HIV-1gp41蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响

分类号 密级 UDC 编号 中国科学院研究生院 中国科学院研究生院 博士学位论文 博士学位论文 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 龙宇飞 龙宇飞 指 导 教 师 指 导 教 师 松田善卫 教授 东京大学 医科学研究所 松田善卫 教授 东京大学 医科学研究所 阎锡蕴 教授 中国科学院 生物物理研究所 阎锡蕴 教授 中国科学院 生物物理研究所 申请学位级别申请学位级别 博士 博士 学科专业名称 学科专业名称 细胞生物学 细胞生物学 论文提交日论文提交日 2011 年 5 月 2011 年 5 月 论文答辩日期 论文答辩日期 2011 年 5 月 2011 年 5 月 培 养 单 位培 养 单 位 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位学位授予单位 中国科学院研究生院 中国科学院研究生院 答辩委员会主席答辩委员会主席 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 摘 要 摘 要 人类免疫缺陷病毒 I 型 （HIV-1） 是全球广泛流行的艾滋病的致病因子。 HIV-1 病毒与宿主细胞的膜融合是其生命周期的起始步骤，对病毒侵染细胞起关键作 用。膜融合过程由病毒的包膜蛋白（Envelope）介导完成，成熟的 HIV-1 包膜蛋 白分为 gp120 和 gp41 两个亚基， 其中 gp41 亚基直接诱导膜融合发生。 尽管 HIV-1 病毒的变异性很强，但 gp41 亚基中跨膜区序列高度保守，被认为对膜融合过程 有影响，但机制尚不清楚。跨膜区中一个引人注意的氨基酸是第 696 位带正电荷 的精氨酸，由于带电荷的氨基酸很少出现在高度疏水的跨膜区，而且在 HIV-1 各分离株中该位点的唯一突变是同样带正电荷的赖氨酸， 这暗示着该精氨酸残基 可能对包膜蛋白执行功能起到重要作用。 为研究跨膜区精氨酸及周围氨基酸的作用， 我们构建了一系列精氨酸替换突 变体（Arg-substitution）和精氨酸轮转突变体（Arg-shifting） ，分别将精氨酸突变 为其他氨基酸，以及改变精氨酸在跨膜区的位置，检测他们对包膜蛋白的影响。 结果表明，精氨酸替换突变体对包膜蛋白的合成、前体剪切和细胞膜上含量 无明显影响；但不同电荷性质的氨基酸替换精氨酸会影响细胞膜融合。当精氨酸 被替换为同样带正电荷的赖氨酸时，膜融合活性以及动力学曲线与野生型相似； 替换为不带电荷的氨基酸时，膜融合活性降低；替换为带负电荷的氨基酸时，细 胞融合被抑制，但保留部分诱发形成融合孔的能力。抑制实验进一步发现，可溶 性 CD4 分子对负电荷氨基酸替换突变体介导的膜融合的抑制效应与野生型相 似，而融合中间体抑制剂 C34 对负电荷氨基酸替换突变体介导的膜融合的抑制 效应则比野生型有所延迟。这些结果提示，负电荷替换突变体不影响融合过程中 的受体结合步骤，但影响了融合中间体的形成以及融合孔扩大等后续步骤。 我们进一步检测精氨酸在跨膜区不同位置以及在 螺旋上的相对朝向 (phase) 对包膜蛋白的影响，结果发现当精氨酸处于跨膜区第 691697 位时，会 导致包膜蛋白前体分子的剪切受损； 当精氨酸处于跨膜区第 698701 位时， 虽然 包膜蛋白的剪切正常，但只有当精氨酸出现在 699 和 700 位，即在 螺旋上与 696 位同侧时，才能保持细胞融合活性。此外，在跨膜区第 691698 位引入额外 的精氨酸会导致包膜蛋白更多的聚集在核周围区域，细胞膜上含量显著降低，当 I HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 精氨酸处于 螺旋上与 696 位异侧时，这种影响更为明显。以上结果表明，精氨 酸对包膜蛋白及膜融合的影响与其位置和朝向密切相关， 只有当精氨酸位于跨膜 区下半段（696 下游）与 696 位同侧时，才能正常发挥其促进膜融合的作用。 综上所述，我们发现 HIV-1 包膜蛋白 gp41 亚基跨膜区内第 696 位精氨酸对 包膜蛋白有重要作用。 精氨酸通过位置和朝向相关的机制调节包膜蛋白的前体剪 切、 细胞内分布和细胞膜上含量， 并促进膜融合的发生。 由于膜融合过程对 HIV-1 病毒侵染细胞起关键作用， 更好的理解特定氨基酸对膜融合的作用以及融合机制 将为抑制病毒侵染提供更多解决方案。 关键词：HIV-1，包膜蛋白，gp41，跨膜区，精氨酸, 膜融合 II HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 AbstractAbstract Long Yufei (Cell Biology) Directed by Professor Zene Matsuda and Professor Yan Xiyun Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a causative agent of the worldwide pandemic of AIDS. The envelope glycoprotein (Env) of HIV-1 plays an essential role in the first step in HIV-1 life cycle by mediating the membrane fusion between virions and host cells. Env contains two subunits, gp120 and gp41. The gp120 subunit recognizes the CD4/chemokine receptors, and the gp41 subunit induces membrane fusion. The gp41 subunit is divided into three domains: an ectodomain, a cytoplasmic