CD146在VEGF诱导的血管生成中的作用

分类号分类号 密级密级 UDC 编号编号 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 博士学位论文博士学位论文 CD146 在在 VEGF 诱导的血管生成中的作用诱导的血管生成中的作用 庄洁庄洁 指指 导导 教教 师师 阎阎 锡锡 蕴蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 申请学位级别申请学位级别 博士博士 学科专业名称学科专业名称 细胞生物学细胞生物学 论文提交日期论文提交日期 2010 年年 5 月月 论文答辩日期论文答辩日期 2010 年年 5 月月 10 日日 培培 养养 单单 位位 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位授予单位学位授予单位 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 答辩委员会主席答辩委员会主席 王恒王恒 庄洁博士学位论文 2010 摘要 摘 要 摘 要 肿瘤血管生成是肿瘤发展和转移的重要步骤, 以肿瘤血管生成为靶标的治疗性药物受到越来越多的关注， 目前抗肿瘤血管生成治疗的热点仍然是发现新的靶分子。2003年，我们实验室首次报道细胞粘附分子CD146是肿瘤新生血管标志分子，可能参与肿瘤血管生成。随后的系列研究表明：肿瘤微环境（如肝癌细胞条件培养上清）能够诱导CD146二聚化， 进而引发p38/IKK/NF-B信号通路活化， 上调IL-8、 ICAM-1和MMP-9等促血管生成因子的表达，进而促进血管生成。然而，无论是抗CD146单克隆抗体AA98，还是突变AA98的抗原表位（即点突变AA98识别所必需的半胱氨酸C452，C452是CD146二聚化的分子基础）都能够抑制肿瘤细胞条件培养上清所诱导的CD146二聚化， p38/IKK/NF-B信号通路的活化及肿瘤血管生成。 这些结果都表明CD146二聚化可能是其介导胞外信号传导的必要条件，CD146可能以膜受体形式参与信号传导和肿瘤血管生成。然而，我们并不知道是肿瘤细胞条件培养上清中的何种成分诱导CD146二聚化及下游信号传导。本论文的内容之一是探索CD146可能的功能性配体并研究其作用机制，这对于更深入地阐明CD146在肿瘤血管生成中的作用机制以及研发以CD146为靶点的肿瘤血管抑制剂具有十分重要的意义。 本论文发现肿瘤分泌物中重要的促血管生成因子VEGF能够促进CD146二聚化，进而激活NF-B信号通路，促进血管生成。而破坏CD146二聚化所必需的分子基础（即点突变C452），可以明显的抑制VEGF诱导的NF-B信号通路活化以及人脐静脉内皮细胞(HUVECs)形成血管样结构，这些数据表明CD146二聚化介导了VEGF诱导的信号传导及血管生成，CD146可能是VEGFR的共受体，对于VEGF诱导的下游信号传导起到重要的作用。进一步探索VEGF促进CD146二聚化的作用机制，我们发现VEGF是通过激活NADPH氧化酶4（内皮细胞活性氧的主要来源)，促进细胞产生活性氧， 进而促进CD146二聚化的。 然而， 无论是抑制NADPH氧化酶的活性，或是抑制NADPH氧化酶亚基Rac1的活性， 还是用siRNA抑制内源的NADPH氧化酶4表达，都可以明显阻断VEGF引发的CD146二聚化。这些结果表明NADPH氧化酶4在介导CD146二聚化过程中起到了重要作用。因此，本研究首次揭示了CD146二聚化在VEGF诱导血管生成中的作用，提示了CD146作为VEGFR共受体的可能性，并 1CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 且指出了NADPH氧化酶4在CD146二聚化中的重要作用，对于寻找抗肿瘤血管生成治疗新靶标提供了新的思路。 本论文的第二部分工作是在建立可溶性CD146检测方法时，意外地发现磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性，并在此基础上拓展了磁性纳米颗粒的应用范围。早前的研究表明自身免疫病，如慢性肾衰、血管炎等患者血清中可溶性CD146过表达，可溶性CD146可能是某些疾病发生发展的标志分子，因此建立检测可溶性CD146的方法，在疾病的早期诊断或预后监测中具有重要的意义。我们在利用磁性纳米颗粒分离富集血清中可溶性CD146时，发现磁性纳米颗粒具有过氧化物酶(HRP)的催化活性，能够与HRP的不同底物反应产生不同的颜色；此外，与HRP相同，磁性纳米颗粒的催化活性也依赖于pH、温度和过氧化氢浓度，并且具有相同的催化机理，其所催化的反应具有专一、高效、快速等优点。这一发现的意义在于，发现磁性纳米颗粒可以作为HRP的模拟酶，拓展了磁性纳米的颗粒在环境检测，纳米医学等领域的应用。 基于磁性纳米颗粒具有过氧化物酶活性， 我们将其应用于不同领域： (1) 在环境监测领域：利用磁性纳米颗粒测定酸雨中过氧化氢含量，该方法与利用生物酶检测相比，具有成本低，稳定性好及可以反复回收利用等优点，对于优化环境监测方法具有重要意义；(2) 在免疫检测领域，由于磁性纳米颗粒的这种催化特性使其在免疫检测过程中容易导致高背景而降低检测灵敏度，我们通过封闭磁性纳米颗粒的这种催化特性建立了一种免疫检测方法， 该方法实现了对于抗原的高灵敏度检测，检测灵敏度与传统的双抗夹心ELISA相比提高了五倍，检测时间缩短了三倍。