诊断及治疗研究做出了实用数据支撑及方向性探 索。 关键词：多肽，靶向，诊断，细菌展示技术，肺癌关键词：多肽，靶向，诊断，细菌展示技术，肺癌 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 II Abstract III Abstract Lung cancer is one of the most malignant tumors hazard to human health. Currently there is no specific and efficient way for the diagnosis and treatment of this disease. Our research focused on study of novel methods for specific diagnosis and target therapy to lung cancer based on screening peptides which could specifically bound to lung cancer cells. With bacterial surface display method and flow cytometric sorting technology, 60 monoclonal bacteria with specifically binding activity were picked up from bacterial display peptide library after 6 rounds of screening and seven different peptide sequences were obtained after sequencing. Fixed bacteria with 4% paraformaldehyde, maintained the high binding efficiency (70%) and the excellent specificity more than 30 days with A549 cells. Furthermore, the binding activity of fixed bacteria with mouse A549 tissue sections was similar as those with A549 cells. Based on the specific recognition and fluorescence of bacteria with peptides on the surface, we proposed that fixed bacteria could work as diagnostic reagents in the clinical application. As for the application of peptides in targeting therapy, we constructed microsphere system conjugated with peptides to examine the peptides targeting function. The results demonstrated that peptides could be used as effective guiding molecules for target therapy. For the future target treatment of lung cancer, we synthesized neutral long circulating liposomes as nano-drug carriers. Extrusion method was applied to control the liposome size range from 80 to 120nm. After stored for 40 days, liposomes still maintained the integrity of the structure. siRNA was packed into liposomes to verify the ability of liposomes as candidate carriers for drug delivery. Results from PCR and Western Blot indicated that siRNA could interfere the protein expression effectively, which indirectly