domain and a membrane-spanning domain (MSD). Despite the high mutation rate of HIV-1, the amino acid sequences of the MSD of gp41 (residue 684 to 704; the numbering is based on that of the HXB2 strain) are well conserved. A notable residue among these conserved sequences is Arg696. An arginine residue, a potentially positively charged residue, is rare in single membrane-spanning domains in general. Furthermore, the only naturally observed mutation of Arg696 in the MSD of gp41 is lysine. These suggest that an important role of positively charged residue in the MSD of gp41. In this thesis, the role of Arg696 and the surrounding sequence of gp41 MSD in the function of Env was investigated by mutagenesis studies. For this purpose, we mutated the Arg696 to the other amino acid residues or shifted the position of the arginine residue in the gp41 MSD. Most of the substitutions did not affect the protein expression, processing or cell surface distribution. However, substitutions of Arg696 with amino acid residues other than K, a substitution naturally observed in field isolates of HIV-1, decreased fusion activity. Substitutions with hydrophobic amino acid residues, like A, I, L, V, P, F, resulted in a modest decrease. Substitutions with D or E, potentially negatively charged residues, almost abolished the syncytia formation, yet retained some fusion pore-forming capability. Further studies showed that the soluble CD4 inhibition III HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 profile of RD mutant was similar with that of WT, while RD mutant showed a prolonged period of susceptibility to C34, an inhibitor of fusion six-helix bundle formation. These data imply that the post-receptor binding processes, including 6-helix bundle forming and pore enlargement, were impaired by RD mutant. When we examined the effect of the position of arginine by constructing Arg-shifting mutants, we found that shifting the arginine residue in the positions between 691 and 697 impaired the processing of precursor gp160. These mutants had defective fusion activities. Positioning the arginine into the region between 698 and 701 did not affect the processing of gp160; however the fusion activity was maintained only when arginine residue was at the positions 699 and 700, the same phase with Arg696 in the -helix. When an extra arginine was introduced in the region between 691 and 698, a defective distribution and surface expression of Env were observed. These defects were more prominent when arginine residue was in the opposite side of 696 position in the -helix. These data suggests that the position and phase of the