通过切换不同检测探针，该方法可以实现对肿瘤标记物，病毒和生物毒素等多种样品的检测，对于疾病的诊断治疗以及生物安全都有重要的意义；(3) 在生物医学领域体内诊断方面，我们利用磁性纳米颗粒的过氧化物酶活性，建立了一种体内示踪磁性纳米颗粒的新方法，该方法无需对磁性纳米颗粒进行预标记，即可以很好的评价其在体内的分布及代谢情况，该方法的建立对于了解磁性纳米颗粒的生物安全性具有重要意义。 关键词：CD146二聚化、肿瘤血管生成、VEGF、活性氧、NADPH氧化酶4、磁性纳米颗粒、模拟酶、环境监测、免疫检测、无标记示踪 2庄洁博士学位论文 2010 摘要 Abstract Jie Zhuang (Cell Biology) Directed by Xiyun Yan Tumor angiogenesis is an essential process for cancer development and metastasis, so the developing of new drugs for anti-tumor angiogenesis therapy is drawing more and more attentions. Currently, it is important to identify and evaluate new targets for anti-angiogenic therapy. Our previous studies indicated that CD146 might be involved in blood vessel formation. Further studies showed that: human hepatocarcinoma cells SMMC 7721-conditional medium (SMMC 7721-CM) promoted CD146 dimerization, activated p38/IKK/NF-B signaling cascade and up-regulated the expression of NF-B downstream pro-angiogenic genes, notably IL-8, ICAM-1 and MMP9. Anti-CD146 mAb AA98 or imparing the epitope of AA98 by mutating C452, which is indispensible for CD146 dimerizaton could concurrently inhibit CD146-mediated p38/IKK/NF-kB cascade and tumor angiogenesis. However the composition of conditional medium was complex, the potential ligand of CD146 has still not been identified. In present work, we found that VEGF could induce CD146 dimerization, activate NF-B signal transduction and promote angiogenesis. Imparing CD146 dimerization significantly inhibited VEGF-stimulated activation of NF-B and tube formation. These results indicated that CD146 dimerization played a crucial role in VEGF induced signal transduction and angiogenesis. These correlations indicated that CD146 may act as a co-receptor of VEGFR. To further investigate the mechanism of VEGF indeced CD146 dimerization, we discovered that: VEGF could activate NADPH oxdiase 4 (NOX4) to generate reactive oxygen specises (ROS) and further induce CD146 dimerization. However, inhibition of NADPH oxidase activity, mutantion of Rac1 (the subunit of NADPH oxidase) or silencing endogenous NADPH oxidase 4 expression inhibited CD146 dimerization enhanced by VEGF. These studies show for the first time that VEGF induced CD146 dimerization is mediated via a NOX4-dependent pathway and provide novel insights into the significant role of NOX in redox-regulation of the dimerization of cell membrane molecules. 3CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 When establishing a system for soluble CD146 detection, we discovered the intrinsic peroxidase activity of magnetic nanoparticles and further boarded the applications of magnetic nanoparticles. Previous studies indicated that the increased soluble CD146 level was correlated with some autoimmune diseases such as vasculitis and chronic renal failure. During the establishment of soluble CD146 detection system by means of magnetic enrichment, we made the surprising discovery that magnetic nanoparicles possess intrinisic peroxidase activity and the catalytic activity depends on pH, temperature and H2O2 concentration. Our findings open up a wide range of new potential applications of magnetic nanoparticles in environmental chemistry, biotechnology and medicine. Based on this finding, we have developed: (1) A novel method for determining the H2O2 in acid rain. Compared to HRP, the magnetic nanoparticles are reusable and economical and these characteristics make the particles a board range of applications in determining H2O2; (2) A novel silica coating magnetic nanoparticles-based biosensor. This peroxidase acitivity of MNPs could potentially cause a high background in immunoassays and limit detection sensitivity. In this system, we coated MNPs with silica to shield their intrinsic peroxidase activity and established a magnetic nanoparticles-based biosensor. The results showed that the sensitivity of the magnetic nanoparticles based biosensor was five times greater than that of conventional colorimetric sandwich ELISA. Once the antibody used for detection was coated on the plates or MNPs, our system was three times more rapid than colorimetric sandwich ELISA. This rapid and sensitive detection system provides promising new potential for many kinds of antigen detection; (3) A novel method for unlabeled tracking the biodistribution of magnetic nanoparticles with peroxidase activity in vivo. This method provides novel insights into evaluation the biocompatibility of magnetic nanoparticles. Key words: CD146 dimerization, tumor angiogenesis, VEGF, reactive oxygen species, NADPH oxidase 4, magnetic nanoparticles, enzyme mimics, environment monitor, immunoassay, unlabeled tracing 4 庄洁博士学位论文 2010 目录 目目 录录 中文摘要中文摘要 1 英文摘要英文摘要 3 目录目录 5 文献综述文献综述 第一部分第一部分 CD146与与VEGF诱导血管生成机制诱导血管生成机制7 1 肿瘤血管生成机制 7 2 VEGF信号通路与肿瘤血管生成 10 3 NADPH氧化酶与血管生成 