proved that the synthesised liposomes were suitable as drug carriers. In our study, we obtained novel peptides specifically binding with lung cancer 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 IV A549 cells, developed a new method using fixed fluorescent bacteria as a diagnostic reagent, completed nano-drug carriers construction and characterized targeting function of peptides. Our work provided significant data and guidance exploration in diagnosis and therapy research for lung cancer. Keywords: Peptide, Target, Diagnosis, Bacteria display technology, Lung cancer 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 1.1 肺癌的诊疗现状 肺癌作为常见的恶性肿瘤之一，其致死率极高，是全球头号的癌症杀手1。 从1985年以来，肺癌已成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年因肺癌 死亡的人数多于乳腺癌、前列腺癌和肠癌死亡人数的总和。我国是世界上肺癌患 者最多的国家，每年约有40万人被确诊患有肺癌，发病率已高达61.4/10万。据卫 生部2011年官方统计数据，我国肺癌死亡率占全部恶性肿瘤死亡的22.7%，其中 男性患者因肺癌死亡人数占恶性肿瘤死亡的24.7%，死亡比例达到41.14/10万， 女性这一数字也达到19.63/10万，均居恶性肿瘤类死亡率的首位。肺癌已成为一 个严重的公共健康问题。 作为危害极大的恶性肿瘤，肺癌也同时是科学研究领域中的热点，2012年5 月1日在法国路透社旗下的科学论文检索网站Web of Knowledge上以主题关键字 进行检索，输入肺癌可以检索到451,932条结果，同时胃癌这一数字是152,148， 肝癌是194,231，乳腺癌为813,747，结肠癌为228,228，可以看出在常见的恶性肿 瘤中，肺癌也仅排在乳腺癌之后，是研究最热门的肿瘤类型。 因此无论是临床的高发病率及病死率还是科学领域的大量研究都不断提醒 我们，肺癌的巨大的危害以及改善肺癌现状的迫切需求。与现在的对肺癌研究及 解决需求形成鲜明对比的是对于肺癌的诊断及治疗的相对滞后。 目前对于肺癌的 诊断主要还是依赖影像学检查和细胞学检查等， 但是无论是影像学检查还是组织 细胞的活检，都不能做到极早期的诊断。而根据肺部的生理构造，使肺部具有强 大的生理代偿功能，在患者有肺癌的临床表现之后，即使能检查出来肿瘤发生， 但也往往是为时已晚，肿瘤可能随循环系统播散到身体的其他器官，病程已经发 展到中晚期，正是由于肺癌诊断方法的滞后性，导致肺癌的临床治疗大部分是从 病程的中后期开始，治疗的效果自然不容乐观。同时目前临床上常见的治疗手段 (手术切除、药物化疗、放射治疗、生物治疗等)也没有对肺癌有特异性疗效的方 法。外科手术切除需要满足肿瘤界限明确，没有远处扩散转移等手术适应症，仅 对实体瘤有效，对于肿瘤所处的位置等均有限制，而且对进行手术的患者身体条 件的有一定的要求， 年老体弱者往往不能承受手术带来的伤害而不适合进行手术 治疗，因此手术治疗的适用范围具有很大的限制性；药物化疗在应用抗肿瘤的药 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 2 物全身应用去杀死肿瘤细胞，虽然相比外科手术，化学治疗更加温和，不需要创 伤治疗，但是化疗时由于是全身应用化疗药物，在杀伤肿瘤细胞的同时，也将人 体大量的正常的细胞杀死，出现恶心、呕吐、皮肤反应、肝肾毒性、免疫系统受 损等情况，因此许多具有良好的杀伤肿瘤效果的药物在临床应用的过程中，往往 会因为患者出现的诸多的毒副作用使正规的化疗过程提前终止， 使得化疗的效果 大大折扣；放射治疗是利用穿透力强的射线对肿瘤部位进行照射，利用射线杀死 肿瘤的一种治疗手段。射线照射到肿瘤部位产生的电离作用及DNA的损伤都可 以造成肿瘤细胞的损伤甚至死亡，是一种无创的治疗手段。