arginine residue in the -helix are critical for Env processing, intracellular distribution, surface expression and membrane fusion. In summary, our results of Arg-substitution mutants and Arg-shifting mutants clearly showed that the conserved Arg696 in the MSD of gp41 was important for the function of envelope. Arg696 modulates protein processing, intracellular distribution, surface expression of Env and facilitates membrane fusion process by a position and phase dependent mechanism. Because the membrane fusion is an essential step for the HIV-1 entry to the host cell, a better understanding of the mechanism of fusion contributes to therapeutic studies. Key words：HIV-1, Envelope glycolprotein, gp41, membrane-spanning domain (MSD), arginine, membrane fusion IV HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 缩略词 缩略词 AIDS Acquired immune deficiency syndrome HIV Human immunodeficiency virus SIV Simian immunodeficiency virus Env Envelope glycoprotein MSD Membrane-spanning domain NHR N-terminal heptad repeat CHR C-terminal heptad repeat 6-HB Six-helix bundle ER Endoplasmic reticulum HCV Hepatitis C virus DSP Dual-split protein TCR T cell receptor FL Firefly luciferase RL Renilla luciferase PFAParaformaldehyde SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis PVDF Polyvinylidene fluoride membrane HRP Horseradish peroxidase IFA Immunofluorescence assay EGFP Enhanced Green fluorescent protein APC Allophycocyanin FBS Fetal bovine serum WT Wild type V HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 目 录 目 录 摘 要摘 要 I AbstractAbstract III 缩略词缩略词 .V 目 录目 录 VI 文献综述文献综述1 第一部分：HIV基因组、病毒蛋白和生命周期概述第一部分：HIV基因组、病毒蛋白和生命周期概述.1 1.1 HIV病毒以及艾滋病.1 1.2 HIV病毒结构、基因组以及病毒蛋白.1 1.3 HIV的生命周期（复制周期）.4 第二部分：HIV-1 包膜蛋白的结构、功能以及其介导的膜融合机制第二部分：HIV-1 包膜蛋白的结构、功能以及其介导的膜融合机制7 2.1 包膜蛋白概述7 2.2 Gp120 的结构与功能8 2.3 Gp41 的结构与功能9 2.4 包膜蛋白的其他功能.11 2.5 包膜蛋白介导的膜融合过程.11 第三部分：HIV gp41 跨膜区的研究进展第三部分：HIV gp41 跨膜区的研究进展13 3.1 gp41 跨膜区结构的研究进展14 3.2 gp41 跨膜区功能的研究进展15 3.3 跨膜区内带电荷氨基酸残基对蛋白功能的影响17 研究内容研究内容20 第一部分：HIV-1 gp41 跨膜区精氨酸对细胞膜融合的影响第一部分：HIV-1 gp41 跨膜区精氨酸对细胞膜融合的影响20 前言.20 1.1 材料与方法.21 1.1.1 实验材料.21 1.1.2 实验方法.22 1.2 实验结果.29 1.2.1 突变体构建.29 1.2.2 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白的合成以及gp160 前体剪切31 1.2.3 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白细胞膜表达.32 1.2.4 精氨酸替换突变体影响了包膜蛋白介导的细胞融合.35 1.2.5 精氨酸替换突变体影响了膜融合动力学.42 1.2.6 负电荷氨基酸替换突变体仍保留部分融合孔形成能力.44 1.2.7 负电荷氨基酸替换突变体影响了融合中间体的形成.45 1.2.8 负电荷的氨基酸残基在跨膜区中未显示出负显性抑制.46 1.2.9 多聚亮氨酸跨膜区回复突变体显示Gly 694和Arg696对膜融合有重要作用.47 1.3 总结与讨论.49 1.3.1 总结gp41 跨膜区第 696 位精氨酸残基对包膜蛋白的影响49 1.3.2 跨膜区带电荷氨基酸对膜蛋白的影响机制.49 1.3.3 gp41 跨膜区内精氨酸残基促进膜融合的机制50 VI HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 