14 4 CD146分子与肿瘤转移与血管生成中的作用 18 第二部分第二部分 纳米材料的生物学应用纳米材料的生物学应用 23 1 磁性纳米颗粒的生物学应用 23 研究内容研究内容 第一部分第一部分 CD146在在VEGF诱导的血管生成中的作用诱导的血管生成中的作用28 概述 28 1 材料与方法 29 2 实验结果 35 3 小结与讨论 45 第二部分第二部分 磁性纳米颗粒模拟酶的发现与应用磁性纳米颗粒模拟酶的发现与应用 48 第一章第一章 磁性纳米颗粒模拟酶在环境监测及免疫检测中的应用磁性纳米颗粒模拟酶在环境监测及免疫检测中的应用 概述 48 1 材料与方法 48 2 实验结果 49 3 小结与讨论 57 第二章第二章 基于磁性纳米颗粒的生物传感器基于磁性纳米颗粒的生物传感器 概述 58 1 材料与方法 58 5CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 2 实验结果 60 3 小结与讨论 65 第三章第三章 磁性纳米颗粒体内无标记示踪研究磁性纳米颗粒体内无标记示踪研究 概述 66 1 材料与方法 66 2 实验结果 67 3 小结与讨论 75 参考文献参考文献 77 发表文章发表文章 83 致谢致谢 85 6 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 文献综述 文献综述 第一部分第一部分 CD146与与VEGF诱导血管生成机制诱导血管生成机制 1. 肿瘤血管生成机制 1. 肿瘤血管生成机制 自从Judah Folkman教授于1971年提出肿瘤生长浸润依赖于肿瘤组织内血管形成的观点之后1，肿瘤血管生成逐渐成为近几十年肿瘤研究领域的热点问题。靶向肿瘤血管生成的治疗性药物也越来越多的受到研究人员的关注，目前已有包括Avastin、Macugen、Endostatin 等多种抗肿瘤血管生成药物上市，此外，还有大量的针对不同靶标的抗肿瘤血管生成药物进入临床研究阶段。 1.1 肿瘤血管生成过程肿瘤血管生成过程 血管生成(angiogenesis)是指已存在的血管芽生(sprouting)和套叠式的微血管生长(intussusceptive microvascular growth)形成新的血管的过程。 其中芽式生长是指从原有的血管基础上芽式生长成毛细血管， 其内皮朝着产生血管生成因子的细胞， 在血管芽的顶端生长延长，包括细胞外基质的降解、内皮细胞趋化性迁移和增生、内皮板层的形成和功能成熟等过程； 套叠式生长是指内皮细胞增殖致使管腔增大， 通过产生贯穿毛细血管的间隙组织柱而最终导致血管腔裂开形成新生血管。 形成原始血管的机制除了血管生成外，还有血管发生(vasculogenesis)，其主要是指胚胎细胞分化形成血管网络2。生理性的血管生成只存在于生殖系统和伤口愈合的过程， 是短暂并且受到严格控制的， 失控的血管生成则导致多种疾病如癌症、糖尿病视网膜病、风湿性关节炎等。 作为病理性的肿瘤血管生成过程，被认为有以下几个阶段：(1)肿瘤细胞和浸润在肿瘤组织中的免疫细胞分泌大量的促血管生成因子， 打破了维持血管正常代谢的刺激因子和抑制因子之间的平衡， 促血管生成因子的释放和活性升高， 进而激活肿瘤组织附近的血管内皮细胞， 促进内皮细胞分裂和增殖， 并通过趋化作用诱导内皮细胞向肿瘤组织迁移3。(2)在肿瘤细胞和活化的内皮细胞以及肿瘤组织周围的间质细胞和免疫细胞的共同作用下，血管基底膜中的金属蛋白酶、丝氨酸蛋白水解酶、尿激酶型血纤溶酶原激活剂等多种水解酶类水平上调，基底膜与细胞外基质被降解4。(3)受到促血管生成因子刺激的内皮细胞，表达大量的粘附分子，如整合素v3，同时激发钙信号调节途径，促进细胞增殖和迁移，从而导致内皮细胞侵入周围组织的基质层5。(4)在内皮细胞上，各种 7CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 促血管内皮生长因子的受体分子如Flt-1，Flk-1，Tie-1和Tie-2等表达量也相应增高。这些受体与生长因子结合，促使内皮细胞组装形成管腔和血管网6, 7。(5)在angiopoietin-1和angiopoietin-2 等因子作用下，通过促进或松弛内皮细胞与其周围支持细胞的相互作用，完成血管重塑8。图1-1-1概括了血管生成的整个过程9。 肿瘤血管与处于严格控制中的正常血管不同， 其具有许多病理性的形态特征： 首先，血管粗细不均、膨胀、粗糙以及有终端。肿瘤血管不像正常血管一样分为动脉、静脉以及毛细血管，而是高度混乱无序、血管扭曲。其次，肿瘤细胞和内皮细胞相间排列在肿瘤血管腔内表面，形成“马赛克血管”；内皮不完整、基底膜不连续甚至缺失、造成血管通透性高10。而且，肿瘤血管缺乏功能性的淋巴系统，造成新生毛细血管间质高压，不仅进一步抑制淋巴管形成11，还干扰抗肿瘤药物的运送12，同时促进肿瘤细胞的扩散和转移13。 1.2 肿瘤血管生成的调节机制肿瘤血管生成的调节机制 目前普遍接受的血管生成的调节机制是由Hanahan博士和Folkman教授于1996年提出的“血管生成开关(angiogenic switch)”假说， 该假说认为内皮细胞增殖形成新血管的过程中存在一个“开关”，这个“开关”的状态由促进血管生成因子(pro-angiogenic factors)和抑制血管生成因子(anti-angiogenic factors)的水平所决定，当正负调节因子处于平衡时“关闭”，平衡被打破而倾向于促血管生成方向时“打开” 3, 14。