但是由于受到射线穿 透力及区别正常组织的定位等限制，放射治疗的应用也受到诸多的限制，而且不 同的肿瘤细胞对于放疗的反应不同，对于射线不敏感的肿瘤，放疗也同样无能为 力， 因此放疗始终没有主要治疗手段， 临床上常和手术治疗、 药物化疗联合应用， 作为一种辅助的治疗手段发挥作用；生物治疗是新近出现新的肿瘤治疗模式，提 取患者自身的外周血单个核细胞， 然后用特异性肿瘤抗原致敏， 形成活化的DC、 CIK细胞，使其大量扩增，然后回输到患者体内从而识别、杀灭肿瘤细胞。由于 是自体的细胞回输，因此基本不存在免疫反应，同时由于回输的免疫细胞是针对 肿瘤细胞，所以无毒、高效是其优势。作为一种新型的肿瘤治疗手段，虽然其前 景很光明，但是在临床治疗的过程中并非对所有的患者都有效，其原因还需要更 多的数据及研究去分析， 其在临床上的应用还需要更多的临床数据和更长时间的 检验。上述的治疗方法都可以适用于肺癌的治疗，但是也可以看出上述方法的种 种缺陷，即是有痰细胞病理，或者支气管镜等呼吸系统的独有的检查方法，对于 肺癌，目前无论是诊断还是治疗都没有特异性的方法，因此肺癌确诊的患者的5 年生存率低于15%2，居恶性肿瘤死亡率首位。鉴于目前肺癌的高发病率和高病 死率的现状和诊疗方面的不足，无论是基础研究者还是临床医师都在努力研究、 实验、尝试，期望能出现特异灵敏的诊断方法和新颖高效的治疗手段，去改变目 前的困境。在诸多新颖的研究方向中，靶向治疗从理论上以其特异性识别、用药 量低等优势成为关注的热点。 1.2 癌症分子靶向治疗的研究进展 分子靶向治疗方法是指以癌症相关的特异性分子或者表达异常分子为靶点， 第一章 绪 论 3 将药物、抗体等有效成分靶向定位于癌症细胞及相关成分并进行清除，从而达到 癌症诊断及治疗的目的，分子靶向治疗，以其低剂量用药、高效治疗、低毒副反 应特点，逐渐成为癌症治疗尤其是在药物化疗中的新热点。靶点分子的确立是靶 向治疗中的基础和关键，靶点分子的选择关系到治疗效果的成败，依据靶点分子 和癌症细胞的位置关系，可以分为两大类：癌症细胞靶点和癌症细胞相关靶点。 癌症细胞靶点：该类靶点分子分布在癌症细胞上，根据解剖的位置来简单的 将其分为膜靶点、胞质内靶点、核内靶点三大类，研究者在各自领域都取得了一 定的进展。 癌症细胞膜靶点分子：细胞膜是由磷脂双分子层和蛋白质组成的生物膜，是 细胞同外界进行物质、能量交换的门户，细胞膜通过胞饮作用(pinocytosis)、吞 噬作用(phagocytosis)或胞吐作用(exocytosis)吸收、消化和外排细胞膜内、外的物 质。细胞膜在细胞间识别、信号传递、纤维素合成和微纤丝的组装等方面发挥重 要作用。从临床治疗的角度来讲，任何的药物治疗最终到达癌症细胞都要穿越细 胞膜，药物发挥作用之前首先接触到是细胞膜。因此从靶向效果和准确性来讲， 细胞膜上结构是靶向的首选研究区域， 细胞膜外表面的膜蛋白因此成为理想的靶 点分子。 表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)家族包括ErbB1 (EGFR), ErbB2(HER2), ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)四类， 作为跨膜蛋白， EGFR 是由胞外区、跨膜区、胞内区三部分组成：胞外区是蛋白配体的结合位点，胞内 区具有同ATP结合位点和酪氨酸激酶区。在头颈部癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌 和食管癌等癌症的研究中均发现EGFR的高表达，EGFR与配体结合后活化，可 以激活下游诸多信号通路，参与癌症细胞增殖、血管生成、黏附、侵袭、转移和 细胞凋亡等过程3。针对EGFR胞外段的抗体药物研究取得很大的突破和进展，很 多抗体药物已经通过美国食品药品管理局(Food and Drug Administration, FDA)的 批准，成功的推入市场进入临床应用。如针对人表皮生长因子受体-2的抗体赫 赛汀(Herceptin, Trastuzumab)， 是一种选择性地结合于HER-2胞外段的人源化单 克隆抗体， HER-2的过度表达存在于多种癌症中， 包括乳腺癌、 卵巢癌、 结肠癌、 肺癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌等4，其中尤以乳腺癌最为突出，1998年赫赛汀 被FDA批准上市治疗转移性乳腺癌， 在治疗HER-2高表达的乳腺癌患者中成为首 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 4 选的抗癌药物，治疗效果明显高于现有抗乳腺癌的药物。