第二部分：HIV-1 gp41 跨膜区精氨酸的位置和相对朝向对包膜蛋白的影响第二部分：HIV-1 gp41 跨膜区精氨酸的位置和相对朝向对包膜蛋白的影响53 前言.53 2.1 材料与方法.54 2.1.1 实验材料.54 2.1.2 实验方法.54 2.2 实验结果.57 2.2.1 HIV-1 gp41 跨膜区采取螺旋结构57 2.2.2 跨膜区内Gly 694和Arg696的相对朝向影响gp160 的剪切及膜融合57 2.2.3 精氨酸在特定朝向上对gp160 剪切的影响是由其电荷性质引起的60 2.2.4 精氨酸在跨膜区上的位置也会影响gp160 的剪切62 2.2.5 精氨酸处于跨膜区上半段时影响包膜蛋白的细胞内分布和细胞膜上表达 .65 2.2.6 跨膜区精氨酸在螺旋中的相对朝向影响包膜蛋白介导膜融合的能力.74 2.3 总结与讨论.76 2.3.1 总结精氨酸处于不同位置与朝向时对包膜蛋白的影响.76 2.3.2 精氨酸通过位置和朝向相关方式影响包膜蛋白融合功能的机制.77 参考文献参考文献 81 已发表和待发表的文章已发表和待发表的文章.97 致 谢致 谢 99 VII HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 文献综述 文献综述 第一部分：HIV 基因组、病毒蛋白和生命周期概述 第一部分：HIV 基因组、病毒蛋白和生命周期概述 1.1 HIV 病毒以及艾滋病 1.1 HIV 病毒以及艾滋病 人类免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus)，简称HIV，是引起获得 性免疫缺陷综合症，即艾滋病 (Acquired immune deficiency syndrome, AIDS) 的 病原体1, 2。HIV通过侵染宿主免疫系统导致其免疫功能出现缺陷，并发严重感 染或继发肿瘤导致死亡， 目前尚无治愈方法3。 据联合国艾滋病规划署 (UNAIDS) 最新统计，目前全球HIV病毒携带者约为 3340 万人。从上世纪八十年代初被首 次发现至今，HIV已经累计感染超过 6000 万人，并导致 2500 万人死亡1。 HIV属于逆转录病毒科 (Retroviridae) 慢病毒属 (Lentivirus) 灵长类慢病毒 群 (Primate lentivirus group)4，根据基因差异分为HIV-1 型和HIV-2 型，目前在 全球广泛传播的主要为HIV-1，具有很强的感染性和传播性，而HIV-2 的流行主 要在非洲西部5, 6，致病力和感染力较弱。本文以下内容都是基于HIV-1 型病毒 进行探讨。 由于逆转录过程中产生的大量碱基错配，以及逃避免疫系统攻击的选择压 力，HIV-1 形成了极大的氨基酸序列多样性 (diversity)，尤其是包膜蛋白env基因 的变异率最高， 根据env基因的序列差异， 将HIV-1 分为M， N， O三个亚群 (group)， 其中M亚群是最主要的亚群，可进一步分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 和K共 11 个亚型 (clade)，在中国流行的主要是B亚型7。 1.2 HIV 病毒结构、基因组以及病毒蛋白 1.2 HIV 病毒结构、基因组以及病毒蛋白 HIV 病毒颗粒 (virion) 呈球形，直径约 120nm，由磷脂双分子层包膜 (viral envelope) 包裹病毒核心部分 (viral core) 构成（见图 1.1） 。 1 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Figure 1-1. Schematic diagram of HIV virion structure. Adapted from National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), , and modified by wikipedia user, Carl Henderson. HIV-1 基因组由两个拷贝的正义单链 RNA 组成 (single-stranded RNA, positive-sense)，长度为 9.749kb，包括 9 个基因 gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, 共编码 19 个病毒蛋白（见图 1.2） 。 其中 gag, pol 和 env 被称为结构基因，编码形成病毒所必须的蛋白。 gag编码分子量为 55kD的前体蛋白p55，与病毒出芽过程有关。在病毒成熟 的过程中，p55 前体蛋白经蛋白酶剪切为基质蛋白 (matrix protein, MA, p17), 衣 壳蛋白 (capsid protein, CA, p24), 核衣壳蛋白 (nucleocapsid protein, NC, p7), SP1 (spacer peptide1, p2), SP2 (spacer peptide2, p1) 和p6 蛋白7。基质蛋白主要附着在 病毒脂膜内侧稳定毒粒，也有一部分与整合酶结合促进病毒基因的转运；衣壳蛋 白是毒粒锥形核的主要成分；核衣壳蛋白与病毒核酸结合；P6 蛋白调节Gag前体 蛋白与附加蛋白Vpr相互作用，使其装配进入毒粒8。 gag-pol 基因编码 Gag-pol 多聚前体蛋白，在病毒成熟 (maturation) 的过程 中， 经过蛋白酶裂解后产生蛋白酶 (protease, PR)， 逆转录酶 (reverse transcriptase, RT) 和整合酶 (integrase, IN)。逆转录酶是异源二聚体，由 p66 和 p51 两个亚基 2 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 组成，以病毒单链 RNA 为模板合成双链 DNA；整合酶具有外切核酸酶、内切核 酸酶和连接酶的活性，可以将 HIV 前病毒 DNA（provirus DNA，即病毒 RNA 逆 转录后的拷贝）整合进宿主细胞染色体基因组；蛋白酶剪切病毒前体蛋白使病毒 完成成熟过程。 