此外，“血管生成开关”还受到多种信号的触发，包括代谢压力(如低pH，缺氧，低血糖)、机械压力(如细胞增殖产生的压力)、 免疫/炎症反应(如免疫/炎症细胞浸润)和遗传突变(控制血管生成调节因子表达的原癌基因的激活和抑癌基因缺失)15，其中仍有大量细节未被揭示。 生理性的血管生成过程受到严格的调控，“血管生成开关”准确的开启和关闭，调节着血管生成的整个过程；而肿瘤血管生成却无法受到组织水平和细胞水平的准确调节，“血管生成开关”在肿瘤微环境中存在的大量促血管生成因子的作用下长期处于“开启”状态，并且完全失控16。 肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程， 包括选择性降解血管基底膜和周围的细胞外间质、内皮细胞分裂、游走和增殖，这些过程受血管生成诱导剂和抑制剂调节。影响血管生成的因子包括促血管生成因子和抑制血管生成因子， 对这些因子的鉴定是理解血管生成机制的基础，有助于对该过程的人为调控并最终发展出可行的肿瘤治疗策略。表8 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 1-1-1列出了现在已经鉴定的促进血管生成因子与抑制血管生成因子。 图1-1-1 肿瘤血管生成模式图（图引自参考文献9，并得到许可）。在原有血管的基础上(A)，促血管生成因子激活血管内皮细胞形成tip cell (B)，内皮细胞进一步发生增殖和迁移，侵入周围组织(C)，进而形成血管腔和血管网(D)，最后在周围支持细胞的作用下，完成血管重塑(E)。 表1-1-1 促进血管生成因子与抑制血管生成因子（引自血管生成基金会网站，） Pro-angiogenic Factors Anti-angiogenic Factors Angiogenin Angioarrestin Angiopoietin-1 Angiostatin (plasminogen fragment) Del-1 Antiangiogenic antithrombin III Fibroblast growth factors: acidic (aFGF) and basic (bFGF) Cartilage-derived inhibitor (CDI) Follistatin CD59 complement fragment 9CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) Endostatin (collagen XVIII fragment) Hepatocyte growth factor (HGF) /scatter factor (SF) Fibronectin fragment Interleukin-8 (IL-8) Gro-beta Leptin Heparinases Midkine Heparin hexasaccharide fragment Placental growth factor Human chorionic gonadotropin (hCG) Platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) Interferon alpha/beta/gamma Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) Interferon inducible protein (IP-10) Pleiotrophin (PTN) Interleukin-12 Progranulin Kringle 5 (plasminogen fragment) Proliferin Metalloproteinase inhibitors (TIMPs) Transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) 2-Methoxyestradiol Transforming growth factor-beta (TGF-beta) Placental ribonuclease inhibitor Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) Plasminogen activator inhibitor Vascular endothelial growth factor (VEGF) Platelet factor-4 (PF4) Prolactin 16kD fragment Proliferin-related protein (PRP) Retinoids Tetrahydrocortisol-S Thrombospondin-1 (TSP-1) Transforming growth factor-beta (TGF- beta) Vasculostatin Vasostatin (calreticulin fragment) 2. VEGF信号通路与肿瘤血管生成信号通路与肿瘤血管生成 2.1 VEGF的结构与功能的结构与功能 在促进血管生成因子中，VEGF是最主要的活性因子，研究也最为深入。VEGF是由二硫键共价连接的同源二聚体，在哺乳动物中分为VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和PLGF17。其中VEGF-A在血管生成调节中起着重要的作用。人VEGF-A由于外显子的选择性剪接，至少产生6种亚型：即VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189和VEGF-A206(其中VEGF-A165是主要的形式)18。