爱必妥(Erbitux, Cetuximab)是人鼠嵌合性单克隆抗体，可竞争性结合EGFR细胞外配体区，抑制 EGFR自身磷酸化，阻断下游信号转导通路，抑制生长因子激活细胞有丝分裂信 号的下传，抑制肿瘤细胞增殖。另外，爱必妥与EGFR 结合后还可引起受体的二 聚化、内化及受体的下调，Cunningham 5等报道了爱必妥联合伊利替康用于治疗 结肠癌患者， 联合用药组客观反应率显著高于单独治疗组， 分别是22.9%和10.8%， 显示爱必妥增强了伊利替康的抗肿瘤作用。 2007年FDA批准爱必妥用于结直肠癌 治疗， 后来又扩大到头颈部鳞癌以及EGFR高表达的非小细胞肺癌患者的治疗中。 泰欣生(Nimotuzomab)， 通用名为重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体， 体内外实验证明泰欣生有抗细胞增殖和抗血管生成作用， 并且能够促进细胞凋亡， 阻滞细胞周期停留在G1/S期6， 2006年4月获得我国国家食品药品监督管理局批准， 成为我国第一个人源化单克隆抗体药物，和放射治疗联合用于治疗EGFR阳性的 /期鼻咽癌的患者。 CD20是B细胞重要的分化抗原，表达于95以上正常或恶化的B细胞表面， 起始表达于preB细胞阶段，至B细胞终端分化成浆细胞时结束，一直被认为是B 系细胞表面特有的标识。CD20 的生理作用至今尚未阐明，根据CD20与抗CD20 的抗体结合后产生的一系列的生物学反应， 推测CD20可能参与B细胞的增殖、 分 化、信号转导和钙离子的跨膜传递。CD20与抗体交联形成后,在浆膜上形成钙离 子通道，细胞内的钙离子浓度增加，抑制B细胞从G1期进入S/G2+M期，从而引 起细胞凋亡的发生7。CD20与抗CD20抗体结合后内化现象不明显，因此细胞表 面CD20分子数量并不因为与抗体结合而大量减少；CD20也不会发生明显细胞表 面脱落的现象，在人体血清中无游离的CD20存在。因此CD20是治疗B细胞淋巴 瘤时理想的靶点。1997年FDA批准美罗华(Rituximab)上市，用于治疗非霍奇金淋 巴瘤(Non-Hodgkins Lymphoma, NHL)，对50%NHL患者有治疗效果8。2002年， FDA批准了世界上第一个放射性免疫治疗药物美国Biogen-IDEC公司的泽瓦 灵(Zevalin, Ibritumomab Tiuxetan)，用于治疗复发性或难治性低恶性度滤泡性 或转化的B细胞NHL，其中包括美罗华难治性的滤泡性NHL。2003年6月27日， FDA批准第二个放射性免疫药物英国葛兰素公司的百克沙 (Bexxar，131I Tositumomab)用于治疗癌细胞已经或未发生转移，对美罗华有耐药性，化疗后又 第一章 绪 论 5 复发的CD20 、 滤泡性NHL。 这三种抗体药物都可以通过CDC、 ADCC、 诱导CD20 细胞发生凋亡或直接抑制恶性B细胞的增殖来发挥其治疗效果9。 泽瓦灵和百克沙 的应用开辟了一种治疗癌症的新方法放射免疫治疗(Radioimmunotherapy, RIT)，结合了单克隆抗体的靶向作用与放射性核素内照射的强杀伤作用，具有疗 效好、副作用低的特点。 CD52 是 一 种 分 布 比 较 广 泛 的 抗 原 ， 属 于 短 链 甘 油 磷 酸 肌 醇 (Glycosylphosphatidylinositol, GPI) 锚定糖蛋白家族， 分布于造血系统的淋巴细胞、 单核细胞、嗜酸粒细胞和单核细胞分化的树突状细胞上，很多淋巴系细胞恶性癌 症和某些急性髓系白血病细胞上也有 CD52 抗原不同程度的表达。抗 CD52 单抗 坎帕斯(Alemtuzumab)是一种人源化的单抗，经过 CD52 结构的分析及及其和坎 帕斯结合位点的深入研究 10 之后， 2001 年获 FDA 批准用于治疗难治复发性 B 细 胞慢性淋巴细胞白血病，缓解率约 19% 11, 12。 CD146是被称之为黑色素瘤细胞粘附分子，介导和参与内皮细胞迁移、血管 生成和肿瘤转移过程，Yan等人持续在CD146的分子机制上进行研究，从最初报 道CD146分子抗体AA98 13到研究发现CD146分子在上皮性质的乳腺癌细胞中过 表达将导致细胞发生上皮-间叶转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，从 而是原本恶性程度较低的肿瘤细胞获得极高的细胞侵袭迁移能力， 以及乳腺癌干 细胞的特征等进展14，推动CD146作为靶向治疗的靶点及生物标记物15的深入研 究。 癌症细胞表面靶点是癌症靶向治疗研究中首选靶点，具有易识别、易接近等 作为靶点的优势，在该领域的研究也是靶向治疗的热点。目前还有 CD147 16, 17、 CD82 18、CD317 19 等细胞表面靶点处于研究阶段。但是由于癌症细胞发生机制 本身的复杂性及目前研究的现状，加上癌症细胞极易发生各种变异，导致明确的 癌症细胞表面特异性靶点很难确定。 