env基因编码包膜蛋白 (envelope protein, Env)，包膜蛋白在宿主细胞内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 上首先翻译为前体蛋白gp160，随后在高尔基体上被 细胞内furin或类furin蛋白酶分解为gp120 和gp41 两个亚基。 Gp120 负责识别并结 合宿主细胞受体CD4 受体以及辅助受体，gp41 则直接诱导病毒与宿主细胞发生 膜融合9, 10。 tat 和 rev 被称为调节基因，其编码产物对 HIV 的复制起到重要调节作用。 tat的编码产物Tat (Trans-Activator of Transcription) 是RNA结合蛋白， 作为转 录激活因子，对病毒复制有重要作用11。 rev编码产物Rev也是RNA结合蛋白，通过与Rev反应元件 (Rev response element, RRE) 结合，调节病毒基因mRNA表达水平12，调控病毒由基因表达早 期阶段向晚期阶段转化13-16。 nef, vif, vpr和vpu被称为附加基因 (accessory genes)，其编码产物虽然对病毒 复制是非必须的，但却在与宿主细胞相互作用的过程中起到重要作用14。 nef的编码产物Nef (negative regulatory factor) 是复制的早期蛋白，被认为可 以增强病毒复制17, 18。 vif的编码产物Vif (viral infectivity factor) 是逆转录病毒中常见的蛋白, 作用 是拮抗宿主细胞中APOBEC家族的酶的抗病毒活性19。 vpr的编码产物Vpr (viral protein R) 调节HIV-1 前整合复合体 (HIV-1 pre-integration complex) 的入核，还可以阻断细胞分裂使其停留在G2 期20。 vpu的编码产物Vpu (virus protein U) 由与Env蛋白重叠的一段mRNA翻译， 它可以通过拮抗宿主细胞BST2 (tetherin) 的作用增强毒粒的释放21。 3 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Figure 1-2. HIV-1 encoded proteins (including precursors). The location of the genes, the size of primary translation products and the processed mature proteins are indicated. Reprint from Fields Virology, 5th edition, Volume 2, Wolters Kluwer and Lipponcott Williams Aspartic acid and Glutamic acid, potentially negatively charged; Asparagine and Glutamine, share same backbone with Aspartic acid and Glutamic acid, respectively but lack their negative charges. Alanine, Leucine and Isoleucine, represent uncharged amino acids.) 29 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 保守性分析显示，在 HIV-1 各分离株 (isolates) 中，第 696 位精氨酸的唯一 突变是同样带正电荷的赖氨酸， 以往研究也表明带电荷氨基酸残基在跨膜区往往 有重要作用，因此我们推测精氨酸带正电荷的性质可能会对包膜蛋白有重要影 响，也将主要关注以下几种代表不同电荷性质的氨基酸：赖氨酸（K） ，代表同 样带正电荷的氨基酸；谷氨酸（E）和天冬氨酸（D） ，代表带负电荷的氨基酸； 谷氨酰胺（N）和天冬酰胺（Q） ，二者与谷氨酸（E）和天冬氨酸（D）有着相 同的骨架，但缺乏负电荷，同时代表了极性的亲水氨基酸；异亮氨酸（I） ，亮氨 酸（L） ，代表跨膜区常见的疏水性氨基酸，也是检测跨膜区氨基酸功能常用的突 变体；丙氨酸（A） ，无侧链，突变研究中经常使用的氨基酸。 我们构建了包含 env 基因的哺乳动物细胞表达载体 pElucEnv 用于真核细胞 转染。该载体包含实验室研究常用的 HIV 病毒株 HXB2 的 env 基因，基因两端 带有 5LTR 及 3LTR 序列，同时含有 tat, rev, vpu 基因。此外，pElucEnv 可以表 达绿色荧光蛋白 (EGFP) 和萤火虫萤光素酶 (firefly luciferase) 融合蛋白，作为 不同突变体转染效率定性或定量的参照（见图 1-2） 。同时我们构建了 pElucEnv KO 突变体，与 pElucEnv 野生型相比，该突变体仅在 env 基因的起始位点后引入 了终止密码子，作为阴性对照 (Mock)。 由于 pElucEnv 分子量较大 (12.7kb)，不易进行大批量突变，因此我们在构 建突变体时将表达载体 env 基因上包含跨膜区编码序列的 NheI-BamHI 片段克隆 到改造过的 pGEM7z 载体， 利用 Quickchange 突变技术在 pGEM7z 载体上完成点 突变后，再将含有突变位点的 NheI-BamHI 片段克隆到哺乳动物细胞表达载体 pElucEnv 上。 