图1-2-1是VEGF-A mRNA不同剪切形式。其转录受多种因素调控，包括突变的p53、原癌基因ras、缺氧环境和HIF、PDGF、EGF、TNF等生长因子和细胞因子。 10 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 VEGF-A可由血管平滑肌细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞等所分泌。正常生理性血管生长过程中， 如胚胎形成、 骨骼生长， VEGF具有重要的促进作用； 病理情况下可出现VEGF的异常表达。在缺血性疾病中，VEGF-A基因的表达受到氧化压力的调控，其5和3端的非翻译区含有缺氧效应元件，缺氧可以导致VEGF mRNA快速和持续地增加。缺氧可刺激VEGF表达上调，通过对内皮细胞强烈的促有丝分裂作用，促进新生血管形成，改善组织供血19。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进其增殖和迁移，诱导血管形成，有利于肿瘤转移。 图1-2-1 VEGF-A mRNA不同剪切形式（引自参考文献18，并得到许可）。VEGF-A基因由8个外显子编码，其mRNA的选择性剪切形成了不同的亚型，其中VEGF-A165是主要形式。 2.2 VEGF受体的结构与功能受体的结构与功能 VEGF的生物活性是与其受体结合后发挥作用的。目前VEGF的受体已经发现4种：VEGFR-1(fms-like tyrosine kinase, Flt-1)、VEGFR-2(kinase insert domain containing receptor/fetal liver kinase, KDR/Flk-1)、VEGFR-3及Soker等人发现的神经纤毛因子-1(Nrp-1)和神经纤毛因子-2(Nrp-1)20。图1-2-2列出了现在已经发现的VEGF及其受体的家族成员。其中VEGFR-1主要分布在血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞，可与VEGF-A121、VEGF-A165、VEGF-B、PLGF-1和PLGF-2结合，主要与造血干细胞的生长调节有关。VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，可以与VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-C、VEGF-D、HIV-1结合。与VEGFR-2相比，VEGFR-1与VEGF的亲和力高10倍，但调节内皮细胞的活性却低很多，可能是对VEGFR-2活性具有负向调节作用。VEGFR-3主要表达在淋巴管内皮细胞中，能与VEGF-C和VEGF-D结合，调控淋巴内皮细胞的生长。 VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和激 11CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 活VEGFR-2来实现。VEGFR-2是一种III型的跨膜蛋白激酶，由Terman等于1991 年从人脐静脉内皮细胞cDNA文库中克隆21。人VEGFR-2基因编码1,356个氨基酸。VEGFR-2首先被翻译为约有150 kDa且没有明显糖基化的蛋白质，然后经过一系列的糖基化处理，成熟时约有230 kDa，表达在细胞膜上。VEGF-A结合到VEGFR-2胞外的第2个与第3个Ig like domain22，然后引起受体的二聚化和自身交互磷酸化，激活下游的信号通路。VEGFR-2在血管的形成中具有重要的作用，基因型为VEGFR-2-/-的小鼠会由于血岛、血管内皮细胞和造血细胞的生长障碍在胚胎期的E8.59.5死亡23。 图1-2-2 VEGF家族生长因子及生长因子受体（引自参考文献20，并得到许可）。VEGF受体包括三种酪氨酸激酶受体(VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3)，两种共受体(Nrp-1, Nrp-2)以及可以和VEGF结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖组成。 2.3 VEGFR-2介导的信号通路介导的信号通路 2.3.1 调控内皮细胞的增殖调控内皮细胞的增殖 VEGF-A是很多内皮细胞的促细胞分裂原， 可以通过与细胞膜上的VEGFR-2结合激活 下 游 信 号 通 路 ， 调 控 内 皮 细 胞 的 增 殖 。 VEGFR-2 主 要 是 通 过PLC-PKC-Raf-MEK-MAPK信号通路， 促进内皮细胞的增殖24。 VEGFR-2的C端Tyr117512 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 磷酸化后可与PLC-结合，使其磷酸化25。PLC-水解4, 5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate， PIP2)生成二酰甘油(adiacylglycerol， DAG)和1, 4, 5- 三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-trisphosphate，IP3)。