细胞质靶点分子：细胞的形态结构、物质合成、新陈代谢、信号传导等诸多 过程都在细胞质内完成， 在肿瘤细胞维持其恶性度的特征方面具有决定性的作用。 由于细胞质内涉及多条信号通路分子及诸多蛋白， 故此类靶点分子是最多的一类。 骨架蛋白在癌症细胞的增生、扩张、转移过程中发挥着不可或缺的作用，因 此抑制骨架蛋白表达也成为分子靶向治疗的重要方向。微管(Microtubule)是真核 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 6 细胞于增殖周期或发育的某个时相中存在于细胞内的一种蛋白质聚合体， 是构成 细胞网架的主要成分。微管有聚合和解聚的动力学特性，在保持细胞形态、细胞 的分裂增殖、细胞器的组成与运输及信号物质的传导方面发挥重要作用。以微管 为靶点的抗肿瘤药就是利用其动力学特性，或促进其解聚或抑制其聚合，从而达 到直接影响细胞的有丝分裂，并影响细胞的诸多正常生理功能，使细胞分裂停止 于M期。长春瑞滨(Navelbine, 诺维本)，1989年首先在法国上市，抑制微管蛋白 聚集，是目前单药治疗非小细胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Carcinoma, NSCLC) 最有效的药物之一20, 21；紫杉醇(Taxol)可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚 体失去动态平衡， 诱导与促进微管蛋白聚合、 微管装配， 防止解聚， 使微管稳定， 从而阻止癌细胞的生长22，1992年美国FDA正式批准紫杉醇作为化疗晚期卵巢癌 新药上市，其半合成衍生物多西紫杉醇(Docetaxel) 于1995年上市。紫杉醇不仅 对卵巢癌、子宫癌和乳腺癌有较好的疗效，而且对胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、 转移性肾癌、急性胰腺炎、视网膜瘤、恶性黑色素瘤、头颈部肿瘤等多种癌症的 疗效也十分明显23。 细胞质中功能蛋白，如酪氨酸蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等在体内 参与多种信号转导过程，癌症细胞中常常异常表达，在靶向治疗中常作为靶点分 子进行研究。Ras蛋白被生长因子、细胞因子等激活，由失活态Ras-GDP结合构 象转变为活化态Ras-GTP结合构象， 招募Raf激酶家族到胞膜并激活Raf蛋白， Raf 蛋白通过其C端的激酶功能域催化丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)，MAPK由胞浆移位至细胞核，磷酸化下游一系列转录因 子，调控基因表达，调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡和黏附、迁移等一系列 过程，影响肿瘤的发生、侵袭、转移以及耐药。Raf基因突变及MAPK的过度激 活与很多肿瘤发生有关。Ras须经法尼基化，即一种脂类翻译后修饰才能发挥致 癌作用，因此Ras法尼基化成为开发新型抗癌药物的一个主要靶点24，替匹法尼 (Zarnestra)是美国强生制药公司开发的口服用法尼基转移酶抑制剂(Farnesyl Transferase Inhibitors, FTIs)，强生公司原计划将其开发成标准化疗方法不适用的 老年患者的急性髓样白血病的治疗用药。 但是FDA在2005年根据其期临床试验 数据，拒绝替匹法尼上市申请。作为Ras下游效应器之一的Raf-1蛋白是热休克蛋 白90 (Heat Shock Protein 90, Hsp90) 的客体蛋白之一, 其功能需要Hsp90的参与。 第一章 绪 论 7 苯醌安莎霉素类抗生素Geldanamycin可以特异性结合Hsp90，破坏Hsp90-Raf-1复 合物， 促进Raf-1降解而使之去稳定化25。 MAPK激酶MEK抑制剂U0126及PD98059 在乳腺癌细胞实验中表现出明显的抗癌作用26。 PI3K-AKT-mTOR信号系统相关靶点研究：活化的磷酸肌醇3激酶 (Phosphatidylinositol 3-Kinases, PI3K)催化细胞膜上磷脂酞肌醇-4, 5二磷酸 (Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)肌醇环上D23位磷酸化，生成第二信 使磷脂酞肌醇-3, 4, 5三磷酸Phosphatidylinositol (3, 4, 5)-triphosphate, PIP3；PIP3 通过与Akt结合，使之从细胞质移至细胞膜，引起Akt构象的改变，同时，细胞质 中PIP3依赖的磷脂酞肌醇依赖性激酶(Phosphoinositide-Dependent Kinase, PDK) 与PIP3结合，导致已发生构象改变的Akt与PDK相互接近。