30 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Figure1-2. The map of the Env expression vector used in transfecting mammalian cell, pElucEnv. pElucEnv supports the expression of HIV-1 envelope and the expression of the EGFP-firefly luciferase fusion protein, respectively, from two separate promoters. The RGFP-firefly expression can be used as quantitative control and fluorescent signal indicator for transfection efficiency. The NheI and BamHI sites used for cloning, MSD coding region is between this two sites. The env we used is derived from HXB2 strain and the LTR, tat, vpu and rev are also included to the expression vector. 1.2.2 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白的合成以及 gp160 前体剪切 1.2.2 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白的合成以及 gp160 前体剪切 HIV-1 包膜蛋白在内质网上以gp160 前体分子的形式合成，转运至高尔基复 合体后， 由细胞内furin或类furin蛋白酶解剪切为gp120 和gp41 亚基， 成熟的gp120 及gp41 亚基最终被运输到细胞膜上，执行介导膜融合的功能。跨膜区存在带电 荷氨基酸可能会影响膜蛋白从易位子中移出整合到内质网上113，引起内质网滞 留 (ER retention) 以 及 内 质 网 相 关 的 蛋 白 降 解 (ER associated protein degradation)124。这会使gp160 前体蛋白的表达量以及翻译后的转运和剪切受到 影响。因此我们首先检测跨膜区精氨酸替换突变体对包膜蛋白的表达以及gp160 前体分子剪切的影响。 用野生型和精氨酸替换突变的 pElucEnv 表达载体转染 COS-7 细胞， 48 小时 31 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 后裂解细胞并用 gp120 抗体进行免疫印迹实验。结果如图 1.3 所示，所有的精氨 酸替换突变体都与野生型包膜蛋白的表达情况相似。 由于 HIV-1 包膜蛋白翻译后 的剪切并不完全，细胞内通常会存留很多未剪切的 gp160 前体分子，所以免疫印 记结果中可以同时检测到 gp160 和 gp120 条带。 由于后续检测融合的实验中，也将使用 293 细胞系，因此我们也检测了这些 突变体在 293 细胞中的表达和剪切情况。与转染 COS-7 细胞结果相似，所有精 氨酸替换突变体在转染 293 细胞后， 其包膜蛋白的表达和剪切情况都与野生型相 当。 Figure 1-3. Protein profiles of the Arg-substitution mutants. The envelope proteins expressed in COS-7 cells transiently transfected with the WT and mutant Env expression vectors were detected with anti-gp120 polyclonal antibody. The gp160 and gp120 bands were indicated. The loading amount was normalized by firefly luciferase activity, which indicates the transfection efficiency. 1.2.3 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白细胞膜表达 1.2.3 精氨酸替换突变体不影响包膜蛋白细胞膜表达 免疫印记实验表明各精氨酸突变体的包膜蛋白表达和剪切未受影响， 我们接 下来检测其细胞膜上含量 (surface expression level)。 我们用免疫荧光 (IFA) 的方法检测野生型和突变体包膜蛋白在 COS-7 细胞 的细胞膜上表达情况。将转染的细胞固定后，用抗 gp120 单克隆抗体 b12 作为一 抗孵育，allophycocyanin (APC)标记的二抗进一步孵育。由于未作透膜处理，只 有膜表面的 gp120 分子能够与抗体结合， 膜表面 APC 的荧光强度可以表征 gp120 分子的膜上表达量，而 pElucEnv 载体本身表达的 EGFP 荧光强度可以作为转染 效率的内参。完成染色的细胞分别用激光共聚焦显微镜（Confocal）和 IN Cell 32 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Analyzer 进行观察和分析。我们选取了一些具有代表性的精氨酸突变体的结果， 见图 1-4 和表 1-1。Confocal 结果显示，各精氨酸突变体包膜蛋白的膜上表达情 况都与野生型相似。 