IP3可以增加细胞内的钙离子浓度，而DAG可以激活PKC。在小鼠中，突变Flk-1的Tyr1173，胚胎会由于内皮细胞和造血细胞生成障碍在E8.59.5死亡， 说明受体Flk-1的Tyr1173在调控血管新生中有重要作用26。 2.3.2 调控内皮细胞的迁移调控内皮细胞的迁移 内皮细胞的迁移是肿瘤血管生成的重要步骤，对于肿瘤的发展和转移起到重要作用。VEGFR-2介导的很多信号通路与此相关：(1)衔接蛋白Shb的SH2区域(Src homology domain-2, SH2)与VEGFR-2的Tyr1175结合，介导VEGF信号通路的传递，促进内皮细胞的迁移。用siRNA抑制Shb的表达，可以阻止VEGF介导的磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)的激活、细胞骨架重排和细胞迁移。Shb连接蛋白还可以与其他的蛋白质结合，如粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)，使其Tyr576磷酸化，FAK对于细胞的粘附和迁移起着重要作用27。(2) VEGFR-2的Tyr951的磷酸化可以与T细胞特异性衔接分子(T-cell-specific adapter，TSAd)相结合。激活的TSAd和Src形成复合物，调节细胞的迁移。对VEGFR-2的Tyr951定点突变或用siRNA抑制TSAd的表达，可以抑制VEGF介导的细胞骨架的重组和迁移，但不能抑制其有丝分裂28。(3) VEGFR-2的Tyr1214的磷酸化与衔接蛋白Nck的SH2区域结合，Nck与Src激酶家族的Fyn结合，可使 p21 激 活 性 激 酶 -2(p21-activated protein kinase-2 ， PAK-2) 磷 酸 化 ， 随 后 激 活Cdc42-p38-MAPK信号通路，促进内皮细胞肌动蛋白的重排29, 30。 2.3.3 调控内皮细胞的生存调控内皮细胞的生存 VEGF-A可以调节人脐静脉内皮细胞的生存。VEGF通过活化PI3K，催化PIP2生成PIP3，随后磷酸化蛋白激酶(protein kinase B，PKB/Akt)，使其激活。Akt直接磷酸化两种促细胞凋亡蛋白：Bcl-2相关凋亡启动子(Bcl-2 associated death promoter, BAD)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase 9)，抑制它们促细胞凋亡的活性31。 2.3.4 调控内皮细胞的通透性调控内皮细胞的通透性 VEGF-A最初发现时被认为是一种血管通透性因子。VEGF信号可以促进内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)生成NO，引起血管通透性的变化，而血管通透性的提高有利于内皮细胞的迁移，促进血管生成。eNOS的活化可以通过 13CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 PLC-引起的钙内流或Akt/PKB介导的eNOS上Ser1179磷酸化所引起。VEGFR-2的Tyr801残基磷酸化对于VEGF刺激引起NO的释放是必需的32。 VEGFR-2介导的信号还可以增加eNOS和其分子伴侣热休克蛋白90(heat-shock protein 90 , Hsp90)的结合。VEGFR-2激活后，可促使c-Src催化Hsp90的Y300的磷酸化，增强Hsp90与eNOS的结合，促使内皮细胞释放NO33。Becker等发现，Nrp-1参与VEGFR-2调控细胞的通透性改变，VEGF-A介导通透性的改变可能需要VEGFR-2和Nrp-1的协同作用34。 图1-2-3 VEGFR-2介导的信号通路（引自参考文献18，并得到许可）。VEGF与其受体结合，引起受体二聚化及自身磷酸化，进而激活下游信号通路，促进细胞的增殖、迁移、生存及通透性的提高。 3. NADPH氧化酶与血管生成氧化酶与血管生成 14 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 3.1 NADPH氧化酶家族氧化酶家族 活性氧包括超氧自由基、 过氧化氢和羟基自由基等， 最早被认为是耗氧代谢的副产物，但越来越多的研究表明活性氧是由特定的酶催化产生的，在信号传导、激素合成以及免疫防御中都起到了重要的作用。细胞内活性氧的产生有很多途径，包括线粒体、黄嘌呤氧化酶以及NADPH氧化酶。近十几年来对于NADPH氧化酶的研究越来越深入，现在已经鉴定的NADPH氧化酶（NADPH oxidase，简称NOX）家族包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5以及Duox1和Duox235。NOX大致可以分为两个大的结构域：N端的疏水跨膜区和C端的黄素蛋白结合区36。NOX为六次跨膜蛋白，一些保守的区段可能与NADPH、 FAD的结合有关。 与NOX1-4不同， NOX5的N末端有钙结合区， 能使NOX5直接对钙离子起反应，同时NOX5在胞质侧的N末端序列为一段富含脯氨酸的尾巴，可以与胞内调节蛋白相互作用，从而催化反应37(图1-3-1)。 图 1-3-1 NADPH氧化酶家族的组成及结构（引自参考文献 37，并得到许可） 。NADPH氧化酶家族成员结构相似，但其活化的方式不同。