在PDK-1的直接或间 接催化下，Akt的激酶活性区中的Thr308位点发生磷酸化；在PDK-2的存在下， Akt的Ser473再被磷酸化而完全被激活，Akt即成为有活性的激酶，激活哺乳动物 雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)，主要有促进细胞存活、 细胞增殖及细胞生长，诱导血管发生等生物学效应。PI3K-Akt-mTOR 信号通路 在许多恶性肿瘤中失调，如卵巢癌、乳腺癌、,恶性胶质瘤、子宫内膜癌27, 28等。 Akt的抑制剂抗炎药物塞内昔布(Celecoxib)1999年被FDA批准上市用于治 疗关节炎，塞内昔布能够使Akt失活从而抑制乳腺癌细胞的生长，成为乳腺癌治 疗研究中的主要药物之一29。西罗莫司(Rapamycin, 雷帕霉素)是一种mTOR的抑 制剂，是美国食品药品管理局批准适用于临床移植的免疫抑制剂，但其衍生物 CCI-779、RAD-001和AP-23573则被明确定位为抗肿瘤药物。临床前研究结果表 明，这类化合物无论是单药还是与细胞毒药物联用均能有效抑制肿瘤生长。目前 雷帕霉素的肿瘤抑制Temsirolimus及Everolimus已在2007和2009年被批准上市， Deforolimus的/期临床实验已结束，期临床实验正在进行之中30。 通常Hedgehog (Hh)信号通路在缺乏配体时，处于关闭状态， 跨膜蛋白受体 Patched (Ptch, 12次跨膜)抑制smoothened (Smo,一种7次跨膜的原癌蛋白)的活性, 信号通路下游组分转录因子Gli与细胞质蛋白结合而不能进入细胞核，因此Hh目 标基因的转录活性受到抑制。当任意一种配体结合Ptch，Hh信号通路就被激活磷 酸化改变Smo构象31，导致Smo去抑制。该信号通路异常常发生在肝癌、神经胶 质瘤、基底细胞癌、横纹肌肉瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺 肺癌特异性靶向多肽的筛选及其在癌症诊疗方面的研究 8 癌、黑色素瘤和多发性骨髓瘤32-34等肿瘤。来自植物的内固醇样化合物环杷明， 结合并抑制Smo，进而抑制那些具有Hh信号通路活性的细胞和肿瘤的生长. 在目 前的研究中可以观察到有明显的抗肿瘤的作用，但是其毒性也很明显35，增加靶 向分子来提高其治疗的精准度或许是一个降低其毒性的方法36。 酪氨酸激酶抑制(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)：蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinase, PTK)是一组酶系，分受体型和非受体型。常见的受体型包括 EGFR家族、胰岛素受体家族、血小板衍化生长因子受体家族、血管内皮生长因 子受体家族、纤维细胞生长因子受体家族等；非受体型包括SRC、ABL、JAK、 ACK、CSK、FAK、FES、FRK、TEC、SYK家族等。PTK是多种肿瘤最常见的 生长因子受体，抑制其活性可破坏肿瘤细胞的信号传导，抑制肿瘤细胞增殖和新 生血管形成，而对正常细胞影响较小。已有的资料表明，超过50%的原癌基因和 癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性， 它们的异常表达将导致细胞增殖调节发 生紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转 移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的化疗抗性密切相关。目前TKI药物开发现状如 下： 格列卫37 ( Imatinib mesilate, Glivec, 甲磺酸伊马替尼) 是一种PTK抑制剂， 靶向抑制费城(Philadelphia, Ph)染色体阳性的慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia, CML)产生的具有酪氨酸激酶活性的异常蛋白Bcr -Ab1。2001年5月10 日经FDA 批准在美国上市，用于Ph+的CML加速期、急变期以及A2干扰素治疗 失败后的慢性期治疗。 2002年2月1日FDA又批准该药用于治疗无法切除的或转移 性的恶性胃肠道间质肿瘤。 副作用主要有： 皮疹、 体液潴留、 恶心、 呕吐、 腹泻、 头痛、肌肉痉挛、骨髓抑制(血小板减少和中性粒细胞减少)、肝、肾毒性、出血 和天冬氨酸氨基转移酶升高、丙氨酸氨基转移