EGFP APC Merge Mock WT RA RI RL 33 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 RK RD RN RE RQ Figure 1-4. Level of surface expression of Arg-substitution mutants. COS-7 cells were transfected with WT or mutants and subjected to immunofluorescence assays without permeabilization. Surface-expressed gp120 was detected by staining with b12 primary antibody and APC-conjugated secondary antibody. Internal EGFP signal was used as an indicator of transfection efficiency. Confocal microscopy images from representative Arg-substitution mutants are shown. Those Arg-substitution mutants which are not shown here also exhibit similar expression level with that of wildtype. Images were acquired by a confocal microscope under 40 34 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 objective lens. 同时我们使用 IN Cell Analyzer 观察分析免疫荧光染色结果， INCell Analyzer 在每个实验组中随机在 10 个视野内自动获取荧光图像，然后利用 INCell workstation3.4 软件的编写程序进行定量分析，得出各实验组的 EGFP 信号以及 APC 信号的平均荧光强度 (mean fluorescent intensity SD)。结果（图 1-5）显示， 各突变体转染的细胞膜上 APC 信号的平均强度均与野生型相似。 Background noise Mock (Env. KO) WT RA RI Intensity of EGFP (meanSD) 11410.0 337.818.9287.215.8279.318.6 317.713.4 Intensity of APC (mean SD) 1023.5 112.51.7 130.41.5 132.12.7 134.21.9 RL RK RD RE RN RQ Intensity of EGFP (meanSD) 291.615.2282.814.0310.612.3278.217.7 310.110.1 331.516.0 Intensity of APC (mean SD) 132.62.6134.63.9134.53.3132.21.1133.82.3 136.72.0 Figure 1-5. Intensity analysis of surface-expressed Env with INCell Analyzer. Cells were transfected with Env expression vectors and Env KO vector (Mock). Images of the cells after IFA staining were acquired from ten random fields by the INCell Analyzer (using 10 objective lens) to measure the intensities of EGPF and APC signals. The mean fluorescence intensity (SD) of cells were calculated by INCell workstation 3.4. 1.2.4 精氨酸替换突变体影响了包膜蛋白介导的细胞融合 1.2.4 精氨酸替换突变体影响了包膜蛋白介导的细胞融合 介导膜融合是包膜蛋白最基础和重要的功能， 我们接下来检测精氨酸替换突 变对包膜蛋白介导膜融合的能力是否产生影响。 我们首先利用合胞体实验 (syncytia formation assay) 检测转染了野生型及各 突变体包膜蛋白的细胞的融合情况。 用包膜蛋白表达载体 pElucEnv 转染 293CD4 细胞后，可以诱发细胞间发生膜融合并形成合胞体（见图 1-6） 。 35 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Mock WT RA RI RL RK RD (no syncytium) RN 36 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 RE (no syncytium) RQ Figure 1-6. Images of syncytia formation from representative R-substitution mutants at 24h post-transfection. The nuclei were stained with Hoechst and the black arrowheads indicate syncytium, which has multi-nuclei within a single cell. Images were acquired by a fluorescent microscope under 20 objective lens. 我们引入融合指数 (Fusion index) 来衡量细胞融合的程度（融合指数= 2x+y，其中 x 是合胞体内有 5 个以上细胞核的合胞体数量，y 是合胞体内细胞核 数量小于 5 的合胞体） ，融合指数既能反映合胞体的数量，也能反映合胞体的大 小。转染 24 小时后，各突变体相对于野生型包膜蛋白转染的细胞融合指数见图 1.7，WT 和 RK 的融合指数相似，而 RA、RI、RL、RN、RQ 等突变体融合指数 则出现 30%70%的降低，RD、RE 的融合指数则与 Mock 相似，几乎看不到有 合胞体出现。 37 HIV-1 gp41 蛋白跨膜区氨基酸序列对包膜蛋白功能的影响 Figure 1-7. The relative fusion activity of Arg-substitution mutants measured by syncytia formation assay. 293CD4 cells were transfected with different mutants or WT, as well as Env