A: NOX1 激活需要p22phox, NOXA1, NOXO1 和Rac；B: NOX2激活需要p22phox, p47phox, p67phox 和Rac；C: NOX3 的激活需要p22phox和NOXO1；D: NOX4 激活需要p22phox；E和F: NOX5, DUOX1 和DUOX2 的激活需要Ca2+。 NADPH氧化酶家族中研究最为深入的是NOX2(gp91phox)， 其最早在吞噬细胞中发现， 参与吞噬细胞防御外源侵入的病原体。 NOX2与p22phox、 p47phox、 p67phox、 p40phox和Rac1或是Rac2形成复合体。p9lphox和p22phox亚基位于膜上，其中p22phox的C末端有一富含脯氨酸的尾巴，可以与胞浆中的另外几种亚基结合，形成具有催化活性的 15CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 NADPH氧化酶复合体，催化分子氧生成超氧自由基38。产生的超氧自由基可以进一步生成其它形式的自由基，如过氧化氢或羟氧自由基，杀死细菌(图1-3-2)。 NOX1在正常组织主要表达在结肠，血管平滑肌中，在子宫及前列腺中也有微弱的表达39。NOX3在内耳的特定部位高表达，少量在一些胚胎组织，如肾、肝、肺、脾等中表达40。NOX4在肾脏组织中有大量的表达41。最近还有研究发现，NOX4在中枢神经系统的神经元中也有一定表达42。另外，所有胚胎组织及一部分成人组织，如胰腺、胎盘、卵巢、睾丸及骨骼肌中都能检测到NOX4的表达，最近有很多文献报道NOX4在内皮细胞中高表达43。NOX5则在所有胚胎组织中都有表达，在成人脾及睾丸中也有少量存在，在卵巢、胎盘、胰腺中微弱表达44。gp91phox主要表达在外周血吞噬细胞、肺、胰腺及胎盘44。由此可见，NOX家族蛋白表达具有组织特异性，不同成员都可以生成超氧自由基，但是它们的功能可能因组织特异性而有所不同。 图1-3-2 吞噬细胞杀死细菌的机理（图引自参考文献38，并得到许可）。NADPH氧化酶能够产生超氧自由基，并进一步生成过氧化氢和羟氧基自由基等，可以杀死细菌。 3.2 NADPH氧化酶在血管生成过程中的作用氧化酶在血管生成过程中的作用 NADPH氧化酶参与炎症发生、宿主防御与动脉粥样硬化、糖尿病血管病变和癌症相关。越来越多的研究表明促血管生成因子，如VEGF和AngII都能激活NADPH氧化酶产生活性氧（Reactive oxygen species, 简称ROS），并介导氧化还原相关信号通路，进而促进血管生成，揭示了NADPH氧化酶在血管生存过程中的作用45。在NADPH氧化酶家族中NOX1， NOX2和NOX4与血管生成密切相关。 但在不同类型的细胞中表达有所16 庄洁博士学位论文 2010 文献综述 不同，在内皮细胞中主要表达NOX2和NOX4，而在平滑肌细胞中主要表达NOX1和NOX4。另外，不同亚型的NOX在同一细胞中的表达水平也有所不同，比如在平滑肌细胞中NOX4的表达是NOX1的40倍46；在内皮细胞中NOX4的表达也远高于NOX247。 不同亚型的NOX在细胞中表达水平的不同，也预示着其不同的生物学功能。研究发现，AngII可以上调血管平滑肌细胞中NOX1的表达48，而用siRNA抑制内源NOX1的表达会显著抑制AngII引起的超氧自由基的产生及下游信号通路的活化49。与血管平滑肌细胞不同，在内皮细胞中AngII诱导产生的活性氧是由NOX2介导的50。同时，NOX2在VEGF介导的血管生成，内皮细胞的增殖和迁移中都起到了重要作用51。体内实验表明，VEGF不能诱导基因型为NOX2-/-小鼠的血管新生52。此外，在视网膜病变以及后肢缺血的小鼠模型中都观察到NOX2表达的上调53, 54。2005年，Vallet证实在脑部缺血小鼠的毛细血管上NOX4的表达是升高的42。2007年，Datla报道了过表达NOX4会增强内皮细胞形成血管样结构并促进内皮细胞的迁移，这些实验都暗示着NOX4在血管生成中的重要作用55。与NADPH氧化酶家族中其它成员不同，NOX4介导产生活性氧并不需要胞质中其它亚基，如p47phox、p67phox、Noxo1以及Noxa1的存在。同时，用siRNA抑制内源Rac1的表达或过表达Rac1的抑制型突变受体(Rac1 N17)都不会影响组成型NOX4的活性。但是，NOX4所介导的AngII诱导产生的活性氧是依赖于Rac的激活56 (图1-3-3)。 17CD146 在 VEGF 诱导的血管生成中的作用 图1-3-3 NOX1、NOX2和NOX4在血管生成中的作用（引自参考文献56，并得到许可）。 4. CD146分子在肿瘤转移和血管生成中的作用分子在肿瘤转移和血管生成中的作用 4.1 CD146的结构的结构 CD146又称为MCAM(melanoma cell adhesion molecule)，是位于人第11号染色体长臂的单拷贝基因，是型膜蛋白，由646个氨基酸残基组成，属于免疫球蛋白超家族成员(IgSF)，与Ig超家族内许多细胞表面粘附分子高度同源，包括HEMCAM、B-CAM、ALCAM和KG-CAM57, 58。CD146是单次跨膜蛋白，其胞外区由V-V-C-C-C的Ig-like domain组成59；其胞内区较短，只有63个氨基酸，但是拥有多个可能的蛋白激酶识别位点及与其它蛋白相互作用的Motif，暗示CD146可能参与信号传导过程60。与大多数的细胞粘附分子一样，CD146除了膜结合形式，还存在可溶形式61。 4.2 CD146的分布的分布 CD146最早是由德国Johnson实验室在黑色素瘤细胞中发现，在大多数的黑色素瘤组织中均有分布62。1998年，Shih Ie-Ming等利用CD146的单抗